邵 敏，劉 寶，王錦權(quán)，陶曉根，周樹(shù)生，金 魁，張翠萍

（1.安徽省立醫(yī)院 ICU，安徽 合肥 230001；2.安徽省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230001）

膿毒癥患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè)的臨床意義

邵 敏1，劉 寶1，王錦權(quán)1，陶曉根1，周樹(shù)生1，金 魁1，張翠萍2

（1.安徽省立醫(yī)院 ICU，安徽 合肥 230001；2.安徽省立醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230001）

目的 探討膿毒癥患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）的水平與機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)的關(guān)系及其檢測(cè)的臨床意義。方法將膿毒癥患者40例按照疾病嚴(yán)重程度分為3組：膿毒癥組14例，嚴(yán)重膿毒癥組15例，膿毒癥休克組11例。所有入選的40例膿毒癥患者在入選當(dāng)天行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例和CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平。比較膿毒癥組、嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥休克組血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例變化和CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+水平變化。同時(shí)選取20例健康人為對(duì)照組。結(jié)果 健康對(duì)照組CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)率膿毒癥休克組最高，嚴(yán)重膿毒癥組次之，膿毒癥組最低，三組間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。膿毒癥組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.05）， CD8+較正常對(duì)照組差異不明顯（P＞0.05）。嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥休克患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），CD8+較正常對(duì)照組改變不明顯（P＞0.05）。結(jié)論 膿毒癥患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表達(dá)增加，可能導(dǎo)致CD3+、CD4+、CD4+/CD8+水平降低，免疫抑制加強(qiáng)。提示CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在膿毒癥的免疫發(fā)病機(jī)制中可能起著重要作用，對(duì)評(píng)估患者預(yù)后有臨床價(jià)值。

膿毒癥；細(xì)胞免疫；CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemicinf lammatoryresponsesyndrome，SIRS）。膿毒癥發(fā)病機(jī)制中，除病原微生物及其毒素直接損害組織細(xì)胞外，免疫功能紊亂對(duì)其發(fā)生發(fā)展起重要作用。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種負(fù)向免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，它可以通過(guò)許多途徑影響機(jī)體的免疫狀態(tài)[1]，抑制炎癥反應(yīng)。人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞根據(jù)CD25表達(dá)數(shù)量或熒光強(qiáng)度分為弱、中、強(qiáng)3個(gè)等級(jí)，目前認(rèn)為CD25強(qiáng)陽(yáng)性的CD4+T細(xì)胞（CD4+CD25high）能特異性代表人CD4+CD25+T細(xì)胞[2]。但目前有關(guān)膿毒癥患者CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）與CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+等細(xì)胞免疫指標(biāo)變化關(guān)系的臨床報(bào)道較少[3]。本文就這方面的問(wèn)題進(jìn)行了探討?，F(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月至2010年11月入住安徽省立醫(yī)院ICU的膿毒癥患者40例，疾病構(gòu)成包括：消化道穿孔破裂術(shù)后16例，膽囊壞死及重癥膽管炎9例，腸梗阻術(shù)后6例，重癥肺部感染9例。入選患者均符合2001年12月在美國(guó)華盛頓召開(kāi)的國(guó)際膿毒癥定義會(huì)議所制定的膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]，并根據(jù)其中的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將患者分為3組：膿毒癥14例，男8例，女6例，年齡（57.1±14.2）歲；嚴(yán)重膿毒癥15例，男9例，女6例，年齡（58.1±15.9）歲；膿毒性休克11例，男7例，女4例，年齡（59.4±11.7）歲。排除以下患者：患有自身免疫系統(tǒng)疾病、急性腦卒中、心肌梗塞、病毒性肝炎、HIV感染，入院前3月內(nèi)使用過(guò)激素或免疫抑制劑。選取20例正常人作為健康對(duì)照組。

1.2 監(jiān)測(cè)指標(biāo)

1.2.1 一般監(jiān)測(cè)指標(biāo)在連續(xù)性治療期間監(jiān)測(cè)記錄生命體征、動(dòng)脈血?dú)夂脱樗崴阶兓?，評(píng)估急性生理和慢性健康評(píng)分系統(tǒng)評(píng)分（APACHEII評(píng)分）[5]。1.2.2 試驗(yàn)指標(biāo)

1.2.2.1 試劑和儀器異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD25單抗，藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的CD4單抗和CD25同型陰性對(duì)照試劑以及CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PE-CYS試劑（均購(gòu)自美國(guó)Beckman-Coulter公司）。固定和改變細(xì)胞膜滲透性試劑盒（FIX&PERMCellPermeabilizationKit均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司）。流式細(xì)胞儀型號(hào)為美國(guó)Beckman-Coulter公司臨床應(yīng)用型（EPICS-XLIIMCL），熒光激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm，分析系統(tǒng)軟件為SystemⅡ系統(tǒng)。

1.2.2.2 標(biāo)本收集 符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者于入選當(dāng)天采肘靜脈血10 mL，4 h內(nèi)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行處理與檢測(cè)。另20例健康者作為對(duì)照組同期進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+

CD4+CD25+Treg細(xì)胞的標(biāo)記和分析方法參照文獻(xiàn)[6]：首先在試管中加抗凝全血25μL，后分別加入CD25-FITC、CD4-PE單抗各5μL，充分混勻后室溫避光反應(yīng)15 min，加入500 uL溶血?jiǎng)?7℃水浴箱放置10 min左右，待完全溶血時(shí)立刻上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD25強(qiáng)陽(yáng)性的CD4+T細(xì)胞（CD4+CD25high）特異性代表人CD4+CD25+T細(xì)胞。

T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定：使用（直接免疫熒光標(biāo)記法）全血流式細(xì)胞儀三色標(biāo)記法，取100μL全血，肝素抗凝加入20μL熒光標(biāo)記的CD3+、CD4+、CD8+單克隆抗體，避光反應(yīng)30 min后，加入0.83%氯化胺（NH4CL）溶血后上機(jī)檢測(cè)，分析至少5 000個(gè)單個(gè)核細(xì)胞群，確定CD3+、CD4+、CD8+的百分比，計(jì)算CD4+/CD8+。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料用“”表示，作成組t檢驗(yàn)和單因素方差分析。計(jì)數(shù)資料作χ2檢驗(yàn)。在P=0.05的水平上做主要效應(yīng)的顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 膿毒癥患者各亞組臨床資料比較

膿毒癥患者三個(gè)亞組年齡，性別構(gòu)成比等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。血乳酸水平、APACHEⅡ評(píng)分、氧合指數(shù)3組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），（表1）。

2.2 膿毒癥亞組與健康對(duì)照組間外周血CD4+CD25high表達(dá)和CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的

表1 3組病人臨床資料的比較（）

表1 3組病人臨床資料的比較（）

注：aP ＜0.05，vs 膿毒癥組；bP＜0.05，vs 嚴(yán)重膿毒癥組；cP ＜0.05，vs膿毒癥組。

組別 n 男/女 年齡（歲） 氧合指數(shù)（kPa） APACHE II 血乳酸水平（mmol/L）膿毒癥組 14 8/6 57.1±14.2 36.2±8.0 9.4±2.7 1.6±0.9嚴(yán)重膿毒癥組 15 9/6 58.1±15.9 26.5±9.1a 16.6±4.1a 2.6±0.8a膿毒癥休克組 11 7/4 59.4±11.7 14.9±4.7bc 27.1±3.5bc 4.6±0.9bc F（或χ2） 0.108 0.075 23.4 79.5 35.3 P 0.947 0.928 0.00 0.00 0.00

膿毒癥患者CD4+CD25high表達(dá)較正常人明顯升高（P＜0.05），膿毒癥休克組CD4+CD25highTreg表達(dá)最高（P＜0.05），嚴(yán)重膿毒癥組較膿毒癥組升高（P＜0.05）。膿毒癥組CD3+、CD4+和CD4+/CD8+較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.05），CD8+較正常對(duì)照組差異不明顯（P＞0.05）。嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥休克患者CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），CD8+較正常對(duì)照組改變不明顯（P＞0.05）（表2）。

2.3 膿毒癥患者CD4+CD25high與APACHEII評(píng)分、血乳酸水平和CD4+/CD8+的相關(guān)性分析

膿毒癥患者血乳酸水平與APACHEII評(píng)分成正相關(guān)（r=0.640，P=0.01水平）CD4+CD25high與APACHEII評(píng)分成正相關(guān)（r=0.829，P=0.01水平）和乳酸水平成正相關(guān)（r=0.627，P=0.01）。CD4+CD25high與CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)（r=-0.584，P=0.01）。

3 討論

膿毒癥免疫發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，目前認(rèn)為促炎反應(yīng)／抗炎反應(yīng)動(dòng)態(tài)失衡是膿毒癥進(jìn)展為嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克和多器官功能不全的（MODS）的原因之一[7]。

T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+均是T細(xì)胞重要的表面抗原標(biāo)志（屬T細(xì)胞輔助受體），它們作為免疫效應(yīng)細(xì)胞在直接殺傷靶細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮著重要的功能。CD3+淋巴細(xì)胞為全血T淋巴細(xì)胞；CD4+細(xì)胞為輔助/誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞（Th/Ti），在細(xì)胞免疫的效應(yīng)階段和變態(tài)反應(yīng)中能產(chǎn)生多種淋巴因子，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，從而加速消除抗原物質(zhì)；CD8+細(xì)胞可對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，即直接殺傷帶有特異性抗原的細(xì)胞或相應(yīng)的靶細(xì)胞，對(duì)CD4+細(xì)胞具有調(diào)節(jié)性抑制作用，CD4+/CD8+比值可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)[8]，CD4+/CD8+比值降低反映細(xì)胞免疫功能的抑制。

表2 膿毒癥亞組與健康對(duì)照組間外周血CD4+CD25high和T細(xì)胞亞群表達(dá)的比較（）

表2 膿毒癥亞組與健康對(duì)照組間外周血CD4+CD25high和T細(xì)胞亞群表達(dá)的比較（）

注：*P＜0.05，vs 正常對(duì)照組；# P＜0.05，vs 膿毒癥組；## P＜0.05，vs 嚴(yán)重膿毒癥組。

組別 n 年齡（歲） CD4+CD25high（%） CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4+ / CD8+正常對(duì)照組 20 50.6±10.7 0.39±0.23 65.2±16.7 43.1±9.4 17.5±6.0 2.83±1.28膿毒癥組 14 57.1±14.2 1.72±0.59* 70.3±18.9* 49.4±14.8* 17.2±7.5 3.47±2.06*嚴(yán)重膿毒癥組 15 58.1±15.9 2.72±0.22# 45.9±9.6# 26.3±9.4# 17.1±7.5 1.91±1.01#膿毒癥休克組 11 59.4±11.7 3.55±0.51## 36.5±10.1## 20.3±7.0## 16.6±6.7 1.70±0.89##F 1.522 28.58 22.935 22.804 0.939 4.736 P 0.219 0.00 0.00 0.00 0.428 0.005

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）是1995年Sakaguchi等在小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，在膿毒癥復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中主要發(fā)揮著對(duì)細(xì)胞免疫的抑制作用。膿毒癥時(shí)機(jī)體表現(xiàn)為CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞水平持續(xù)增高，從而加劇免疫無(wú)反應(yīng)狀態(tài)。研究表明膿毒癥患者體內(nèi)存在過(guò)多的Treg細(xì)胞，可以通過(guò)細(xì)胞接觸機(jī)制和釋放IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，下調(diào)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）表面分子CD80／CD86表達(dá)，抑制CD4+、CD8+T細(xì)胞功能及影響Thl／Th2極化，決定著炎癥反應(yīng)的不同結(jié)局[9]。

本研究通過(guò)對(duì)膿毒癥、嚴(yán)重膿毒癥、膿毒性休克患者細(xì)胞免疫的監(jiān)測(cè)，觀察到膿毒癥患者表現(xiàn)為CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對(duì)照組明顯升高，CD8+差異不明顯。嚴(yán)重膿毒癥組和膿毒癥休克患者表現(xiàn)為：CD3+、CD4+、CD4+/CD8+較正常對(duì)照組明顯降低。CD8+較正常對(duì)照組改變不明顯。另外，本研究中膿毒癥休克病人CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較膿毒癥組和嚴(yán)重膿毒癥組明顯升高，嚴(yán)重膿毒癥組與膿毒癥組比較是升高的。并且相關(guān)性分析表明：CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與APACHII評(píng)分和血乳酸水平成正相關(guān)（r=0.829，r=0.627，P=0.01）。與CD4+/CD8+成負(fù)相關(guān)（r=-0.584，P=0.01）。說(shuō)明隨病情加重，膿毒癥患者發(fā)生細(xì)胞免疫低下可能與CD4+CD25+Treg的升高有因果關(guān)系，其機(jī)制可能是：CD4+CD25+Treg可以通過(guò)導(dǎo)致抗炎細(xì)胞因子：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）和IL-10的升高，抑制淋巴細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)高表達(dá)FAS和FASL的活化，T淋巴細(xì)胞發(fā)生FAS-FASL結(jié)合，通過(guò)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞彼此殺傷或直接“自殺”[10]，使T細(xì)胞總數(shù)和活化的T細(xì)胞數(shù)量下降。此外，CD4+CD25+Treg經(jīng)TCR介導(dǎo)的信號(hào)刺激活化后，能抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞活化和增殖,使Th1向Th2漂移[11]，使免疫亢進(jìn)轉(zhuǎn)向免疫抑制。本研究提示隨病情嚴(yán)重程度增加，CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量增加，導(dǎo)致CD4+、CD4+/CD8+下降，對(duì)膿毒癥患者的免疫功能抑制加強(qiáng)，最后導(dǎo)致病人免疫麻痹。在感染和持續(xù)升高的前炎癥因子（TNF-α、IL-1β等）等損害下導(dǎo)致病人的高死亡率的發(fā)生。

綜上所述，本文詳述了膿毒癥患者CD4+CD25+Treg與T細(xì)胞亞群：CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+的關(guān)系，揭示了CD4+CD25+Treg細(xì)胞在膿毒癥患者細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)中的作用。提示臨床檢測(cè)膿毒癥患者CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平可以預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。但目前關(guān)于CD4+CD25+Treg在膿毒癥中的研究尤其是臨床觀察還很有限，許多確切的調(diào)控機(jī)制等諸多問(wèn)題都有待于更深入的探討。隨著CD4+CD25+Treg對(duì)機(jī)體免疫狀態(tài)及調(diào)節(jié)機(jī)制認(rèn)識(shí)的日益深化，許多作用環(huán)節(jié)都可能成為臨床干預(yù)的切入點(diǎn)，從而為防治膿毒癥及其他感染性疾病提供新策略。

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Clinic significance of Testing CD4+CD25+Treg cells in patients with sepsis

SHAO Min, LIU Bao, WANG Jin-quan, TAO Xiao-gen,ZHOU Shu-sheng,JIN Kui,ZHANG Cui-ping
(An Hui Provincial Hospital,He Fei,Anhui 230001,China)

Objective To study the level and significance of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells in peripheral blood of patients with sepsis.Methods 40 patients with sepsis Patients were divided into three groups: sepsis group(n=14), severe sepsis group(n=15), and septic shock group (n=11).The expression of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells of 40 patients on the day 1 was detected by flow cytometry. The comparision in the expression of CD4+CD25+Treg cells and CD3+、CD4+、CD8+cells within groups was made. Twenty healthy individuals served as controls.Results The expression rate.The expression of CD4+CD25+Treg cells was the highest in septic shock group(P＜0.05) followed by the severe sepsis group (P＜0.05) and the sepsis group the lowest(P＜0.05).The level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+in sepsis group was higher than control group and the level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+in severe sepsis and sepsis shock was lower than control group.Conclusion The expression of CD4+CD25+Treg cells was increased in sepsis patients and the level of CD3+、CD4+and CD4+/CD8+was low in severe sepsis and sepsis shock patients,suggesting that they may play an important role in pathogenesis of sepsis.Blood Treg% level can reflect the cell immune state of patients with sepsis and is of clinical value to assess the prognosis.

Sepsis;Cell immunity;CD4+CD25+Treg cells

R631

B

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.04.003.008.03

2011－01－20

邵 敏（1976－），男，安徽合肥人，在讀博士，主治醫(yī)師，主要從事危重癥急救工作。

馬宏宇）