張雄飛，潘道波

湖南省常德市第一人民醫(yī)院麻醉科，湖南常德 415000

肢體缺血再灌注（IR）較單純缺血時的損傷更損重，還可引起遠隔多器官損傷[1]，雖然損傷的機制尚未完全明確，但與再灌注后中性粒細胞被激活，呼吸爆發(fā)釋放大量氧自由基及炎性細胞釋放大量炎性介質有關[2]。鹽酸戊乙奎醚是新型選擇性抗膽堿藥物，對中樞和周圍神經(jīng)均具有很強的抗膽堿作用，作用全面、持續(xù)時間長，高度選擇性M1、M3受體拮抗作用，而對M2受體無明顯作用，在I/R和細胞保護功能上的作用越來越受到重視，但作用機制尚不明確[3]。本研究探討了鹽酸戊乙奎醚對大鼠雙下肢缺血再灌注后心肌細胞凋亡的影響，為臨床應用提供可能的方向。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠60只，由徐州醫(yī)學院實驗動物中心提供，清潔級，雄性，體重（212±30）g，置實驗室環(huán)境中飼養(yǎng) 1周，自由攝食飲水。

1.2 試劑

SOD試劑盒、考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒和MDA試劑盒、MPO試劑盒 (南京建成生物工程研究所)，IL-10、TNF-α試劑盒，Bax和Bcl-2免疫組化試劑盒及細胞凋亡檢測試劑盒(武漢博士德生物工程研究所)。

1.3 肢體缺血再灌注模型動物的制備

大鼠術前12 h禁食，自由飲水。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔內注射麻醉，4 h后追加1/2量。雙側股三角處切開皮膚，分離出股動脈，用無創(chuàng)微動脈夾于近腹股溝韌帶處夾閉股動脈，使雙下肢缺血，縫合創(chuàng)口。以捫不到足背動脈搏動、雙足變暗變涼為缺血成功的標志。4 h后打開原切口，去除動脈夾恢復雙下肢血流，再灌注4 h，動脈搏動恢復，雙足逐漸變紅變暖，為建模成功。

1.4 實驗分組及處理

實驗大鼠隨機分為三組，分組各20只。①缺血再灌注組（H組）：再灌注前30 min腹腔注射2 ml生理鹽水；②鹽酸戊乙奎醚組（M組）：再灌注前30 min腹腔注射鹽酸戊乙奎醚2 mg/kg(用生理鹽水稀釋至2 ml)；③對照組（C組）：行假手術處理，無缺血再灌注，余手術麻醉步驟同①②。

1.5 標本采集及處理

三組隨機各取10只觀察24 h存活率，余M組和H組均在再灌注4 h后在麻醉狀態(tài)下腹主動脈放血活殺動物，C組麻醉后同法活殺。迅速開胸取心肌，心尖部取HE染色標本，余心肌-80℃超低溫冰箱凍存，待以后批量檢測MDA、SOD、MPO、IL-10、TNF-α。

1.6 觀察指標及方法

快速用刀片將心尖部組織切下，生理鹽水沖洗干凈后投入10%甲醛固定24 h行HE組織染色。余心肌復溫后制成冷的心肌組織勻漿，分別用紫外分光光度計檢測SOD（黃嘌呤氧化酶法）、MDA (硫代巴比妥酸法)、MPO（髓過氧化物酶）、心肌組織蛋白（考馬斯亮蘭法）吸光度后再進行計算SOD活力、MDA含量，酶標儀檢測IL-10和TNF-α（ELISΑ法），嚴格按各試劑盒說明書操作。

1.6.1 Bax和Bcl-2蛋白表達測定 10%甲醛固定，石蠟包埋切片，采用免疫組化染色法顯色。檢測方法嚴格按說明書操作。光鏡下觀察，陽性反應為細胞漿呈棕黃色染色，不染色者為陰性。在高倍鏡（×400）下，拍攝組織切片圖像。每片隨機計數(shù)5個視野，每個視野計數(shù)Bcl-2、Bax蛋白陽性表達細胞，以陽性細胞核數(shù)占細胞核總數(shù)的百分比為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達指數(shù)（PEI）。

1.6.2 細胞凋亡檢測 采用原位缺口末端標記法（TUNEL），檢測方法嚴格按說明書操作。細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即凋亡細胞。計算5個高倍視野下（×400）的凋亡細胞數(shù)，以凋亡細胞個/100細胞表示凋亡指數(shù)（apotosis index，AI）。

1.6.3 組織病理學檢查 10%甲醛中固定心肌組織，石蠟包埋切片，染色后光鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 心肌組織形態(tài)學變化

C組心肌細胞大小、形態(tài)均正常。H組可見心肌組織水腫、炎性細胞浸潤、局灶性出血等，而M組心肌組織病理改變均較H組有所減輕。

2.2 心肌組織 MDA、SOD、MPO、TNF-α 和 IL-10、AI水平

再灌注后，即H組較C組心肌組織MDA、MPO、TNF-α和 IL-10 水平、Bax表達、AI均明顯升高(P＜0.05)，而 SOD 活性、24 h生存率降低（P＜0.05）；使用鹽酸戊乙奎醚后，即 M組較H組SOD活性、IL-10含量、24 h生存率均升高（P＜0.05），MDA、MPO、TNF-α 含量、Bax表達、AI均明顯降低（P＜0.05）。 見表1～2。

表1 心肌組織 SOD 活性、MDA、MPO、TNF-α、IL-10 含量（n=10，±s）Tab.1 The MDA activity and the content of MDA,MPO,TNF-α,IL-10 in myocardial tissue(n=10,±s)

表1 心肌組織 SOD 活性、MDA、MPO、TNF-α、IL-10 含量（n=10，±s）Tab.1 The MDA activity and the content of MDA,MPO,TNF-α,IL-10 in myocardial tissue(n=10,±s)

注：與 C 組比較，﹡P＜0.05；與 H 組比較，﹟P＜0.05

C組H組M組組別 SOD(U/g) MDA(nmol/mgprot)270±64 148±49﹡213±71﹟0.84±0.22 1.76±0.47﹡0.94±0.23﹟MPO(U/g.wet)0.93±0.11 1.27±0.15﹡1.04±1.10﹟IL-10(pg/mg.wet)18.13±2.68 32.18±8.97﹡46.4±11.47﹡﹟TNF-α(pg/mg.wet)120±30 290±117﹡169±45﹡﹟

表2 心肌組織Bcl-2、Bax陽性表達指數(shù)、AI和24 h生存率（n=10，±s）Tab.2 The PEI of Bcl-2,Bax and the apoptosis index in myocardial tissue and survive rate in the three group(n=10，±s)

表2 心肌組織Bcl-2、Bax陽性表達指數(shù)、AI和24 h生存率（n=10，±s）Tab.2 The PEI of Bcl-2,Bax and the apoptosis index in myocardial tissue and survive rate in the three group(n=10，±s)

注：與 C 組比較，◆P＜0.05；與 H 組比較，●P＜0.05

C組H組M組組別 Bcl-2 0.087±0.020 0.091±0.024 0.096±0.015 Bax 0.095±0.020 0.157±0.032◆0.120±0.027◆●AI(%)0.95±0.24 5.97±1.00◆3.91±0.87◆●24 h生存率（%）100 20◆50◆●

2.3 相關性分析結果

MDA與 Bax顯著正相關（相關系數(shù) r=0.483，P＜0.05）MDA與AI之間顯著正相關（相關系數(shù)r=0.738，P＜0.01）。

3 討論

近年實驗證實，急性肢體缺血再灌流后不但損傷肢體本身，還可誘導產(chǎn)生全身炎癥綜合征（SIRS），造成遠隔器官（肝、肺、腦、腎、心等）損傷，中性粒細胞及活性氧物質所引起的炎癥和氧化應激性損傷可能是其發(fā)生的主要因素[4]。

IL-10在炎癥反應中主要發(fā)揮抗炎因子的作用。MPO可定量表達中性粒細胞（PMN）的聚集程度，兩者的表達平衡可反映心肌局部炎癥反應和中性粒細胞聚集的程度。體內氧自由基主要由黃嘌呤氧化酶及中性粒細胞、巨噬細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生，局部炎癥反應可導致氧自由基大量產(chǎn)生，使細胞膜脂質過氧化、DNA破壞等損傷，誘導細胞凋亡。由于氧自由基具有極強的反應活潑性，半衰期短，難以捕捉，常通過體內氧化-抗氧化系統(tǒng)間接反映體內氧自由基的產(chǎn)生情況，SOD是清除O2-的專一歧化酶，反映了體內抗氧自由基能力。MDA反映了機體脂質過氧化程度，間接反映組織內自由基水平[5]。Bcl-2是重要的抗凋亡因子，而Bax促進凋亡。Bcl-2與Bax表達平衡與細胞凋亡途徑緊密相關。Bxl-2表達下調和（或）Bax上調都顯示細胞凋亡增加。本研究顯示，雙下肢IR后IL-10和MPO明顯升高，MDA大量產(chǎn)生，SOD活性明顯下降，Bcl-2無顯著變化，Bax蛋白陽性表達指數(shù)增加，Bax/Bcl-2比例升高，而使用鹽酸戊乙奎醚IL-10進一步升高，MPO下降，SOD活性明顯上升，MDA產(chǎn)生減少，Bax/Bcl-2比例下降；相關性分析結果顯示MDA分別與Bax和AI顯著相關。表明雙下肢IR心肌中性粒細胞聚集，局部炎癥反應增強，抗氧化機制受到破壞；大量氧自由基釋放，誘導Bax促凋亡因子釋放，導致心肌細胞凋亡；鹽酸戊乙奎醚通過抑制心肌局部炎癥反應，使自由基生成減少，從而抑制Bax促凋亡因子產(chǎn)生，最后減少AI，這可能與抗膽堿藥能穩(wěn)定溶酶體和線粒體等亞細胞結構，減少溶酶體酶的釋放，抑制花生四烯酸代謝物的產(chǎn)生和休克因子的形成，達到細胞保護作用有關[6]。

TNF-α是單核/巨噬細胞和其他促炎細胞激活后釋放的細胞因子，水平升高比其他細胞因子更快，為最早的重要內源性介質之一，TNF-α與TNFRⅠ受體結合后激活caspases導致細胞凋亡。本實驗結果表明：肢體缺血-再灌注后，心肌組織勻漿中TNF-α較對照組明顯增高，在一定程度上反映TNF-α在肢體缺血-再灌注心肌損傷過程所起的重要作用，而鹽酸戊乙奎醚組顯著下降提示鹽酸戊乙奎醚降低心肌TNF-α的濃度，在抑制TNF-α誘導心肌細胞凋亡方面有現(xiàn)實的臨床意義。

總之，肢體缺血IR激活PMNs及其他炎性細胞，產(chǎn)生大量氧自由基及炎性介質，使機體處于一種無法控制的過度炎癥反應狀態(tài)，引起心肌損傷，心肌細胞凋亡。本實驗表明，鹽酸戊乙奎醚能夠有效減輕肢體缺血再灌注損傷后引起心肌損傷，清除心肌氧自由基，提高機體抗氧化能力，減輕心肌炎癥反應，減少TNF-α等凋亡誘導因子產(chǎn)生，從而從內外源兩條途徑發(fā)揮抗凋亡作用。可能機制為選擇性抗膽堿作用而不增加心率，有利于減少心肌氧耗，減輕肢體IR心肌損傷；改善微循環(huán)，拮抗炎癥因子及炎癥介質，保護細胞膜及溶酶體膜，降低毛細血管通透性等，可減輕局部炎癥反應，緩解心肌細胞氧化應激反應發(fā)揮作用。

[1]林大偉,菅向東.新型選擇性抗膽堿藥長托寧的臨床應用研究進展[J].中國工業(yè)醫(yī)志,2008,21(1)：60-62.

[2]Di Napoli P,Taccardi AA,De Caterina R,et al.Pathophysiology of ischemia-reperfusion injury：experimental data[J].Italian heart journal：official journal of the Italian Federation of Cardiology,2002,34：24-28.

[3]Shao QW,Xue TY,Gao JZ,et al.Effect of proteasome inhibitors MG-132 at different doses on cultured K562 cell apotosis[J].Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi,2009,17：574-578.

[4]Kawasaki S,Sugiyama S,Ishiguro N,et al.Implication of superoxide radicals on ischemia-reperfusion-induced skeletal muscle injury in rats[J].Eur Surg Res,1993,25：129-136.

[5]He LL,Sun GZ,Zhang PT.Apoptotic protease activating factor 1 inducing apotosis and related anti-tumor therapy——review[J].Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi,2009,17：251-254.

[6]Zhang D,Lei Y,Zhao J,et al.The change of certain biochemical indexes and apotosis protein(Fas/FasL)expression in rat liver of selenium and iodine deficiency[J].Wei Sheng Yan Jiu,2008,37：682-684.