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        IL-22對人氣道細胞的作用

        2011-02-01 08:01:54藍海兵周麗麗賴文巖黎振興任敦強鐘浩海羅雅玲
        中國老年學雜志 2011年12期
        關(guān)鍵詞:血清

        張 旃 藍海兵 周麗麗 賴文巖 徐 建 黎振興 任敦強 葉 涵 鐘浩海 羅雅玲

        (南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣東 廣州 510515)

        IL-22對人氣道細胞的作用

        張 旃 藍海兵 周麗麗1賴文巖2徐 建3黎振興 任敦強 葉 涵 鐘浩海 羅雅玲

        (南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院呼吸內(nèi)科,廣東 廣州 510515)

        目的 探討IL-22對人氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞、氣道成纖維細胞的生理學作用。方法 用實時定量PCR檢測氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞、氣道成纖維細胞哮喘血清刺激前后IL-22R1 mRNA表達的變化。不同濃度的IL-22(10 ng/ml,100 ng/ml,1 000 ng/ml)刺激氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞和氣道成纖維細胞后,用MTT法檢測細胞的增殖,用流式細胞技術(shù)(FACS)檢測細胞的凋亡和壞死。結(jié)果 哮喘血清刺激后氣道上皮細胞IL-22R1 mRNA表達降至正常對照組的9%,氣道平滑肌細胞IL-22R1 mRNA表達升高至正常對照組的345倍,而氣道成纖維細胞IL-22R1 mRNA表達無明顯變化。高劑量(1 000 ng/ml)的IL-22刺激氣道上皮細胞和氣道成纖維細胞12、24 h可顯著降低細胞增殖(P<0.05,P<0.01)。三種不同濃度的IL-22刺激氣道上皮細胞24 h后均導致細胞凋亡顯著下降(P<0.05),低濃度的IL-22(10 ng/ml)導致細胞壞死增加(P<0.01)。不同濃度的IL-22刺激氣道平滑肌細胞后,細胞凋亡和壞死無顯著性變化。中、高濃度IL-22(100 ng/ml,1 000 ng/ml)刺激氣道成纖維細胞后,細胞壞死率顯著下降(P<0.05)。結(jié)論 IL-22在支氣管哮喘中對氣道上皮的作用具有雙重性,并與支氣管哮喘的病程相關(guān);而對氣道平滑肌細胞的作用則可能與濃度及病程相關(guān)。支氣管哮喘后續(xù)階段,IL-22對氣道成纖維細胞作用輕微。

        白細胞介素-22;氣道上皮細胞;氣道平滑肌細胞;氣道成纖維細胞

        白細胞介素-22(IL-22)與呼吸系統(tǒng)疾病密切相關(guān),能增加肺上皮細胞的增殖及對抗經(jīng)上皮的損傷〔1〕。在呼吸機相關(guān)的肺損傷中IL-22通過增加肺泡上皮細胞的抵抗性,防止細胞拉伸和肺損傷,因而吸入IL-22對高壓通氣導致的肺損傷具有保護作用〔2〕。產(chǎn)生IL-22的Th17細胞同時也產(chǎn)生IL-17,而IL-17涉及支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展〔3,4〕,且Th17細胞也與支氣管哮喘密切相關(guān)〔5〕,因而推測IL-22也與支氣管哮喘相關(guān)聯(lián)。資料顯示氣道上皮參與IL-22對呼吸系統(tǒng)疾病產(chǎn)生的作用〔6〕。此外,重度過敏性哮喘患者的血清IL-22水平呈增高趨勢〔7〕。而近來有報道顯示IL-22能夠誘導人氣道平滑肌細胞遷移〔8〕,顯然IL-22在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展中能夠?qū)獾榔交‘a(chǎn)生一定的作用。支氣管哮喘患者的氣道重構(gòu)有多種間質(zhì)細胞參與,本文前期的研究顯示在人氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞以及氣道成纖維細胞均有IL-22R1受體的表達,因而這些細胞是IL-22在氣道的靶細胞。本實驗通過不同濃度的IL-22刺激人氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞、氣道成纖維細胞,觀察IL-22對這些細胞增殖及凋亡壞死的影響。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 主要試劑 Trizol(Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(晶美公司);SYBR Green試劑盒(NEB公司);IL-22R1一抗(eBIOSCIENCE公司,種屬來源:兔);β-actin一抗(Santa Cruz公司,種屬來源:小鼠);抗α-actin(北京博奧森,種屬來源:兔);重組人 IL-4(晶美公司);γ-干擾素(IFN-γ)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)(Sigma公司)。

        1.1.2 細胞來源 正常人支氣管上皮細胞株HBE135-E6E7(美國ATCC,CRL-2741TM);人胚肺成纖維細胞株MRC-5(購自中國科學院上海細胞生物學研究所);正常人支氣管平滑肌細胞由南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院呼吸內(nèi)科羅雅玲實驗室黎振興贈送。

        1.1.3 哮喘血清 經(jīng)患者同意,從南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院呼吸門診重度哮喘患者(男2例,女4例)提取血清(抗原皮試試驗陽性,IgE>1 000 U/ml),近期均未用過激素。取全血樣品,37℃溫浴1 h,1 500 r/min,離心 10 min,在超凈臺內(nèi)無菌環(huán)境下提取上清,-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2 方法

        1.2.1 細胞分組準備 0.125%胰酶消化,按1∶2比例傳代至4~8代,換成無血清DMEM培養(yǎng)基,另補充胰島素1 U/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白5μmol/L和TGF-β15 mg/L培養(yǎng)24 h后,實驗組分別加入10%哮喘血清,10%哮喘血清 +地塞米松(10 nmol/L),IL-4(10 ng/m l),IFN-γ(10 ng/m l),TGF-β(10 ng/ml),繼續(xù)孵育24 h。收集六孔板細胞提取RNA或蛋白。

        1.2.2 實時PCR檢測人氣道細胞IL-22R1 mRNA的表達

        1.2.2.1 引物、探針的合成 IL-22R1基因引物序列:上游5'-CCCCACTGGGACACTTTCTA-3'(20 bp),下游 5'-TGGCCCTTTAGGTACTGTGG-3'(20 bp)〔9〕。內(nèi)參基因 GAPDH 引物序列:上游 5'-TTCGACAGTCAGCCGCATCTT-3'(±21 bp),下游 5'-ATCCGTTGACTCCGACCTTCA-3'(21 bp)。引物由Invitrogen公司合成。

        1.2.2.2 細胞總RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄反應 按Trizol試劑盒提供的操作步驟提取各組細胞的RNA,-70℃保存,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的操作步驟合成cDNA(-20℃保存)。將得到的PCR產(chǎn)物進行跑膠,回收純化,計算濃度及純度。

        1.2.3 免疫熒光PCR 采用Sybrgreen染料法,按照試劑說明書配好反應體系,制備標準曲線后,將每個樣本重復3次,上機(7000 real-time PCR System,ABI)。反應體系及條件如下:Mix+Sybr 10 μl,F(xiàn) 4P 2 μl,R4P 2 μl,H2O 5 μl,模板1 μl,總量20 μl,擴增條件:95℃ 2 min,94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃ 45 s,40個循環(huán)。

        1.2.4 結(jié)果分析 以GAPDH為內(nèi)參校準基因,對比IL-22R1基因的擴增效率,以人氣道平滑肌細胞組為對照樣品,每個樣品中IL-22R1基因相對于對照樣品的表達量,以2-△△Ct值表示(Ct值代表到達檢測熒光閾值的循環(huán)數(shù))。

        1.2.5 噻唑藍(MTT)法檢測細胞增殖

        1.2.5.1 細胞培養(yǎng)與傳代 所有細胞均貼壁培養(yǎng)于10 m l完全培養(yǎng)液細胞培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細胞長滿瓶底后用滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次,加0.25%胰蛋白酶消化1 min,倒掉胰蛋白酶,待輕搖細胞能完全脫落后,加完全培養(yǎng)基30 m l,用移液管吹散細胞,分裝于3個新的細胞培養(yǎng)瓶中,繼續(xù)培養(yǎng)。

        1.2.5.2 細胞刺激處理 待細胞長滿后,取其中一瓶,胰蛋白酶消化后收集細胞,用移液管吹打均勻,取兩滴細胞懸液用臺盼藍染色,于顯微鏡下計數(shù)活細胞數(shù)目,以每孔10 000個細胞接種到96孔板,每孔體積200μl。將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞貼壁后換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,使細胞同步化于G0期。取出培養(yǎng)板后棄去無血清培養(yǎng)基,加入含不同濃度IL-22的完全培養(yǎng)液,使 IL-22終濃度分別為:1 000 ng/ml,100 ng/ml,10 ng/ml。每個濃度設(shè)3個復孔,另設(shè)3孔細胞加入不含IL-22的完全培養(yǎng)液作陰性對照孔。置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。刺激結(jié)束后,每孔加入5 mg/ml MTT 20μl,振蕩混勻,于37℃、5%CO2繼續(xù)孵育 4 h,小心吸棄上清,每孔加150μl二甲基亞砜(DMSO),振蕩10 min,使結(jié)晶物充分融解。選擇492 nm波長于Bio-Tek酶標儀上測定各孔光吸收值。

        1.2.6 流式細胞術(shù)(FACS)測細胞凋亡及壞死 臺盼藍記數(shù)細胞活力>95%的氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞和成纖維細胞以106/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板,細胞貼壁后換無血清1640或DMEM培養(yǎng)基24 h,使細胞同步于 G0期。分別以0,10,100,1 000 ng/ml IL-22刺激24 h,設(shè)3復孔。刺激結(jié)束以無二乙胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶收集上清和底壁細胞。2 000 r/min,離心5 min。沉淀以無菌PBS洗,2 000 r/min,離心5 min。重復2次。沉淀以200μl binding緩沖液重懸。加入2μl AnnexinV-EGFP,5μl碘化丙啶(PI)。流式細胞儀檢測凋亡率。

        1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS16.0軟件進行比較分析,統(tǒng)計數(shù)據(jù)用±s表示,多組間比較用單因素方差(ONE-WAY ANOVA)分析,組間兩兩比較用LSD法。

        2 結(jié)果

        2.1 氣道細胞在10%哮喘血清刺激后IL-22R1 mRNA的表達變化 哮喘血清刺激后的氣道上皮細胞IL-22R1mRNA表達明顯下降,僅為對照細胞表達的9%;而氣道平滑肌細胞經(jīng)哮喘血清刺激后IL-22R1 mRNA表達顯著性上升,為對照組氣道平滑肌細胞的345倍;但氣道成纖維細胞在哮喘血清刺激前后IL-22R1 mRNA表達無明顯變化。

        2.2 MTT檢測人氣道細胞增殖 高濃度IL-22(1 000 ng/ml)作用人氣道上皮細胞平滑肌細胞12、24 h后與對照組相比較,細胞OD值顯著性下降(P<0.01,P<0.05),高濃度IL-22作用細胞6 h細胞增殖無顯著性差異(P>0.05)。中、低濃度的IL-22(10 ng/m l,100 ng/ml)作用細胞后 6、12、24 h,氣道上皮細胞增殖呈下降趨勢,而氣道平滑肌細胞增殖呈增高趨勢,但差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同濃度的IL-22作用于人氣道成纖維細胞6、12 h或24 h后,細胞增殖與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)。見圖1。

        2.3 流式細胞術(shù)觀察不同濃度IL-22刺激下氣道細胞凋亡及壞死百分比 不同濃度的IL-22刺激時氣道上皮細胞凋亡率顯著下降(P<0.05),低劑量的IL-22(10 ng/ml)作用細胞時壞死率顯著升高(P <0.01),中、高濃度(100 ng/ml,1 000 ng/m l)的IL-22刺激下的氣道上皮細胞壞死率呈增高趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不同濃度的IL-22(10 ng/m l、100 ng/m l、1 000 ng/ml)刺激氣道平滑肌細胞后凋亡率及細胞壞死率無顯著性差異(P>0.05)。不同濃度的IL-22刺激氣道成纖維細胞后細胞凋亡率無顯著性改變(P>0.05)。中、高濃度 IL-22(100 ng/m l,1 000 ng/ml)刺激成纖維細胞后細胞壞死率顯著下降(P<0.05),低濃度的IL-22(10 ng/ml)作用后成纖維細胞壞死率呈下降趨勢,但差異無統(tǒng)計學意義。見表1~表3。

        圖1 不同濃度IL-22刺激人氣道細胞不同時間點的OD值

        表1 不同濃度IL-22刺激下氣道上皮細胞各成分百分比(±s,%)

        表1 不同濃度IL-22刺激下氣道上皮細胞各成分百分比(±s,%)

        與 IL-22 0 ng/ml組比較:1)P <0.05,2)P <0.01,下表同

        74.27±2.55 12.73±1.25 0.27±0.06 IL-22 10 ng/ml組 82.07±1.25 8.50±0.731) 0.9±0.262)IL-22 100 ng/ml組 82.07±1.25 8.07±0.91) 1.20±0.662)IL-22 1 000 ng/ml組 80.43±1.75 9.10±1.301) 1.33±0.902)組別 正常 凋亡 壞死IL-22 0 ng/ml組

        表2 不同濃度IL-22刺激下氣道平滑肌細胞各成分百分比(±s,%)

        表2 不同濃度IL-22刺激下氣道平滑肌細胞各成分百分比(±s,%)

        72.47±2.45 13.28±1.40 1±0.30 IL-22 10 ng/m l組 75.37±1.45 11.35±0.38 1.93±0.70 IL-22 100 ng/ml組 71.83±2.57 13.33±1.56 1.53±0.60 IL-22 1 000 ng/ml組組別 正常 凋亡 壞死IL-22 0 ng/ml組78.57±3.75 10.13±1.80 1.17±0.15

        表3 不同濃度IL-22刺激下氣道成纖維細胞各成分百分比(±s,%)

        表3 不同濃度IL-22刺激下氣道成纖維細胞各成分百分比(±s,%)

        44.07±3.45 25.18±2.95 5.53±2.40 IL-22 10 ng/m l組 50.77±7.06 23.55±3.88 2.13±0.70 IL-22 100 ng/ml組 52.87±2.30 22.83±0.93 1.47±0.451)IL-22 1 000 ng/ml組 53.23±0.25 22.55±0.20 1.67±0.061)組別 正常 凋亡 壞死IL-22 0 ng/ml組

        3 討論

        IL-22最初被描述為一種IL-10相關(guān)的T細胞來源的誘導因子(IL-TIF),屬于IL-10家族。最初認為產(chǎn)生IL-22的輔助性T淋巴細胞(Th)細胞是一種Th17細胞的變體〔10〕,但近來報道顯示除了 Th17 細胞外,其他細胞如 Th22〔11〕、Th1、γδT 細胞(10-12)、經(jīng)典的和非經(jīng)典的自然殺傷(NK)細胞以及CD11c+細胞均可以產(chǎn)生 IL-22〔12~15,1〕,但不包括組織細胞〔16~18〕。支氣管哮喘患者氣道上皮細胞屏障破壞,上皮細胞或壞死脫落,或細胞受損導致一些生長因子如上皮生長因子(EGF)、血小板來源生長因子(PDGF)釋放、TGF-β、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及乙酰膽堿釋放,從而促進包括氣道平滑肌細胞增生、細胞外基質(zhì)沉積、血管再生在內(nèi)的氣管壁重構(gòu)〔19〕。數(shù)據(jù)顯示IL-22對人氣道上皮細胞的增殖具有抑制作用,并能使細胞凋亡,壞死增加。Besnard等人發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,IL-22缺失的小鼠過敏性氣道炎癥顯著下降,伴隨著嗜酸性粒細胞聚集下降和炎性細胞因子顯著下降。此外,野生型小鼠在致敏階段注入IL-22抗體可以減弱肺部過敏性炎癥。且資料顯示過敏性哮喘患者血清中IL-22水平增高。綜合這些數(shù)據(jù)表明IL-22可能促進了支氣管哮喘氣道炎癥的發(fā)生,并且通過氣道上皮細胞發(fā)揮一定的作用。

        哮喘血清刺激后的人氣道上皮細胞IL-22R1mRNA表達顯著降低,僅為對照組細胞的9%,顯示出哮喘血清通過降低人氣道上皮細胞對IL-22的敏感性,減少IL-22對氣道上皮細胞的作用,提示IL-22在支氣管哮喘的過程中對氣道上皮具有保護作用。研究者將IL-22抗體中和劑注入卵清蛋白(OVA)致敏后的OVA刺激階段的過敏性哮喘小鼠,發(fā)現(xiàn)氣道炎癥加重了,而給予重組IL-22則能防止肺部炎癥。此外一份近來的研究顯示IL-22可防止博萊霉素誘導的凋亡〔6〕。這些資料表明IL-22具有組織保護作用,這似乎表明IL-22在實驗中顯示出對氣道上皮乃至對支氣管哮喘的雙重作用,認為這可能與支氣管哮喘的病程即啟動階段或持續(xù)階段、氣道上皮的狀態(tài)即生理狀態(tài)或是病理狀態(tài)相關(guān)。在支氣管哮喘疾病的啟動階段,抑制氣道上皮細胞凋亡,促進氣道上皮細胞壞死,抑制細胞增殖修復,從而促進氣道炎癥的發(fā)生;而在支氣管哮喘的后續(xù)狀態(tài)則可能具有組織保護作用。

        本實驗結(jié)果顯示高濃度的IL-22顯著抑制人氣道平滑肌細胞增殖,而中低濃度的IL-22作用后,氣道平滑肌細胞的增殖呈增高趨勢,這提示IL-22對人氣道平滑肌細胞的增殖作用可能具有濃度依賴性。IL-22作用人氣道平滑肌細胞后細胞凋亡和壞死無顯著性變化,表明IL-22可能沒有參與人氣道平滑肌細胞的凋亡和壞死程序。有趣的是,與氣道上皮細胞顯然不同,哮喘血清刺激下的氣道平滑肌細胞IL-22R1mRNA表達顯著上升。這提示支氣管哮喘的啟動階段,IL-22很可能通過釋放不同濃度來發(fā)揮其對氣道平滑肌細胞的作用;而在支氣管哮喘的后續(xù)階段,IL-22的濃度可能下降,這時IL-22很可能通過氣道平滑肌細胞IL-22R1對IL-22敏感性發(fā)生變化來調(diào)節(jié)其對氣道平滑肌的作用。在氣道成纖維細胞,中、高濃度的IL-22能顯著降低細胞壞死率。由此推測在氣道成纖維細胞,IL-22可能更多的是一種保護因子。然而直接用IL-22刺激后發(fā)現(xiàn)細胞增殖無統(tǒng)計學差異,且人氣道成纖維細胞在IL-22刺激后細胞凋亡無顯著性變化;此外,哮喘血清刺激后氣道成纖維細胞IL-22R1 mRNA的表達未顯示出任何變化,因而推測支氣管哮喘后續(xù)階段,IL-22對氣道成纖維細胞作用輕微。

        總之,哮喘血清刺激下的氣道上皮細胞、氣道平滑肌細胞IL-22R1 mRNA表達變化明顯,由此推測IL-22在支氣管哮喘中的作用是通過氣道上皮細胞和氣道平滑肌來完成。IL-22在支氣管哮喘中對氣道上皮的作用具有雙重性,并與支氣管哮喘的病程相關(guān);而對氣道平滑肌細胞的作用則可能與濃度及病程相關(guān)。支氣管哮喘后續(xù)階段,IL-22對氣道成纖維細胞作用輕微。

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        19 Dekkers BG,Maarsingh H,Meurs H,etal.Airway structural components drive airway smooth muscle remodeling in asthma〔J〕.Proc Am Thorac Soc,2009;6(8):683-92.

        The effect of IL-22 on hum an airway structural cell

        ZHANG Zhan,LAN Hai-Bing,ZHOU Li-Li,et al.
        Department of Respiratory Disease,Nanfang Hospital,Southern M edical University,Guangzhou 510515,Guangdong,China

        Objective To study the role of IL-22 on human airway epithelial cells,airway smooth muscle cell and airway fibroblasts.M ethods IL-22R1 mRNA of the above three cells in different groups weremeasured by real-time PCR.Cell proliferation of such three cellswere stimulated by IL-22 of different concentrations in different groups weremeasured by MTT assay.Cell apoptosis and necrosis in the above group weremeasured by FACS.Results IL-22 mRNA of airway epithelial cells stimulated by asthmatic sera was significantly reduced,while airway smoothmuscle cellswas increased to 345 times of control group.Therewas not difference between treatmentand control groups of airway fibroblasts.Cell proliferation was decreased in airway epithelial cells and airway smooth muscle cells in 1 000 g/m l IL-22 group(P<0.05).IL-22 significantly reduced cell apoptosis and 10 ng/ml IL-22 increased cell necrosis in airway epithelial cells(P<0.01).There were not significant difference of cell apoptosis and necrosis among different groups of airway smoothmuscle cells.Cell necrosis were significantly reduced in airway fibroblast stimulated by 100 ng/ml and 1 000 ng/m l IL-22(P<0.05).Conclusions IL-22 has a dual role on airway epithelial cells in asthma pathologic process.The role of IL-22 on airway smoothmuscle cellsmaybe related to IL-22 concentration and disease course.The role of IL-22 on airway fibroblastsmay be very mild to asthma.

        IL-22R1;IL-22;Human airway epithelial cells;Human airway smooth muscle cell;Human airway fibroblasts;Cell proliferation;Cell apoptosis;Cell necrosis

        R33

        A

        1005-9202(2011)12-2222-04

        國家自然科學基金資助項目(No.30770936)

        1 腎內(nèi)科 2 心血管內(nèi)科重點實驗室 3 腎移植科

        羅雅玲(1946-),女,教授,主任醫(yī)師,主要從事呼吸系統(tǒng)哮喘病學研究。

        張 旃(1974-),女,在讀博士,主要從事呼吸系統(tǒng)哮喘病學研究。

        〔2011-04-11收稿 2011-04-22修回〕

        (編輯 袁左鳴/徐 杰)

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