趙東杰，王 峻，何炳榮

銀杏葉提取物對(duì)白介素-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3和TIMP-1的影響

趙東杰，王 峻，何炳榮

目的：觀(guān)察銀杏葉提取物對(duì)白介素-1β?lián)p傷的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的作用及對(duì)MMP-3、TIMP-1的影響。方法：在無(wú)菌環(huán)境下消化得到3個(gè)月齡雌性新西蘭白兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，用第2代軟骨細(xì)胞。軟骨細(xì)胞與IL-1β（5 μg/L）、IL-1β（5 μg/L）加地塞米松（10-6mmol/L）、IL-1β（5 μg/L）加銀杏葉提取物（40 mg、80 mg、160 mg/L）共同孵育，24 h后ELISA測(cè)定受損傷軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的MMP-3及TIMP-1。結(jié)果：損傷后的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中的MMP-3增多，TIMP-1分泌較少。地塞米松同銀杏葉提取物均可對(duì)抗IL-1β的效應(yīng)，銀杏葉提取物的這種效應(yīng)有劑量依賴(lài)性。結(jié)論：銀杏葉提取物通過(guò)調(diào)節(jié)受損傷后軟骨細(xì)胞MMP-3和TIMP-1生成，保護(hù)IL-1β?lián)p傷的膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。

銀杏葉提取物；骨關(guān)節(jié)炎；基質(zhì)金屬蛋白酶；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑

銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，EGb）具有抗氧化、清除氧自由基、改善細(xì)胞代謝多方面作用,廣泛應(yīng)用于抗衰老和心腦血管疾病的治療和保健。臨床應(yīng)用可改善部分老年骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者的癥狀。本實(shí)驗(yàn)選用EGb干預(yù)白介素-1β（interleukin-1，IL-1）損傷的兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，通過(guò)觀(guān)察基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tis-sue type inhibitors of metalloproteinases，TIMPs)的變化探討其抗OA機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物 雌性3個(gè)月齡新西蘭白兔1只（浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK（浙）2007-0099號(hào)）。1.2 主要試劑及設(shè)備 DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；新生牛血清（北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司）；無(wú)鈣鎂磷酸緩沖液（PBS）；青霉素-鏈霉素液（p/s）；胰蛋白酶（Sigma公司）；II型膠原酶（Invitrogen公司）；重組大鼠白介素-1β（IL-1β，Sigma公司）；銀杏葉提取物注射液（金納多注射液，德國(guó)威瑪舒培博士藥廠(chǎng)，Ginkgo biloba Extract761，EGb761）；地塞米松磷酸鈉注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司）；噻唑藍(lán)（MTT，Thiazolyl blue，Genview公司）；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250(USA，F(xiàn)luka公司)，兔基質(zhì)金屬蛋白酶-3酶聯(lián)免疫試劑盒；兔基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子-1酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)ADL進(jìn)口分裝)。

CO2恒溫孵育箱（美國(guó)NAPCO公司)、超凈工作臺(tái)(上海凈化設(shè)備廠(chǎng))，IMT-2B型倒置顯微鏡（日本Olympus公司)、酶標(biāo)比色儀（美國(guó)BIO-RAD公司)、721可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng)[1]雌性3個(gè)月齡新西蘭兔過(guò)量戊巴比妥鈉靜脈注射，處死后在半無(wú)菌條件下打開(kāi)膝關(guān)節(jié)。用無(wú)菌解剖刀從關(guān)節(jié)面小心取出所用關(guān)節(jié)軟骨，分別由0.25%的胰蛋白酶溶液及0.02%II型膠原酶溶液消化獲得原代軟骨細(xì)胞。72 h后更換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層的80%～100%后傳代培養(yǎng)。以組織化學(xué)甲苯胺藍(lán)染色法檢測(cè)，培養(yǎng)物的細(xì)胞外基質(zhì)部分若存在酸性糖胺多糖則呈異染性，呈藍(lán)色、紫紅色，據(jù)此鑒定軟骨細(xì)胞的表型(見(jiàn)圖1)。

圖1 原代軟骨細(xì)胞甲苯氨藍(lán)染色鑒定，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞呈異染性（×400）

1.3.2 銀杏葉提取物對(duì)白介素-1β?lián)p傷軟骨細(xì)胞MMP-3及TIMP-1的影響 取生長(zhǎng)良好第2代的軟骨細(xì)胞，在培養(yǎng)液中配成1×105/mL濃度，接種96孔培養(yǎng)板中，每個(gè)培養(yǎng)孔100 μL，置于體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層的80%以上，棄去培養(yǎng)液及未貼壁的細(xì)胞。分別加入含IL-1β和藥物的含血清培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)時(shí)每孔加至180 μL。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組如下：⑴正常軟骨細(xì)胞組，加入普通培養(yǎng)液。⑵IL-1β組，按濃度5 μg/L加入IL-1β。⑶IL-1β（5 μg/L）加地塞米松10-6mmol/L。⑷IL-1β（5 μg/L）加銀杏葉提取物（40 mg 、80 mg、160 mg/L）。每組6個(gè)平行樣本。培養(yǎng)24 h后吸出各組培養(yǎng)液按試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定MMP-3及TIMP-1含量。

2 結(jié)果

2.1 受試組軟骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 倒置相差顯微鏡觀(guān)察下，IL-1β組軟骨細(xì)胞分布松散，生長(zhǎng)較其他組的細(xì)胞慢，部分細(xì)胞變圓、皺縮，細(xì)胞活力下降。地塞米松組細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力較IL-1β組好，變圓、皺縮的細(xì)胞明顯減少，但不及正常組和銀杏葉提取物組。銀杏葉提取物組呈劑量依賴(lài)性的增加細(xì)胞的活力，其中高劑量組的細(xì)胞生長(zhǎng)同正常組相似（見(jiàn)圖2）。

圖2 正常組、IL-1β組、地塞米松組（10-6mmol/L）、銀杏葉提取物高劑量組（160 mg/L）軟骨細(xì)胞形態(tài)（×400）

2.2 銀杏葉提取物對(duì)IL-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3、TIMP-1的影響 IL-1β作用軟骨細(xì)胞后MMP-3分泌顯著增多，TIMP-1分泌顯著減少（P＜0.01）；EGb能對(duì)抗IL-1β的這種效應(yīng)，并呈劑量依賴(lài)性；地塞米松也有同樣的效應(yīng)（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 EGb對(duì)IL-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3和TIMP-1分泌的影響（±s，n=6）

表1 EGb對(duì)IL-1β?lián)p傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3和TIMP-1分泌的影響（±s，n=6）

注：與正常組比較，﹡P＜0.01；與IL-1β組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與銀杏葉提取物80 mg/L組比較，☆P＜0.01

正常組IL-1β組地塞米松10-6mmol/L銀杏葉提取物40 mg/L銀杏葉提取物80 mg/L銀杏葉提取物160 mg/L MMP-3（ ng/mL）30.240 2±2.31 52.632 8±3.71﹡41.260 8±3.45△44.531 8±4.34△36.578 1±3.07△△30.501 8±3.09△△☆TIMP-1（ ng/mL）23.23±3.94 10.497±1.07﹡15.492 8±1.98△14.935±1.19△17.654 8±2.05△△19.659 1±2.04△△☆

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎的研究越來(lái)越多地證明，細(xì)胞因子在OA的發(fā)生、發(fā)展、惡化中起著重要的調(diào)節(jié)作用。同OA發(fā)病最密切相關(guān)的就是IL-1[1]。實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)IL-1β處理后的軟骨細(xì)胞，在倒置顯微鏡下細(xì)胞活力降低、部分細(xì)胞變圓、皺縮。本實(shí)驗(yàn)采用IL-1β作用于兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-1β作用軟骨細(xì)胞后MMP-3分泌顯著增多，TIMP-1分泌顯著減少，證實(shí)IL-1β的膝關(guān)節(jié)損害作用。

MMPs是降解骨有機(jī)質(zhì)(主要是膠原蛋白)的非常重要的酶之一。MMPs的活性可被特異性TIMPs所抑制。在關(guān)節(jié)軟骨的破壞中，MMP-3和TIMP-1尤為重要，這是因?yàn)镸MP-3除了可降解Ⅳ型膠原，可能與OA早期膠原網(wǎng)絡(luò)水腫有關(guān)外，還可激活MMP-1，加速膠原的病理性降解，使與透明質(zhì)酸相連的可聚蛋白多糖由于網(wǎng)絡(luò)的松解而丟失；而TIMP-1則可抑制關(guān)節(jié)軟骨膠原纖維的釋放[2]。目前，臨床上將MMP-3和TIMP-1作為OA患者關(guān)節(jié)炎癥的血清標(biāo)記物進(jìn)行測(cè)定，并探討了OA患者M(jìn)MP-3和TIMP-1的血清水平與疾病的活動(dòng)相關(guān)性。

銀杏葉甘、苦、澀、平，入肺、脾、胃經(jīng)，具活血止痛、斂肺平喘、澀腸止瀉、止帶濁功效，是近年來(lái)應(yīng)用比較廣泛的藥物。由于銀杏葉提取物具有的清除氧自由基、改善細(xì)胞的代謝活動(dòng)等多方面的作用，銀杏葉提取物目前廣泛用于抗衰老和心腦血管疾病的治療和保健用藥[3]。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)可改善部分老年OA患者的癥狀，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示銀杏葉提取物對(duì)經(jīng)IL-1β?lián)p傷的軟骨細(xì)胞可以有效的減少M(fèi)MP-3的生成，并增加TIMP-1的生成。進(jìn)一步證實(shí)銀杏葉提取物對(duì)受損傷關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞具有保護(hù)作用。

[1]陳啟明，梁國(guó)德，秦嶺，等主譯.骨科基礎(chǔ)科學(xué)－骨關(guān)節(jié)肌肉系統(tǒng)生物學(xué)和生物力學(xué)〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：412.

[2]王毅，邢國(guó)勝，于順祿，等.IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)金屬蛋白酶/金屬蛋白酶抑制劑水平及藥物對(duì)其影響[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2003，(12)：718.

[3]Dubey AK，Shankar PR，Upadhyaya D，et al.Ginkgo biloba-an ap?praisal〔J〕.Kathmandu Univ Med J(KUMJ)，2004，2(3)：225.

Effect of Ginkgo Biloba Extract(EGb761)on MMP-3 and TIMP-1 and Damaged Chondrocytes of Knee-joint Injured by IL-1β in Rabbits

Zhao Dongjie,Wang Jun,He Bingrong.Zhejiang Provincial Hospi?tal of Traditional Chinese and Western Medicine（310003）,China

ObjectiveTo observe the protective effects of Ginkgo Biloba Extract(EGb761)on damaged chondrocytes of knee-joint injured by rratIL-1β in rabbits and to explore the protective mechanism of EGb761 through MMP-3 and TIMP-1.MethodsCartilaginous layers of knee were separated from three-month old Newzealand rabbit under semi-asepsis environment and then digested under sterile environment to get cartilagi?nous cells.The experimental cells were the second generation cartilaginous cells,identified with extracellular ma?trix in culture.These cells were observed by inverted microscopy and then were taken photos.Chondrocytes were divided randomly into six groups cultured with different cultures：rratIL-1β(5 μg/L)group,rratIL-1β(5 μg/L)with dexamethasone(10-6mmol/L)group,rratIL-1β(5 μg/L)with EGb761(40 mg,80 mg,160 mg/L)group and control group.After 24 hours,rabbit matrix MMP-13 and TIMP-1 content were detected by ELISA assay.ResultsThe production of MMP-13 was increased and TIMP-1 was decreased,Dexamethasone and EGb761 could rival the effect and EGb761 with dose-dependent response.ConclusionRGb761 could protect the damaged chondrocyte of articular genu injured by rratIL-1β in rabbit.The protective mechanism of EGb761 was to decrease production of MMP-13 and increase production of TIMP-1.EGb761 may be a new medicine to pre?vent osteoarthritis.

ginkgo biloba extract,osteoarthritis,matrix metalloproteinase,tissue type inhibitor of metallopro?teinases

R684.3；Q95-33

A

1007-6948(2011)01-0072-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2011.01.026

浙江省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院老年病科（杭州 310003）

趙東杰，Tel：0571-56109712,E-mail：zhaodongjie12 34@sina.com.cn

（收稿：2010-05-06 修回：2010-10-12）

（責(zé)任編輯 劉洪斌 田在善）