茍連平 呂 湛 胡厚祥 張 俊 羅 勇 馮 杰 蒲麗君

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 南充 637000)

羅格列酮對THP-1源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇和氧化型低密度脂蛋白及丙二醛水平的影響

茍連平 呂 湛 胡厚祥 張 俊 羅 勇 馮 杰 蒲麗君

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川 南充 637000)

目的 觀察羅格列酮干預THP-1源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇和氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)及丙二醛(MDA)水平的變化及其防治動脈粥樣硬化的可能機制。方法 培養(yǎng)THP-1細胞，佛波脂(PAM)使之巨噬化，ox-LDL使巨噬細胞形成泡沫細胞，羅格列酮和泡沫細胞孵育48 h。用熒光分光光度法檢測細胞內(nèi)總膽固醇(TC)、游離膽固醇(FC)和膽固醇酯(CE)的含量;ELISA法測定ox-LDL;TBARS法檢量MDA。結(jié)果 THP-1細胞經(jīng)PAM和ox-LDL孵育后，有大量泡沫細胞形成。細胞內(nèi)TC、FC、CE、ox-LDL、MDA均增多(P＜0.05);羅格列酮干預后，細胞內(nèi)TC、FC、CE、ox-LDLD、MDA均顯著減少(P＜0.05)。結(jié)論 羅格列酮可通過降低細胞內(nèi)膽固醇的聚積和減輕細胞的氧化抗動脈粥樣硬化。

羅格列酮;泡沫細胞;膽固醇;氧化型低密度脂蛋白;丙二醛

噻烷二唑酮類藥物羅格列酮廣泛用于糖尿病的治療，也可防治動脈粥樣硬化(AS)〔1〕。本課題研究羅格列酮對THP-1源性泡沫細胞內(nèi)膽固醇(TC)、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)及丙二醛(MDA)水平的影響，探討羅格列酮防治AS更多新機制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司。新生小牛血清，成都哈里生物工程有限公司。THP-1單核細胞株，四川大學免疫教研室。佛波脂(PAM)、羅格列酮為美國Sigma公司。油紅O，美國Amrcsco公司。BCA試劑盒，美國Pierce公司。MDA檢測試劑盒，南京建成生物科技有限公司;ox-LDL試劑盒，上海銳聰實驗室設備有限公司。Beckman Culture Optima L-100 XP型超速離心機，美國。HITACHI650-60熒光分光光度計，日本。

1.2 方法

1.2.1 LDL的分離提取、氧化修飾及泡沫細胞模型建立、鑒定健康人血漿來自本院體檢健康者。①LDL的分離〔2〕:正常人新鮮血漿經(jīng)密度梯度超速離心，分離LDL。②LDL的氧化修飾:將上述透析好的LDL置于15μmol/L CuSO4溶液中透析氧化24 h，0.45μm的微孔濾器過濾，并用BCA法測定其濃度。③泡沫細胞模型建立、鑒定:含10%新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基THP-1細胞。2～3代的THP-1細胞于含PAM 160 nmol/L，0.3%BSA的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h，細胞分化為巨噬細胞。分化好的巨噬細胞，換液(含0.3%BSA的無血清RPMI1640培養(yǎng)基)，同時加入 50 mg/L ox-LDL，在 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用油紅O染色證實細胞中形成大量脂質(zhì)小滴，提示已轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?/p>

1.2.2 藥品的配制 用DMSO分別將羅格列酮充分溶解，配制成實驗濃度(通過MTT比色法確定)100倍的儲備液，－70℃保存，臨用前用培養(yǎng)液100倍稀釋，0.22μm的一次性濾器過濾除菌，4℃ 保存。

1.2.3 實驗分組及實驗方法 濃度為1×107/L的巨噬細胞于12孔板里培養(yǎng)，每組設4復孔。分組對照組(巨噬細胞液中無藥物干預)、泡沫細胞組(巨噬細胞液中加入終濃度50 mg/L的ox-LDL)、羅格列酮組(終濃度10μmol/L的羅格列酮和終濃度50 mg/L的ox-LDL)。各組在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h。

1.2.4 細胞內(nèi)TC、ox-LDL、MDA的測定 用氯仿-甲醇法提取培養(yǎng)液中的TC。用ELISA法檢測ox-LDL，按試劑盒操作步驟操作。

1.2.5 細胞內(nèi)MDA的測定 按MDA試劑盒操作步驟操作。旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜扎緊，用針頭刺一小孔，95℃水浴 40 min，取出后流水冷卻，4 000 r/min，離心10 min，取上清于532 nm處測定各管吸光度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，行兩兩間的t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 THP-1細胞分化為巨噬細胞、泡沫細胞光鏡下表現(xiàn) 光鏡下THP-1細胞呈球形，懸浮生長，無限增殖。經(jīng)PMA刺激后細胞失去原來懸浮生長的特性和增殖性，由懸浮狀態(tài)變成貼壁狀態(tài)，胞體變大，形態(tài)不規(guī)則，呈梭形、或橢圓形等，胞內(nèi)可見較多顆粒，提示巨噬細胞形成。再與ox-LDL孵育后，油紅O染色細胞中形成大量脂質(zhì)小滴，表明已轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽毎?。見圖1。

2.2 各組細胞中的TC、ox-LDL、MDA水平 細胞與10μmol/L的羅格列酮作用48 h后，泡沫細胞形成，細胞內(nèi)總TC、游離TC、TC酯、ox-LDL、MDA 均增多(P＜0.05);羅格列酮干預后，細胞內(nèi)總 TC、游離TC、TC酯、ox-LDL、MDA均顯著減少(P＜0.05)。見表1。

圖1 THP-1細胞、巨噬細胞及泡沫細胞

表1 各組細胞中的膽固醇、ox-LDL、MDA水平(±s)

表1 各組細胞中的膽固醇、ox-LDL、MDA水平(±s)

與巨噬細胞組比較:1)P＜0.05;與泡沫細胞比較:2)P＜0.05

組別 TC(mg/L) FC(mg/L) CE(mg/L) ox-LDL(pg/L) MDA(mg/L)巨噬細胞組 18.8±2.5 14.3±2.0 3.9±0.9 10.33±2.13 0.98±0.06泡沫細胞組 120±10.11) 39.6±7.31) 81.7±7.91) 51.46±8.671) 11.23±1.781)羅格列酮組 19.3±2.12) 15.6±2.12) 3.8±1.02) 13.52±5.152) 1.02±0.092)

3 討論

AS始發(fā)于兒童時期而持續(xù)進展，通常在中年或中老年出現(xiàn)癥狀。AS發(fā)病機制學說多種，但泡沫細胞的形成在AS形成過程中始終起著主要作用〔3，4〕。由于AS斑塊表現(xiàn)為脂質(zhì)和壞死組織的聚集，因此往往認為AS是退行性變?，F(xiàn)認為本病是多因素共同作用的結(jié)果，首先是病變處有平滑肌細胞、巨噬細胞及T淋巴細胞的聚集;其次是包括膠原、彈性纖維及蛋白多糖等結(jié)締組織和平滑肌細胞的增生;三是脂質(zhì)的沉積，脂質(zhì)斑塊主要含有TC結(jié)晶及游離的TC和結(jié)締組織。粥樣斑塊中脂質(zhì)及結(jié)締組織的比例含量決定斑塊的穩(wěn)定性，從而關系到急性缺血事件是否發(fā)生。TC過高，則會引起它的沉積，因為TC作為一種脂質(zhì)是形成AS的主要原因之一，因此減少TC的流入或和促進流出，即減輕細胞內(nèi)脂質(zhì)負荷，具有重要的理論和實際意義。

TC形成LDL后透過內(nèi)皮細胞深入內(nèi)皮細胞間隙，單核細胞遷入內(nèi)膜，此即AS病理改變的最早期。LDL被氧化成ox-LDL后，與巨噬細胞的清道夫受體結(jié)合而被攝取，形成巨噬源性泡沫細胞，形成病理變化中的脂紋。動脈中膜的血管平滑肌細胞(SMC)遷入內(nèi)膜，吞噬脂質(zhì)形成肌源性泡沫細胞，增生遷移形成纖維帽，形成病理變化中的纖維斑塊。ox-LDL使上述兩種泡沫細胞壞死崩解，形成糜爛粥樣壞死物，粥樣斑塊就這樣形成。從上述AS形成的機制得知，其關鍵因子為ox-LDL，如何防止LDL被氧化成ox-LDL就成了防治AS的核心之一。

盡管脂源性理論在AS發(fā)生中起著重要作用，但它無法解釋4種現(xiàn)象:①ox-LDL受體(LDL-R)缺乏的患者(家族性純合子型高膽固醇血癥)或動物模型，由于巨噬細胞表面的LDL-R缺乏，LDL無法通過LDL-R途徑被巨噬細胞攝取，但該類患者或動物模型AS的發(fā)病率卻幾乎是100%〔5〕。②體外試驗中，即使將單核-巨噬細胞和平滑肌細胞和濃度非常高的LDL血漿共同培養(yǎng)后，也并不能誘導TC在細胞內(nèi)的聚積。③LDL-R受細胞內(nèi)TC含量的負反饋調(diào)節(jié)。LDL和LDL-R結(jié)合后，內(nèi)吞進入巨噬細胞胞漿，與溶酶體結(jié)合后，在溶酶體酶的作用下，LDL中的蛋白質(zhì)降解為氨基酸，而TC酯水解為游離TC和脂肪酸。但是，當細胞內(nèi)TC的含量飽和時，便會反饋性調(diào)節(jié)細胞表面的LDL-R的數(shù)量減少，功能下調(diào)〔6〕。所以LDL經(jīng)這一途徑代謝只是一個生理過程，并不會引起TC在巨噬細胞內(nèi)堆積。④多個流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，AS與高TC血癥之間呈一種非線性關系，AS患者中合并高TC血癥的不到60%，有40%多的患者血脂可完全正常。綜上4個現(xiàn)象表明，高LDL與AS形成之間存在著中間致病環(huán)節(jié)。脂質(zhì)氧化(ROS)理論的提出就能解釋上述4種現(xiàn)象。ROS對機體有防御作用;也可為細胞內(nèi)第二信使，參與正常生理功能;但過量，則會導致病理損傷。LDL被氧化修飾后形成ox-LDL可促進SMC增殖;抑制內(nèi)皮細胞的血管舒張;具有免疫原性;破壞內(nèi)膜完整性;增強T細胞趨化效應，參與炎癥反應;基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)增加，影響斑塊穩(wěn)定性;上調(diào)清道夫受體表達，促使巨噬細胞攝取ox-LDL，但巨噬細胞無負反饋調(diào)節(jié)〔6〕，泡沫細胞形成進而增多;刺激內(nèi)皮細胞(EC)釋放單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、集落刺激因子(CSF)，促進單核細胞趨化并分化成組織巨噬細胞;抑制局部巨噬細胞遷移;刺激單核細胞/巨噬細胞表達白細胞介素(IL-1β)。以上機制導致了AS的發(fā)生，加劇著疾病的發(fā)展。

本課題發(fā)現(xiàn)泡沫細胞形成后，細胞內(nèi)總TC、游離TC、TC酯、ox-LDL增多、MDA為ROS代表物亦增多，而噻烷二唑酮類藥物羅格列酮(PPAR-γ配體)干預后，上述總TC、游離TC、TC酯、ox-LDL、MDA均減少，泡沫細胞形成減少，這可能為噻烷二唑酮類藥物代表藥物羅格列酮抗AS的機制之一。

1 茍連平，呂 湛，劉 利，等.羅格列酮對THP-1源性泡沫細胞ABCA1、Caveolin-1蛋白水平的影響〔J〕.中國老年學雜志，2010;30(23):3519-20.

2 何菊英，劉松青.一次性密度梯度超速離心分離人血清脂蛋白及無脂血清〔J〕.第三軍醫(yī)大學學報，2002;24(1):46.

3 劉介眉，嚴慶漢，路英奇，等.病理組織染色的理論方法和應用〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，1983:93-4.

4 彭道泉，趙水平，聶 賽，等.載脂蛋白E與過氧化體增殖物激活型受體-γ基因多態(tài)性的相互作用及其與冠心病的關系〔J〕.中華心血管病雜志，2002;30(6):351-5.

5 Junyent M，Gilabert R，Jarauta E，et al.Impact of low-density lipoprotein receptormutational class on carotid atherosclerosis in patients with familial hypercholesterolemia〔J〕.Atherosclerosis，2010;208(2):437-41.

6 呂 湛，陳運貞.過氧化物酶體增殖體活化受體γ、肝臟X受體α、視黃酸X受體α活化對THP-1細胞ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白和CD36mRNA表達的影響〔J〕.中國病理生理雜志，2004;20(8):1381-4.

Effect of rosiglitazone on cholesterol and ox-LDL and malondialdehyde in THP-1-derived foam cells

GOU Lian-Ping，Lü Zhan，HU Hou-Xiang，et al.
Department of Cardiology，Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College，Nanchong 637000，Sichuan，China

Objective To study the effect of rosiglitazone on cholesterol，ox-LDL andmalondialdehyde(MDA)contents in THP-1-derived foam cells and explore the probable mechanism of rosiglitazone on atherosclerosis(AS).M ethods THP-1 cells were cultured.Macrophageswere induced from THP-1 cell by PMA.Model of foam cells were built by incubatingmacrophages with ox-LDL.Foam cells were incubated with 10μmol/L rosiglitazone for 48 h.MDA wasmeasured by TBARS，ox-LDL was detected by ELSIA and cholesterolwas measured by fluorescence spectrophotometricmethod.Results Macrophages incubated with ox-LDL formed into foam cells successfully.The intracellular total cholesterol(TC)，free cholesterol(FC)，cholesteryl ester(CE)，ox-LDL and MDA were increased(all P＜0.05)and these changeswere significantly attenuated by rosiglitazone(P＜0.05).Conclusions The anti-ASeffects of rosiglitazone are related to reducing cholesterol and oxidation.

Rosiglitazone;Foam cells;ox-LDL;Malondialdehyde

R96;R541.4

A

1005-9202(2011)12-2235-03

四川省衛(wèi)生廳資助項目(080114)

呂 湛(1967-)，男，博士，教授，主要從事動脈硬化及心血管介入的基礎與臨床研究。

茍連平(1972-)，男，碩士，副教授，主要從事動脈硬化的基礎與臨床研究。

〔2011-01-04收稿 2011-03-19修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)