李 雷 辛 勤 李海軍 于 婷 徐旭東 (濟寧醫(yī)學(xué)院，山東 濟寧 272029)

依達拉奉對AD模型大鼠行為學(xué)和腦部NOS1陽性神經(jīng)元的影響

李 雷 辛 勤 李海軍 于 婷1徐旭東 (濟寧醫(yī)學(xué)院，山東 濟寧 272029)

目的 觀察依達拉奉注射液對老年性癡呆(AD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶功能和神經(jīng)元性一氧化氮合酶(NOS1)陽性神經(jīng)元的影響。方法用腹腔注射(ip)D-半乳糖和灌胃注射(ig)AlCl3法建立AD模型，Morris水迷宮實驗檢測學(xué)習(xí)記憶能力，以免疫組化法觀察大鼠腦部的NOS1變化。結(jié)果 依達拉奉能顯著改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙(P＜0.05)，并明顯增強大腦皮質(zhì)和海馬NOS1活性及其神經(jīng)元密度(P＜0.05)，其作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。結(jié)論 中樞NOS1活性與學(xué)習(xí)記憶成績顯著相關(guān);依達拉奉注射液對AD模型的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用。

阿爾茨海默病;依達拉奉;實驗研究

阿爾茨海默病(AD)患者老年斑周圍的星形膠質(zhì)細胞表達神經(jīng)元性一氧化氮合酶(NOS1)增多;而額葉、海馬等腦區(qū)NOS1mRNA陽性神經(jīng)元明顯減少〔1〕;由于膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量NO，破壞膽堿能神經(jīng)元，使額葉、海馬等腦區(qū)NOS1神經(jīng)元受損，最終導(dǎo)致AD患者出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶障礙和癡呆等病癥〔2〕。老年性癡呆與腦細胞長期缺血缺氧有關(guān)，研究證明與自由基損傷、細胞因子等有一定關(guān)系〔1〕。本實驗擬研究依達拉奉注射液對AD大鼠進行藥物干預(yù)，觀測行為學(xué)改變以及對AD大鼠腦部NOS1變化的影響，以探討依達拉奉注射液對AD可能的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雄性健康Wistar大鼠50只，鼠齡16周齡，體重220～340 g，山東新華抗生素廠提供，合格證號:SCXK魯20050017，使用證號:SYSK魯20050047。實驗動物飼以標準顆粒飼料，分籠喂養(yǎng)，自由飲食，自然晝夜光線照明，實驗室內(nèi)通風(fēng)良好，溫度18℃ ～25℃，相對濕度為40% ～70%。

1.1.2 試劑 AlCl3(天津市雙船化學(xué)試劑)，D-半乳糖(天津灝洋生物制品有限公司)，兔抗大鼠NOS1(武漢博士德生物工程有限公司)，nNOS試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.1.3 儀器 PCR擴增自動循環(huán)儀(Perlin Elmer Cetus 9700，美國)，TD-300病理組織圖像分析系統(tǒng)(北京天地公司)，Morris水迷宮、視頻采集系統(tǒng)(中國科學(xué)院技術(shù)研究所)。

1.2 動物分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，經(jīng)Morris水迷宮測試，超過2 min未找到安全平臺淘汰6只，剩余44只，隨機分為空白對照組12只，造模組12只，依達拉奉低劑量組10只(低量劑組)，依達拉奉高劑量組10只(高劑量組)。實驗后造模組死亡2只，低劑組死亡1只，高劑組死亡2只。

1.3 AD動物模型的建立和給藥〔3〕造模組，低劑組和高劑組腹腔注射(ip)D-半乳糖60 mg·kg－1·d－1(生理鹽水配制)和灌胃注射(ig)AlCl3100 mg·kg－1·d－1(雙蒸水配制)，連續(xù)12 w;空白對照組ip等量的生理鹽水和ig等量的雙蒸水。從實驗開始第9周，低劑組和高劑組分別于大鼠尾靜脈注射依達拉奉3和6 mg·kg－1·d－1，造模組和空白對照組分別注射等量生理鹽水。每日上午給藥，實驗共12 w。12 w后，采用Morris水迷宮法測試學(xué)習(xí)記憶能力。

1.4 行為學(xué)測試 大鼠學(xué)習(xí)、記憶測驗參照Morris迷宮箱進行測試所有大鼠在腦內(nèi)注射后進行Morris水迷宮測試。測試程序包括:①空間探索試驗:歷時5 d，每天上下午各4次，將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，記錄其在2 min內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在2 min未找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中。②定位航行試驗:第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，記錄其2 min的游泳軌跡，分別計算其跨越各象限內(nèi)的游泳距離以及在原平臺象限游泳的時間和距離占整個游泳時間和距離的百分比。

1.5 標本的采集和處理 所有大鼠飼養(yǎng)3個月，經(jīng)行為學(xué)測試后處死，大鼠經(jīng)3%戊巴比妥(50mg/kg)麻醉后，剪開胸骨暴露心臟，經(jīng)左心室插管進入升主動脈，同時剪開右心房放血;先快速以生理鹽水100 ml左右進行預(yù)沖洗，隨即灌注4℃預(yù)冷的含4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)，灌注約30 min。然后斷頭取腦，大腦組織放入10%甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片用于NOS1的測定。

1.6 免疫組化 按試劑盒說明書操作。每塊玻片中NOS1陽性神經(jīng)元數(shù)量，用TD-300圖像分析系統(tǒng)對NOS1陽性神經(jīng)元進行處理，分析其陽性細胞數(shù)及細胞面積(反映細胞大小)，取其平均值作為該玻片的數(shù)據(jù)?；叶戎荡笮∨cNOS1的表達強度成反比，即灰度值越小表示NOS1表達越強，反之越弱。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用±s表示。對Morris水迷宮數(shù)據(jù)采用t檢驗。對免疫組化結(jié)果采用SNK分析，即q檢驗，均滿足正態(tài)分布和方差齊性條件。多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，均數(shù)間兩兩比較采Student-Newman-Keuls檢驗。

2 結(jié)果

2.1 逃避潛伏期 各組大鼠均隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，逃避潛伏期越來越短，表明各組大鼠學(xué)習(xí)尋找平臺的能力在歷次的學(xué)習(xí)訓(xùn)練中均得到提高，第1天各組無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.80)，第2～5天各組出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異(P分別為0.027，0.019，4.1×10－4，0.03)。兩兩比較發(fā)現(xiàn):第2天到第5天造模組大鼠的逃避潛伏期較對照組明顯延長(P＜0.05或P＜0.01)，顯現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶力明顯減退;與造模組比較，用藥組逃避潛伏期明顯縮短，其中以高劑量組較明顯(第4天Q值為7.422 7，P＜0.05，第5天的Q值為3.059 1，P＜0.01)，低劑量組次之(第4天和第5天的Q值為6.763 6，3.908 8，P＜0.05)，顯現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力明顯提高;用藥組組間比較，高劑量組對低劑量組逃避潛伏期有不同程度的縮短，但差別無顯著差異(第4天和第5天的 Q值為0.850 5，0.709 9，P ＞0.05)。見表1。

表1 大鼠5 d逃避潛伏期的變化(±s，s)

表1 大鼠5 d逃避潛伏期的變化(±s，s)

與對照組比較:1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;與造模組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 n 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天5±3.4造模組 10 91.2±21.6 86.5±25.41) 51.2±25.81) 47.7±8.62) 31.7±29.32)低劑量組 9 83.2±15.7 72.1±33.6 47.3±18.5 28.9±11.54) 25.6±14.83)高劑量組 8 82.2±19.7 68.7±36.5 48.1±22.6 26.4±13.34) 21.5±15.13)對照組 12 86.3±26.3 48.6±17.4 21.1±14.6 12.7±4.6 8.

2.2 大鼠空間探索實驗所反映記憶能力的變化 各組大鼠在各象限跨越各相應(yīng)平臺次數(shù)的結(jié)果。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ象限各組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為1.3×10－7，0.045，4.1×10－11)，Ⅲ象限各組比較無顯著差異(P=0.331)。各組兩兩比較:造模組大鼠與對照組比較，在Ⅰ(Q=9.360 8，P＜0.01)和Ⅳ(Q=11.438 0，P＜0.01)象限跨越各相應(yīng)平臺次數(shù)明顯減少;與造模組比較，各用藥組在各象限跨越各相應(yīng)平臺次數(shù)不同程度增多，其中以高劑量組明顯，特別是在Ⅰ(Q=6.217 7，P＜0.01)和Ⅳ象限更多(Q=5.921 6，P＜0.01)。見表2。

表2 大鼠至各象限跨越原平臺的次數(shù)(±s，次)

表2 大鼠至各象限跨越原平臺的次數(shù)(±s，次)

與對照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與造模組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 n Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ12 9.5±2.3 6.2±2.2 6.4±1.1 11.5±1.8造模組 10 4.2±1.32)3.8±1.51)5.1±2.4 4.7±1.82)低劑量組 9 5.8±2.13)5.5±3.43)6.6±2.6 6.8±2.73)高劑量組 8 8.1±1.44)6.7±1.53)5.4±2.3 8.6±1.34)對照組

2.3 免疫組織化學(xué)(SABC法)定性觀察 皮質(zhì)的各個區(qū)域均可見散在多極形NOS1陽性神經(jīng)元，散見于Ⅱ?qū)印魧?，細胞?shù)以深層為多，陽性細胞帶有3～5個突起。在皮質(zhì)各區(qū)內(nèi)可見中等密度的NOS1陽性纖維，纖維精細不等，相互編織成網(wǎng)。海馬的錐體細胞不染色，齒狀回門區(qū)可見一些大的中度染色細胞，海馬和齒狀回均可見陽性纖維，量較皮質(zhì)略細而稀疏。大腦皮質(zhì)和海馬NOS1陽性反應(yīng)以對照組最強，而造模組最弱，2個治療組介于二者之間。見圖1、圖2。

2.4 大鼠腦NOS1活性的影響定量檢測 大鼠腦NOS1活性在皮質(zhì)和海馬各組間均有顯著差異(P分別為5.7×10－11和5.5×10－7)。造模組與對照組比較在皮層(Q=12.016 4)及海馬CA1(Q=11.189 6)的NOS1陽性細胞數(shù)量均明顯減少(P＜0.01)。在海馬CA1區(qū)，低劑量組(Q=4.157 9)和高劑量組(Q=9.022 3)與造模組比較NOS1陽性細胞數(shù)量明顯增加(P＜0.01);在皮質(zhì)區(qū)，低劑量組和高劑量組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(Q=0.929 8，P＞0.05)。在海馬CA1區(qū)，低劑量組和高劑量組相比明顯減少(Q=4.375 8，P＜0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腦NOS1陽性細胞數(shù)及面積比較(±s，個/mm2)

表3 各組大鼠腦NOS1陽性細胞數(shù)及面積比較(±s，個/mm2)

組別 n 皮層NOS1陽性細胞數(shù) 海馬CA1區(qū)NOS1陽性細胞12 11.97±2.35 10.35±2.17造模組 10 4.34±1.71 3.98±2.15低劑量組 9 7.76±2.68 6.52±1.36高劑量組數(shù)對照組8 7.43±1.16 8.67±1.49

圖1 大鼠皮質(zhì)額葉NOS1陽性神經(jīng)元(×400)

圖2 大鼠海馬CA1區(qū)NOS1陽性神經(jīng)元(×400)

3 討論

一氧化氮(NO)作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細胞間信使分子，在學(xué)習(xí)記憶機制中具有重要作用。NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性中起重要作用。NO供體物質(zhì)可加強培養(yǎng)的海馬錐體細胞遞質(zhì)釋放，而NOS抑制劑或血紅蛋白則可阻斷海馬CA1區(qū)中的長時程增強(LTP)，說明在LTP中NO充當逆行遞質(zhì)作用。一氧化氮合酶(NOS)是催化產(chǎn)生內(nèi)源性NO的唯一酶類，并因NO的非囊泡釋放、高度彌散和半衰期極短等特征而在很大程度上決定著NO的生物學(xué)效應(yīng)。目前已知CNS中至少存在兩類 NOS〔4〕:原生型 NOS(cNOS)及誘導(dǎo)型 NOS(iNOS)。cNOS包括神經(jīng)元型 NOS(nNOS，即 NOS1)和內(nèi)皮型 NOS(eNOS)。它們分別執(zhí)行不同的生理和病理功能，其中nNOS可能是參與學(xué)習(xí)記憶機制的關(guān)鍵酶。研究表明〔5〕，動物學(xué)習(xí)記憶過程中，不同腦區(qū)的NO水平及NOS活性增高。學(xué)習(xí)過程伴有海馬NOS1合成及活性增加，NOS1/NO在學(xué)習(xí)記憶的獲得階段具有重要作用。檢測NOS1對研究AD病情的進展有重要意義。

理想的AD動物模型應(yīng)是能夠客觀、全面地再現(xiàn)AD患者的臨床癥狀和病理變化，能夠詳盡地評價神經(jīng)病理、神經(jīng)化學(xué)和行為各個方面;另外，還要適用于探討中藥多靶點作用機制及有效藥物篩選。AD是發(fā)病率最高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退變性疾病，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力的減退和分析、綜合、理解、判斷能力下降，尤以近事遺忘為主〔6〕。從智力測試實驗結(jié)果我們得知:在Morris水迷宮定位航行實驗中，造模組大鼠每天逃避潛伏期都明顯延長，在空間探索實驗中，在各象限跨越相應(yīng)平臺次數(shù)明顯減少，說明造模組大腦學(xué)習(xí)記憶能力嚴重受損，明顯下降，提示該次自制AD大鼠模型具有學(xué)習(xí)記憶和空間探索能力下降的特點，與AD臨床表現(xiàn)極其相似，證明了該次AD大鼠模型造模成功。

依達拉奉可以清除體內(nèi)活性氧分子、抑制脂質(zhì)過氧化，抑制血管內(nèi)皮細胞的損害，抑制腦水腫、改善神經(jīng)癥狀，抑制遲發(fā)性神經(jīng)細胞死亡等，既能對抗氧自由基增強中樞神經(jīng)耐缺氧能力，又能減輕腦水腫，降低顱內(nèi)壓〔7〕。從而改善腦部缺氧缺血狀況，對癡呆癥有良好的治療效果。筆者認為依達拉奉注射液治療AD的臨床價值在于擴張血管減輕外周阻力，改善動靜脈血供，使腦組織內(nèi)葡萄糖和氧得到充分利用，提高了大腦所需能量，刺激腦內(nèi)很多神經(jīng)遞質(zhì)及相關(guān)酶的活性，從而改善大腦功能和加強了語言、記憶、情緒等的能力。

本試驗結(jié)果表明依達拉奉注射液對癡呆大鼠的信息獲取能力和信息貯存能力都有明顯的改善作用，能抑制模型大鼠海馬NOS1神經(jīng)元受損。證實依達拉奉可有效改善AD的病理過程，其作用呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。提示依達拉奉治療AD可通過多系統(tǒng)、多層次作用機制而發(fā)揮功效，其具體機制有待進一步探討。

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R749.16

A

1005-9202(2011)12-2279-03

1 濟寧市第一人民醫(yī)院

于 婷(1981-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事細胞生物學(xué)研究。

李 雷(1979-)，男，碩士，講師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科臨床工作及診斷學(xué)研究。

〔2009-12-14收稿 2010-04-19修回〕

(編輯 張永貴/曹夢園)