潘淑勇

(魯南制藥集團股份有限公司，山東臨沂276006)

臨床上鹽酸柔紅霉素是治療急性非淋巴細胞性白血病的一線藥物，對兒童白血病也有良好的緩解作用，同時也是去甲氧柔紅霉素、阿霉素和表柔比星的合成起始原料。隨著人類癌癥發(fā)病率的逐年上升，鹽酸柔紅霉素的市場容量也在快速提高。2009年柔紅霉素、阿霉素和表柔比星均被收錄到《國家基本醫(yī)療保險藥品目錄》。然而較低的發(fā)酵效價造成了昂貴的生產(chǎn)成本，致使售價居高不下。降低生產(chǎn)成本，減少患者的負擔(dān)是我們當(dāng)前迫切需要解決的問題。

1978年王元和方開泰提出了均勻設(shè)計，該設(shè)計考慮如何將設(shè)計點均勻地散布在試驗范圍內(nèi)，使得能用較少的試驗點獲得最多的信息。多年來，均勻設(shè)計在國內(nèi)得到了廣泛應(yīng)用，并獲得不少好的成果。本次研究將采用均勻設(shè)計的方法，優(yōu)化柔紅霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，以期進一步提高發(fā)酵效價，降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 親本:Dau G22:發(fā)酵效價為2 198 mg·L－1。保存于魯南制藥科研部。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子搖瓶培養(yǎng)基:玉米淀粉4.0%，葡萄糖1.0%，麩皮1.0%，麩質(zhì)粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO40.1%，CaCO30.4%，pH自然。裝60 mL于500 mL搖瓶中，121℃滅菌30 min。

發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基:玉米淀粉7.0%，麩皮1.0%，麩質(zhì)粉0.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%;pH自然。裝30 mL于250 mL搖瓶中，121℃滅菌30 min。

1.1.3 色譜條件 高壓液相色譜Agilent C18色譜柱(53 mm ×7 mm，3 μm);流動相:15 mmol·L－1的磷酸二氫鉀－乙腈(1∶1);柱溫25℃;流速1.0 mL·min－1;檢測波長:254 nm。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法 將Dau G22的工作細胞庫接入種子搖瓶，接種量1 mL，于29℃搖床中220 rpm培養(yǎng)42 h。再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基中，接種量10%，每個菌株接種3個搖瓶，于28℃搖床中220 rpm培養(yǎng)168 h。高壓液相測定效價。

1.2.2 實驗設(shè)計 發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基設(shè)計采用均勻設(shè)計表U*10(108)，S=3，D=0.168 1，見表1［1］。

表1 ，S=3

表1 ，S=3

1 5 6 1 1 5 7 2 10 3 3 3 4 10 2 4 4 9 6 5 5 3 2 6 6 8 9 7 7 2 5 8 8 7 1 9 9 1 8 10 10 6 4

將發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基的玉米淀粉、麩皮、麩質(zhì)粉3種成分作為3個因素進行10水平的實驗，各因素水平分布見表2。

表2 各因素水平分布

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 計算平均效價，數(shù)據(jù)分析使用SAS 9.0軟件，做二次曲面回歸，得出最佳配方。

1.2.4 驗證 將分析得到的配方用搖瓶發(fā)酵進行驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶發(fā)酵實驗結(jié)果 實驗結(jié)果見表3。

2.2 數(shù)據(jù)分析 使用SAS軟件做二次曲面回歸得到回歸方程:Y=－6 396.5+1 977.1［玉米淀粉］+5 559.6［麩皮］－8 560.7［麩質(zhì)粉］+6.3［玉米淀粉］2－1 670.6［玉米淀粉］×［麩皮］－217.7［玉米淀粉］×［麩質(zhì)粉］+10 355［麩皮］×［麩質(zhì)粉］

顯著性影響見表4。

表3 搖瓶發(fā)醇實驗結(jié)果

表4 3個因素的F值和P值

P值均 ＜0.5，因此3個因素對發(fā)酵效價均有顯著影響。

SAS預(yù)測當(dāng)［玉米淀粉］=12.4%，［麩皮］=1.1%，［麩質(zhì)粉］=1.5%時發(fā)酵效價達到最大為:2 606 mg·L－1

2.3 發(fā)酵效價的驗證 根據(jù)分析結(jié)果，使用如下培養(yǎng)基再次發(fā)酵驗證預(yù)測準(zhǔn)確性:玉米淀粉12.4%，麩皮1.1%，麩質(zhì)粉1.5%，KH2PO40.1%，(NH4)2SO41.0%，CaCO30.8%; pH自然。實驗方法同上所述。

驗證實驗結(jié)果見表5。

表5 優(yōu)化后培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵效價

驗證實驗最高發(fā)酵效價為2 703 mg·L－1，比原培養(yǎng)基發(fā)酵效價提高23%，SAS預(yù)測結(jié)果較為準(zhǔn)確。

3 小結(jié)

均勻設(shè)計是我國科學(xué)家自主發(fā)明的一種優(yōu)秀的設(shè)計方法，在我國的火箭等尖端科學(xué)研究中發(fā)揮了重要的作用，我們應(yīng)用均勻設(shè)計實現(xiàn)了柔紅霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的改良，為進一步降低生產(chǎn)成本，提高市場競爭力，降低患者負擔(dān)發(fā)揮了一定的作用。

［1］ 峁詩松，王靜龍，史定華.統(tǒng)計手冊［M］.北京:科學(xué)出版社，2003:751.