何 澤 南 征 李 才 陳 曦 高 蕾 孫勝君

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院糖尿病科，吉林 長春 130021)

中藥解毒通絡(luò)保腎散對實(shí)驗性糖尿病大鼠腎臟基質(zhì)金屬蛋白酶2 mRNA表達(dá)的影響

何 澤 南 征1李 才2陳 曦 高 蕾3孫勝君

(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院糖尿病科，吉林 長春 130021)

目的 探討中藥解毒通絡(luò)保腎散(JDTLBSS)對實(shí)驗性糖尿病(DM)大鼠腎臟組織基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)mRNA表達(dá)的影響。方法 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，檢測分別灌服JDTLBSS、氨基胍(AG)藥物8 w的鏈脲佐菌素(STZ)致DM大鼠腎臟內(nèi)MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA表達(dá)。結(jié)果 在DM狀態(tài)下，大鼠腎臟MMP-2 mRNA呈低表達(dá)狀態(tài)，TIMP-2 mRNA呈高表達(dá)狀態(tài)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA降低;與DM組比，JDTLBSS組和AG組均有提高DM大鼠MMP-2 mRNA表達(dá)，抑制TIMP-2 mRNA表達(dá)，升高M(jìn)MP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA作用，二者作用相當(dāng)。結(jié)論 JDTLBSS對DM大鼠腎臟功能和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用機(jī)制之一可能與其上調(diào)MMP-2 mRNA表達(dá)，下調(diào)TIMP-2 mRNA表達(dá)作用，提高M(jìn)MP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，從而促進(jìn)腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解有關(guān)。

糖尿病腎病;解毒通絡(luò)保腎散;實(shí)驗研究;基質(zhì)金屬蛋白酶2;組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物

糖尿病腎病(DN)的發(fā)生發(fā)展是多因素綜合作用的結(jié)果，腎小球基底膜增厚和以腎小球系膜區(qū)為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚是DN的基本病理特點(diǎn)。ECM積聚是基質(zhì)合成和降解之間失去平衡的結(jié)果?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其組織型基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)在ECM降解中起重要作用。本文前期研究表明，中藥復(fù)方解毒通絡(luò)保腎散(JDTLBSS)能夠改善實(shí)驗性DM大鼠一般狀況，調(diào)節(jié)糖脂代謝，抑制DM大鼠腎臟肥大及高濾過，減少尿蛋白的排出，保護(hù)腎小球結(jié)構(gòu)和功能〔1〕;能夠抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物形成，減少其介導(dǎo)的腎組織損傷〔2〕。本實(shí)驗從分子水平觀察該中藥復(fù)方對鏈脲佐菌素(STZ)致DM大鼠腎臟ECM降解機(jī)制的影響，以探討JDTLBSS的深層次療效作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠55只，體重170～200 g，由吉林省實(shí)驗動物中心提供。飼料為常規(guī)大鼠飼料。實(shí)驗期間大鼠自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，取尿糖、尿蛋白陰性的健康狀況良好的動物為實(shí)驗對象。

1.2 主要試劑和藥品 JDTLBSS(長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心);氨基胍(AG)和STZ(Sigma);逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV)、Oliga Dt引物、RNA酶抑制劑(Rnasin)、四種 dNTP混合液(10 mmol/L)(Promega);TaqDNA聚合酶/10×Taq酶緩沖液、10×PCR緩沖液(上海生工生物工程公司);異硫氰酸胍(Promega);焦碳酸二乙酯(DEPC)、十二烷基肌氨酸鈉、溴化乙錠(Sigma);DNA 標(biāo)尺，DL-2000(Takara)。

1.3 主要設(shè)備 醫(yī)用離心機(jī)(北京);PCR儀(Ferotec，杭州大和)，臺式冷凍離心機(jī)(Hesmal，德國)，電泳儀(Mini-gel，日本)，電泳槽、恒溫水域箱、紫外分光光度計，紫外檢測儀(手提式紫外燈)，凝膠圖像處理系統(tǒng)(Tamon GIS-1000，上海)。

1.4 實(shí)驗動物模型的復(fù)制與分組 動物禁食12 h，按體重隨機(jī)分為2組，即正常對照組(CN，n=10)，DM模型復(fù)制組45只。DM大鼠模型復(fù)制:用50 mg/kg STZ(臨用前用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解，pH4.3)單次腹腔注射。另一組僅腹腔注射上述等體積緩沖液作為對照組。注射STZ 3 d后測尿糖和血糖，尿糖+++以上，血糖水平不低于16.7 mmol/L，尿量和飲水量明顯增多者，列入DM觀察對象，共36只。將其分為三組:①DM組(DM，n=12)，②JDTLBSS處理的 DM 組(DM+J，n=12)，③AG處理的DM 組(DM+A，n=12)。DM+J組每日上午灌服JDTLBSS濃縮液2 g/kg，DM+A組每日上午灌服AG 40 mg/kg，DM組灌胃等體積水。

1.5 腎臟標(biāo)本及腎組織勻漿制備 所有實(shí)驗動物自由進(jìn)食和飲水，大鼠單籠飼養(yǎng)，每3天量體重，并觀察一般狀態(tài)。8 w末實(shí)驗結(jié)束，處死動物，快速切除腎臟，濾紙吸干，去掉包膜，用精密天平即刻稱重。取正常組、DM組、DM+A組、DM+J組的大鼠腎臟組織，用生理鹽水沖洗，剪取腎組織后稱重，按1∶9濃度(W∶V=1 g∶9 m l)加入勻漿介質(zhì)，用電動玻璃勻漿器在4℃條件下制備組織勻漿。3 000 r/min離心20 min，吸取上清液保存于－70℃冰箱。

1.6 PCR引物 由上海生工生物工程公司提供(美國PE公司391型DNA自動合成儀合成)。MMP-2正義鏈引物5'-TGG GCA ACA AAT ATG AGA GC-3';反義鏈引物5'-CGG CATCCA GGT TATCGGGG-3';MMP-2擴(kuò)增產(chǎn)物全長791 bp。TIMP-2正義鏈引物5'-GTG GAC TCTGAG AACGAC AT-3';反義鏈引物5'-CCA GGA AGG GATGTC AGA GC-3';TIMP-2擴(kuò)增產(chǎn)物全長583 bp。β-actin正義鏈引物5'-GCC CAG AGC AAG AGA GGC AT-3';反義鏈引物 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GT-3';β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物全長513 bp。

1.7 腎臟組織 MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA表達(dá)含量及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值檢測 采用RT-PCR方法測定。結(jié)果分析利用天能凝膠成像處理系統(tǒng)內(nèi)部軟件對每一樣品PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的特異性片段(MMP-2、TIMP-2和β-actin)進(jìn)行密度掃描，以β-actin密度作為參考定量標(biāo)準(zhǔn)，分別計算MMP-2、TIMP-2和β-actin密度比值作為定量結(jié)果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，均數(shù)差異顯著性用方差分析檢驗。

2 結(jié)果

與CN組相比，DM組MMP-2 mRNA呈低表達(dá)狀態(tài)(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈高表達(dá)狀態(tài)(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA變小;DM+A組、DM+J組MMP-2 mRNA呈高表達(dá)狀態(tài)(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈低表達(dá)狀態(tài)(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值變大(P＜0.01)。與DM組比較，DM+A組、DM+J組MMP-2 mRNA呈高表達(dá)狀態(tài)(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈低表達(dá)狀態(tài)(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值變大(P＜0.01)。與DM+A組比較，DM+J組MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA均無顯著差異(P＞0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 大鼠腎臟MMP-2 m RNA、TIMP-2 m RNA相對值及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值比較(±s)

表1 大鼠腎臟MMP-2 m RNA、TIMP-2 m RNA相對值及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值比較(±s)

與CN組比較:1)P＜0.01;與DM組比較:2)P＜0.01

組別 n MMP-2 mRNA TIMP-2 mRNA MMP-2 mRNA/10 0.70±0.05 0.69±0.03 1.03±0.05 DM組 9 0.49±0.071) 0.78±0.061) 0.77±0.081)DM+A組10 0.81±0.051)2) 0.51±0.071)2) 1.60±0.091)2)DM+J組 10 0.82±0.031)2) 0.48±0.021)2) 1.69±0.041)2)TIMP-2 mRNA CN組

圖1 各組大鼠MMP-2 m RNA/β-actin表達(dá)半定量分析

圖2 各組大鼠TIMP-2 m RNA/β-actin表達(dá)半定量分析

3 討論

合成增加和降解減慢二者共同作用使ECM積聚，從而導(dǎo)致腎小球結(jié)構(gòu)和功能變化，最終導(dǎo)致腎小球硬化。MMPs系統(tǒng)是一類依賴金屬離子鋅并以ECM成分為水解底物的蛋白水解酶，是ECM的主要降解酶系統(tǒng)，MMPs活性受其抑制物TIMPs的調(diào)節(jié)，兩者的活性及它們之間的協(xié)調(diào)作用也是決定ECM降解的重要環(huán)節(jié)〔3〕。在腎小球和系膜細(xì)胞，MMP-2占優(yōu)勢，其主要抑制物為TIMP-2〔4〕。MMP-2主要水解底物是變性膠原及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原等，但對間質(zhì)膠原無作用。MMP-2可以分解纖維黏連蛋白和層黏連蛋白?？梢奙MP-2為腎小球ECM主要降解酶，與DN腎臟病變的關(guān)系密切。如何選擇有效的藥物改善和糾正腎小球ECM積聚是當(dāng)前DN防治中急需解決的問題。

有關(guān)中醫(yī)藥對MMPs的調(diào)節(jié)作用較少報道。研究結(jié)果表明，與正常對照組大鼠比較，STZ誘發(fā)的DM大鼠腎皮質(zhì)MMP-2 mRNA表達(dá)減少，TIMP-2 mRNA表達(dá)上調(diào)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值明顯下降，提示在DM情況下，腎小球ECM降解程度降低〔5〕。本實(shí)驗結(jié)果顯示在DM狀態(tài)下，大鼠腎臟MMP-2 mRNA呈低表達(dá)狀態(tài)，而TIMP-2 mRNA呈高表達(dá)狀態(tài)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA降低;JDTLBSS對DM大鼠腎臟功能和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用機(jī)制之一可能與其上調(diào)MMP-2 mRNA表達(dá)，下調(diào) TIMP-2 mRNA表達(dá)，提高 MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，促進(jìn)腎小球ECM的降解有關(guān)。

JDTLBSS作為臨床治療DN有效處方，不僅能保護(hù)腎功能，抑制蛋白非酶糖化，而且對ECM降解酶MMP-2有一定的調(diào)節(jié)作用，這為臨床上應(yīng)用中藥復(fù)方防治腎小球硬化提供了新的實(shí)驗基礎(chǔ)，也一定程度上為尋找中藥防治腎小球硬化提供了新的研究思路。JDTLBSS對DM大鼠腎臟功能和結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用機(jī)制之一可能與其上調(diào) MMP-2 mRNA表達(dá)，下調(diào) TIMP-2 mRNA表達(dá)作用，提高M(jìn)MP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，從而促進(jìn)腎小球ECM的降解有關(guān)，由于條件限制，本研究樣本數(shù)少，時間短，有待進(jìn)一步深入研究。

1 何 澤，南 征.解毒通絡(luò)保腎散對實(shí)驗性糖尿病大鼠腎臟功能和結(jié)構(gòu)的影響〔J〕.中國實(shí)用醫(yī)藥，2009;4(20):159-60.

2 何 澤，南 征，李 才.解毒通絡(luò)保腎散對晚期糖基化終末產(chǎn)物腎毒性影響的實(shí)驗研究〔J〕.長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009;25(4):480-2.

3 Rankin CA，Suzuki K，Itoh Y，et al.Matrixmetalloproteinases and TIMPs in cultured C57BL/6J-cpk kidney tubules〔J〕.Kidney Int，1996;50(3):835-44.

4 Strongin AY，Collier I，Bannikov G，etal.Mechanism of cell surface activation of 72-KDa type Ⅳ collagenase，isolation of the activated from of the membranemetalloproteinase〔J〕.JBiol Chem，1995;270(10):5331-8.

5 于曉艷，李 才，何 澤，等.糖基化終末產(chǎn)物對大鼠腎皮質(zhì)基質(zhì)金屬蛋白酶2活性和表達(dá)的影響〔J〕.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2003;19(5):402-5.

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A

1005-9202(2011)12-2231-03

1 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中醫(yī)研究所

2 吉林大學(xué)再生醫(yī)學(xué)研究所 3 長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肝脾胃病科第一作者:何 澤(1969-)，男，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)治療糖尿病及其并發(fā)癥的研究。

〔2010-10-12收稿 2011-02-12修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)