張國華 ,呂 智
1.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,山西太原 030001;2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院,山西汾陽 032200
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜組織慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的器官特異性自身免疫性疾病,主要病理特征是慢性炎癥細(xì)胞(T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)浸潤和多種細(xì)胞因子分泌,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜漸進(jìn)性損傷及骨質(zhì)破壞,給患者帶來了很大的痛苦[1]。其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚,在我國,RA的患病率為0.32%~0.36%,是造成人類勞動(dòng)力喪失和致殘的主要因素之一[2]。近年來,大量研究證實(shí),RA患者滑膜細(xì)胞及滑膜組織中浸潤的單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等可產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),參與RA的致病過程[3-4]。
白細(xì)胞介素23(IL-23)屬于IL-12家族成員,是一種重要的炎癥細(xì)胞因子,在抗感染免疫、抗腫瘤免疫及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。IL-23可能與RA炎癥反應(yīng)、血管新生、關(guān)節(jié)軟骨、滑膜病變之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系,目前國內(nèi)對(duì)IL-23在RA早期診斷和治療等方面的相關(guān)報(bào)道較少,故從基因水平和蛋白水平探討IL-23在RA患者體內(nèi)的表達(dá)及其與RF的關(guān)系,為RA的早期診斷和進(jìn)一步闡明RA的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。
66例RA患者均來自山西省汾陽醫(yī)院門診或住院患者,均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ARA)制定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn),其中,男 24例,女 42例;年齡 27~65歲,平均(47.3±7.2)歲。均排除高血壓、糖尿病、肝腎疾病、感染、腫瘤、心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等。42例健康對(duì)照組為健康體檢者,其中,男14例,女28例;年齡23~66歲,平均(46.5±7.8)歲。
所有研究對(duì)象采集空腹靜脈血2管,第一管全血3 ml,置于肝素抗凝管中,用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。第二管無抗凝劑3 ml,靜置30 min,離心后取血清,用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測IL-23和免疫比濁法檢測血清RF水平。
抽取3 ml淋巴細(xì)胞分離液(購自北京索萊寶科技有限公司)于無菌離心管中,將新鮮無菌留取的3 ml肝素抗凝血用等體積(3 ml)無菌生理鹽水(1∶1)稀釋后,緩慢加入到已裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中,水平離心機(jī)離心(2 000 r/min,20 min),吸取中間的白膜層(PBMC),用5倍體積的無菌生理鹽水洗滌2次,最后用無菌生理鹽水稀釋至細(xì)胞濃度為1×107/ml。
1.4.1 RNA提取 將上述分離的PBMC按5×106個(gè)細(xì)胞中加入1 ml Trizol溶液,反復(fù)吹打使細(xì)胞徹底裂解。按1 ml Trizol加 200 μl氯仿(5∶1),劇烈震蕩 15 s,室溫靜置 5 min,4℃離心(12 000 r/min,15 min),小心吸取上清,按與上清 1∶1 的比例加入異丙醇(約 450 μl),上下顛倒混勻后,-20℃靜置 60 min,4℃離心(12 000 r/min,10 min),仔細(xì)將液體倒掉,加入 1 ml 75%的乙醇(DEPC 水配制),4℃離心(12 000 r/min,10 min)洗滌沉淀1次,加入適量DEPC處理水(20 μl)溶解 RNA,測OD值定量,以A260/A280,A260/A230比值判斷RNA樣品質(zhì)量,-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank人IL-23p19 cDNA序列設(shè)計(jì)引物,以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。IL-23p19(328 bp):上游引物(5′-CTGCTTGCAAAGGATCCACC-3′),下游引物(5′-TTGAAGCGGAGAAGGAGACG-3′)。 β-actin(600 bp):上游引物(5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′),下游引物(5′-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3′)。
1.4.3 RT-PCR 選用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2,按試劑盒說明書操作,通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PCR反應(yīng)條件和最適循環(huán)數(shù),以保證PCR產(chǎn)物量與起始mRNA量呈線性相關(guān)。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像分析儀(江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司)上觀察拍照,分析電泳條帶的光密度值,以β-actin作內(nèi)參照,用相對(duì)光密度值代表mRNA的表達(dá)量。相對(duì)光密度值=(IL-23p19光密度值/β-actin光密度值)×100%。
采用雙抗體夾心ABC-ELISA法,人IL-23 ELISA檢測試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司(批號(hào):SX01087),操作過程均嚴(yán)格按試劑說明書操作。采用BIO-RAD伯樂酶標(biāo)儀680于492 nm波長處測定OD值,通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的濃度。
檢測血清RF用OLYMPUS全自動(dòng)生化分析儀(北京九強(qiáng)公司),所用試劑為原裝配套試劑,檢測正常范圍<14 IU/ml。
所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各指標(biāo)間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)性分析。
RT-PCR電泳圖中可見,健康對(duì)照組和RA患者組在328 bp處都有條帶出現(xiàn),但在RA患者組的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(圖 1、表1),說明RA患者PBMC中 IL-23p19 mRNA的平均表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。
表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達(dá)水平(±s)Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)
表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達(dá)水平(±s)Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)
注:與健康對(duì)照相比,*P<0.05Note:compared with the healthy group,*P<0.05
RA組健康對(duì)照組組別 例數(shù)66 42 IL-23p19 mRNA(%)45.2±11.7*23.8±9.5血清 IL-23(ng/L)114.47±42.70*70.81±28.85
RA患者血清中IL-23水平較健康對(duì)照組顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。
RA患者血清IL-23含量與RF含量無明顯相關(guān)性(r=0.389,P>0.05)。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是多因素自身免疫性疾病,其病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚,現(xiàn)在免疫機(jī)制越來越受到國內(nèi)外專家的關(guān)注。RA患者體內(nèi)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)異常表達(dá),它們之間通過相互作用、相互調(diào)節(jié),形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),可能直接或間接參與RA的發(fā)生和發(fā)展過程[6]。IL-23是2000年報(bào)道的細(xì)胞因子,是由p19和IL-12p40共同形成的類似于IL-12p35p40的、由二硫鍵連接的異源二聚體可溶性復(fù)合物。其功能研究證明,p19單獨(dú)不具有生物學(xué)活性,只有與p40共同構(gòu)成p19p40時(shí)才有生物學(xué)活性。IL-23雖然與IL-12共有p40亞單位,但以其自身獨(dú)特的亞單位p19與IL-12相區(qū)別。IL-23具有十分復(fù)雜的生物學(xué)功能,主要作用于記憶性CD4+T細(xì)胞,誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞的分化及IFN-γ產(chǎn)生[7],還可作用于記憶性Th17細(xì)胞亞群誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17,參與免疫炎癥[8]。過去人們認(rèn)為IL-12在自身免疫性炎癥發(fā)揮中心作用,現(xiàn)在越來越多的研究表明在強(qiáng)直性脊柱炎(AS)、橋本甲狀腺炎(HT)等患者體內(nèi)IL-23的表達(dá)明顯增高[9-10],所以IL-23在這些自身免疫性疾病的發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的作用。但目前對(duì)于IL-23在RA發(fā)病中的作用沒有研究報(bào)道,本研究結(jié)果表明IL-23p19 mRNA和血清IL-23在RA組的表達(dá)水平都顯著高于正常對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明IL-23參與了RA的炎癥過程,但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
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