張國華 ，呂 智

1.山西醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學汾陽學院，山西汾陽 032200

類風濕關節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關節(jié)滑膜組織慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的器官特異性自身免疫性疾病，主要病理特征是慢性炎癥細胞（T細胞和巨噬細胞）浸潤和多種細胞因子分泌，最終導致關節(jié)滑膜漸進性損傷及骨質(zhì)破壞，給患者帶來了很大的痛苦[1]。其病因和發(fā)病機制至今尚不完全清楚，在我國，RA的患病率為0.32%～0.36%，是造成人類勞動力喪失和致殘的主要因素之一[2]。近年來，大量研究證實，RA患者滑膜細胞及滑膜組織中浸潤的單核/巨噬細胞、淋巴細胞等可產(chǎn)生大量的細胞因子和炎癥介質(zhì)，參與RA的致病過程[3-4]。

白細胞介素23（IL-23）屬于IL-12家族成員，是一種重要的炎癥細胞因子，在抗感染免疫、抗腫瘤免疫及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。IL-23可能與RA炎癥反應、血管新生、關節(jié)軟骨、滑膜病變之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，目前國內(nèi)對IL-23在RA早期診斷和治療等方面的相關報道較少，故從基因水平和蛋白水平探討IL-23在RA患者體內(nèi)的表達及其與RF的關系，為RA的早期診斷和進一步闡明RA的發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

66例RA患者均來自山西省汾陽醫(yī)院門診或住院患者，均符合1987年美國風濕病學會（ARA）制定的類風濕關節(jié)炎診斷標準，其中，男 24例，女 42例；年齡 27～65歲，平均（47.3±7.2）歲。均排除高血壓、糖尿病、肝腎疾病、感染、腫瘤、心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等。42例健康對照組為健康體檢者，其中，男14例，女28例；年齡23～66歲，平均（46.5±7.8）歲。

1.2 臨床標本的采集

所有研究對象采集空腹靜脈血2管，第一管全血3 ml，置于肝素抗凝管中，用于分離外周血單個核細胞（PBMC）。第二管無抗凝劑3 ml，靜置30 min，離心后取血清，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測IL-23和免疫比濁法檢測血清RF水平。

1.3 外周血單個核細胞的分離

抽取3 ml淋巴細胞分離液（購自北京索萊寶科技有限公司）于無菌離心管中，將新鮮無菌留取的3 ml肝素抗凝血用等體積（3 ml）無菌生理鹽水（1∶1）稀釋后，緩慢加入到已裝有淋巴細胞分離液的離心管中，水平離心機離心（2 000 r/min，20 min），吸取中間的白膜層（PBMC），用5倍體積的無菌生理鹽水洗滌2次，最后用無菌生理鹽水稀釋至細胞濃度為1×107/ml。

1.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

1.4.1 RNA提取 將上述分離的PBMC按5×106個細胞中加入1 ml Trizol溶液，反復吹打使細胞徹底裂解。按1 ml Trizol加 200 μl氯仿（5∶1），劇烈震蕩 15 s，室溫靜置 5 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min），小心吸取上清，按與上清 1∶1 的比例加入異丙醇（約 450 μl），上下顛倒混勻后，-20℃靜置 60 min，4℃離心（12 000 r/min，10 min），仔細將液體倒掉，加入 1 ml 75%的乙醇（DEPC 水配制），4℃離心（12 000 r/min，10 min）洗滌沉淀1次，加入適量DEPC處理水（20 μl）溶解 RNA，測OD值定量，以A260/A280，A260/A230比值判斷RNA樣品質(zhì)量，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設計 根據(jù)GenBank人IL-23p19 cDNA序列設計引物，以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。IL-23p19（328 bp）：上游引物（5′-CTGCTTGCAAAGGATCCACC-3′），下游引物（5′-TTGAAGCGGAGAAGGAGACG-3′）。 β-actin（600 bp）：上游引物（5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′），下游引物（5′-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3′）。

1.4.3 RT-PCR 選用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，按試劑盒說明書操作，通過預實驗確定PCR反應條件和最適循環(huán)數(shù)，以保證PCR產(chǎn)物量與起始mRNA量呈線性相關。反應結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析儀（江蘇捷達科技發(fā)展有限公司）上觀察拍照，分析電泳條帶的光密度值，以β-actin作內(nèi)參照，用相對光密度值代表mRNA的表達量。相對光密度值=（IL-23p19光密度值/β-actin光密度值）×100%。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，人IL-23 ELISA檢測試劑盒購自上海森雄科技實業(yè)有限公司（批號：SX01087），操作過程均嚴格按試劑說明書操作。采用BIO-RAD伯樂酶標儀680于492 nm波長處測定OD值，通過繪制標準曲線計算樣本的濃度。

1.6 免疫比濁法

檢測血清RF用OLYMPUS全自動生化分析儀（北京九強公司），所用試劑為原裝配套試劑，檢測正常范圍＜14 IU/ml。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。各指標間的相關性檢驗采用Pearson相關性分析。

2 結(jié)果

2.1 RA患者與健康對照者PBMC中IL-23p19 mRNA表達水平比較

RT-PCR電泳圖中可見，健康對照組和RA患者組在328 bp處都有條帶出現(xiàn)，但在RA患者組的表達強度明顯高于對照組（圖 1、表1），說明RA患者PBMC中 IL-23p19 mRNA的平均表達水平較健康對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

注：與健康對照相比，*P＜0.05Note：compared with the healthy group,*P＜0.05

RA組健康對照組組別 例數(shù)66 42 IL-23p19 mRNA（%）45.2±11.7*23.8±9.5血清 IL-23（ng/L）114.47±42.70*70.81±28.85

2.2 RA患者與健康對照者血清IL-23水平比較

RA患者血清中IL-23水平較健康對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 RA患者IL-23與RF之間的相關性分析

RA患者血清IL-23含量與RF含量無明顯相關性（r=0.389，P＞0.05)。

3 討論

類風濕關節(jié)炎是多因素自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機制仍不十分清楚，現(xiàn)在免疫機制越來越受到國內(nèi)外專家的關注。RA患者體內(nèi)多種細胞因子和炎癥介質(zhì)異常表達，它們之間通過相互作用、相互調(diào)節(jié)，形成一個復雜的網(wǎng)絡，可能直接或間接參與RA的發(fā)生和發(fā)展過程[6]。IL-23是2000年報道的細胞因子，是由p19和IL-12p40共同形成的類似于IL-12p35p40的、由二硫鍵連接的異源二聚體可溶性復合物。其功能研究證明，p19單獨不具有生物學活性，只有與p40共同構(gòu)成p19p40時才有生物學活性。IL-23雖然與IL-12共有p40亞單位，但以其自身獨特的亞單位p19與IL-12相區(qū)別。IL-23具有十分復雜的生物學功能，主要作用于記憶性CD4+T細胞，誘導Th1型細胞的分化及IFN-γ產(chǎn)生[7]，還可作用于記憶性Th17細胞亞群誘導產(chǎn)生IL-17，參與免疫炎癥[8]。過去人們認為IL-12在自身免疫性炎癥發(fā)揮中心作用，現(xiàn)在越來越多的研究表明在強直性脊柱炎（AS）、橋本甲狀腺炎（HT）等患者體內(nèi)IL-23的表達明顯增高[9-10]，所以IL-23在這些自身免疫性疾病的發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的作用。但目前對于IL-23在RA發(fā)病中的作用沒有研究報道，本研究結(jié)果表明IL-23p19 mRNA和血清IL-23在RA組的表達水平都顯著高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義，說明IL-23參與了RA的炎癥過程，但具體作用機制有待進一步研究。

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