孟凡超 孫世龍 婁季宇 趙亞鵬 (鄭州市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

老齡與年輕大鼠腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的比較

孟凡超1孫世龍 婁季宇1趙亞鵬 (鄭州市第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

目的 觀察年齡對(duì)腦出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的影響。方法 年輕(3個(gè)月齡)和老齡(16個(gè)月齡)雄性SD大鼠腦內(nèi)注入100μl自體全血，觀察與年齡相關(guān)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)。年輕、老齡模型組大鼠分別在腦內(nèi)注血后6、12、24、72 h、7、14 d時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物(每組6只)進(jìn)行GFAP免疫組化。假手術(shù)組作對(duì)照。觀察GFAP染色的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)。結(jié)果 與年輕大鼠比較，老齡大鼠腦出血后3 d星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)較弱，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著低于年輕大鼠，這種狀況可持續(xù)到監(jiān)測(cè)14 d(P＜0.01)。結(jié)論 老齡大鼠腦出血應(yīng)答的星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)較弱，老齡是影響腦出血后腦損傷的重要因素。

腦出血;膠質(zhì)纖維酸性蛋白;星形膠質(zhì)細(xì)胞;腦損傷;大鼠

增殖過(guò)程中幼稚的星形膠質(zhì)細(xì)胞(AS)先表達(dá)中間絲波形蛋白(valentine)，成熟后則表達(dá)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。GFAP是完成反應(yīng)性AS膠質(zhì)化的必要條件，是AS主要成分，可作為AS的特異性標(biāo)記物及其活化的標(biāo)志〔1〕，反映細(xì)胞各種分子物質(zhì)表達(dá)的改變及代謝變化。研究證實(shí)，AS在腦出血后血腫周圍發(fā)生肥大和增生性變化，其變化對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活可能有促進(jìn)作用〔2〕。但老齡是否影響腦出血后腦損傷及AS反應(yīng)，目前尚未在動(dòng)物模型方面進(jìn)行系統(tǒng)研究。本文通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討年齡對(duì)腦出血后AS反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑 Narishige型立體定向儀(日本)，微量進(jìn)樣器(上海醫(yī)用激光儀器廠)，顯微外科手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械廠)，奧林巴斯顯微鏡(日本)。SP免疫試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、GFAP抗體、GFAP二抗(北京中杉生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組、腦出血模型建立、標(biāo)本制備 參照既往實(shí)驗(yàn)研究〔3〕。年輕 (3個(gè)月齡)和老齡 (16個(gè)月齡)雄性SD大鼠腦內(nèi)注入100μl自體全血，分別在腦內(nèi)注血后6、12、24、72 h、7、14 d時(shí)間點(diǎn)處死動(dòng)物 (每組6只)進(jìn)行GFAP免疫組化。假手術(shù)組作對(duì)照。GFAP免疫組化染色步驟 (SP法)嚴(yán)格按說(shuō)明書操作。磷酸鹽緩沖液 (PBS)代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 陽(yáng)性細(xì)胞的辨認(rèn)和測(cè)定 GFAP為AS的胞質(zhì)、突起著色，免疫組化陽(yáng)性細(xì)胞顯色為棕黃色。計(jì)數(shù)方法:對(duì)每張玻片取5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算每高倍視野下陽(yáng)性細(xì)胞均數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，采用Student t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

正常腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量少，突起細(xì)短，染色淡，細(xì)胞輪廓清晰，規(guī)律排布。腦出血12 h后GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量開始增加。72 h～7 d陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多，體積大，突起增粗，陽(yáng)性顆粒顏色加深。7 d AS的反應(yīng)達(dá)高峰，陽(yáng)性細(xì)胞明顯增多，胞體肥大，突起粗大不規(guī)則，呈簇狀分布。14 d GFAP陽(yáng)性反應(yīng)減弱。與年輕大鼠比較，老齡大鼠腦出血后72 h星形細(xì)胞的反應(yīng)相對(duì)較弱。見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 同側(cè)皮質(zhì)區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

圖2 同側(cè)基底節(jié)區(qū)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(±s)

3 討論

AS活化是AS可塑性的具體表現(xiàn)，又稱反應(yīng)性膠質(zhì)增生是中樞神經(jīng)系統(tǒng)在許多病理生理情況下常見(jiàn)反應(yīng)，表現(xiàn)為AS胞體肥大、腫脹、突起增多延長(zhǎng)、GFAP表達(dá)增強(qiáng)等。Kajihara等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)腦損傷后7～15 d AS反應(yīng)達(dá)高峰，細(xì)胞體積明顯增大，突起明顯增粗，數(shù)目變多，為活化狀態(tài)的AS。本研究顯示老年、年輕大鼠腦出血早期GFAP陽(yáng)性AS表達(dá)較低，72 h時(shí)明顯升高，7 d達(dá)高峰，14 d下降。表明腦出血GFAP陽(yáng)性AS表達(dá)存在時(shí)間依賴性變化。在對(duì)犬的成年組和老齡組觀察發(fā)現(xiàn)〔5〕:隨著機(jī)體衰老，齒狀回分子層GFAP免疫反應(yīng)性顯著降低，而在CA1卻是升高的，且GFAP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞胞體明顯肥大，提示不同年齡階段、不同區(qū)域GFAP表達(dá)也不同。有學(xué)者〔6，7〕用缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)和免疫組化法觀察到受傷的脊髓中存在凋亡，認(rèn)為AS增多是增殖和遷移積聚多于死亡所致。本實(shí)驗(yàn)老齡大鼠腦出血后GFAP陽(yáng)性AS表達(dá)較弱，可能是老齡大鼠腦出血損傷后AS凋亡增多所致，提示老齡是影響腦出血損傷AS凋亡增多的因素。

研究證實(shí)，AS在腦出血周圍區(qū)發(fā)生肥大和增生性變化，其變化對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)和存活可能有促進(jìn)作用〔2〕。本研究顯示老齡、年輕大鼠腦出血早期AS表達(dá)較弱，推測(cè)腦出血早期AS的反應(yīng)是對(duì)神經(jīng)元損傷的應(yīng)答，與維持神經(jīng)元存活有關(guān)。老齡大鼠較年輕大鼠腦出血后AS表達(dá)弱，可能是老齡大鼠腦出血損傷后AS的凋亡增多及年齡依賴性的AS神經(jīng)保護(hù)功能反應(yīng)性降低所致。

活化后的AS通過(guò)多種途徑與神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等相互作用，發(fā)揮多種功能。Seth等〔8〕認(rèn)為，AS的功能很多，包括控制突觸的形成和功能、大腦血管張力的調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、成年時(shí)的神經(jīng)生長(zhǎng)。AS能調(diào)節(jié)突觸的傳播和可塑性。Haber等〔9〕發(fā)現(xiàn)，AS能夠非常快地伸出和縮回很細(xì)的突起，接觸或脫離能動(dòng)的突觸后樹狀突起。AS的能動(dòng)度依賴于其細(xì)胞骨架中肌動(dòng)蛋白的重組作用。Haydon等〔10〕認(rèn)為，在許多突觸處，一個(gè)AS的突起能與突觸前和突觸后神經(jīng)元的突起聯(lián)系，故這個(gè)突觸結(jié)構(gòu)就命名為“三聯(lián)突觸”，這些AS就能夠影響突觸的傳播。激活后AS對(duì)神經(jīng)元的影響包括兩方面:一方面，通過(guò)分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和基質(zhì)分子促進(jìn)軸突再生，保護(hù)神經(jīng)元免受損傷，有利于損傷后神經(jīng)元的功能恢復(fù)。反應(yīng)性膠質(zhì)增生的細(xì)胞有合成神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的能力，能影響神經(jīng)元總體在受損組織中的命運(yùn)。AS可合成和釋放多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，如神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)，層黏連蛋白，纖維黏連蛋白及其他細(xì)胞外基質(zhì)成分，有維持神經(jīng)元存活和促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的作用。另一方面，對(duì)神經(jīng)元修復(fù)有其不利的一面。(1)不能提供適當(dāng)?shù)纳窠?jīng)再生基質(zhì)。成年鼠單側(cè)切斷其黑質(zhì)紋狀體束，術(shù)后2 d在損傷區(qū)無(wú)AS存在，4 d后可見(jiàn)損傷區(qū)邊緣有一些AS，10 w后在壞死空洞區(qū)有致密的AS網(wǎng)狀組織存在，芽生反應(yīng)由高峰開始衰減時(shí)，AS反應(yīng)上升。所以急性損傷后新生的AS支持軸突再生，但稍后當(dāng)反應(yīng)性升高時(shí)表現(xiàn)為負(fù)性作用，抑制再生。盡管在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)發(fā)育中AS為神經(jīng)元的遷移和神經(jīng)纖維的靶向性延伸充當(dāng)基質(zhì)，但成熟動(dòng)物的反應(yīng)性AS卻是一種不適合軸突生長(zhǎng)的環(huán)境。(2)反應(yīng)性AS同時(shí)也能分泌對(duì)軸突生長(zhǎng)和神經(jīng)元存活的抑制性分子。例如細(xì)胞黏合素(tenasin)對(duì)抑制軸突生長(zhǎng)、發(fā)育和再生中引導(dǎo)髓鞘化和神經(jīng)細(xì)胞的遷移方面起作用，并能促進(jìn)星形膠質(zhì)瘢痕的形成。與tenasin-R連接的硫酸軟骨素蛋白多糖可以促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的移動(dòng)性和誘導(dǎo)膠質(zhì)瘢痕形成。本實(shí)驗(yàn)老齡較年輕大鼠腦出血后AS表達(dá)較弱，可能是老齡大鼠腦出血損傷后AS神經(jīng)保護(hù)功能反應(yīng)性降低，以及神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等不適當(dāng)相互調(diào)節(jié)作用所致。由于腦損傷后AS對(duì)損傷神經(jīng)元的作用具有兩面性，一方面活化的AS可以保護(hù)損傷的神經(jīng)元;另一方面，活化的AS又可以加重神經(jīng)元的損傷，所以在分析腦損傷后AS作用的時(shí)候，腦損傷的類型、年齡以及檢測(cè)損傷的時(shí)間是必須考慮的因素。

實(shí)驗(yàn)表明不同類型腦損傷后AS的反應(yīng)不同，活化AS在形態(tài)上的差異可能與神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的運(yùn)輸、神經(jīng)修復(fù)與再生等功能相適應(yīng)〔11〕。年齡依賴性的神經(jīng)元活動(dòng)變化引起細(xì)胞外K+、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)濃度的變化，從而增加AS活動(dòng)，導(dǎo)致GFAP表達(dá)和 AS 改變〔12〕。Fountoulakis〔13〕和丁勤學(xué)等〔14〕利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2DE)技術(shù)發(fā)現(xiàn):老齡鼠腦組織液中蛋白發(fā)生了質(zhì)和量的變化，蛋白結(jié)構(gòu)修飾、氨基酸突變，降解碎片增多等。這些實(shí)驗(yàn)均提示:年齡依賴性的變性蛋白可能是引起AS活化的重要因素。本實(shí)驗(yàn)老齡較年輕大鼠腦出血后AS弱表達(dá)可能有上述機(jī)制參與。AS是神經(jīng)元存活的要素，在當(dāng)前的研究中，腦出血應(yīng)答的AS反應(yīng)在老齡大鼠較弱。老齡大鼠對(duì)腦損傷有較少AS的反應(yīng)，也有研究發(fā)現(xiàn)老齡腦缺血大鼠AS反應(yīng)較強(qiáng)〔15，16〕。然而，腦出血應(yīng)答的GFAP陽(yáng)性AS反應(yīng)在老齡大鼠是否具有神經(jīng)保護(hù)作用仍有爭(zhēng)論。本研究認(rèn)為老齡大鼠更嚴(yán)重的腦損傷很可能與腦出血應(yīng)答的AS反應(yīng)較弱有關(guān)。

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R743.3

A

1005-9202(2011)12-2272-03

1 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

婁季宇(1954-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事腦血管疾病臨床研究。

孟凡超(1965-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管疾病臨床研究。

〔2011-03-30收稿 2011-04-20修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)