張國華 ，呂 智

1.山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西汾陽 032200

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜組織慢性炎癥病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的器官特異性自身免疫性疾病，主要病理特征是慢性炎癥細(xì)胞（T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）浸潤和多種細(xì)胞因子分泌，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜漸進(jìn)性損傷及骨質(zhì)破壞，給患者帶來了很大的痛苦[1]。其病因和發(fā)病機(jī)制至今尚不完全清楚，在我國，RA的患病率為0.32%～0.36%，是造成人類勞動(dòng)力喪失和致殘的主要因素之一[2]。近年來，大量研究證實(shí)，RA患者滑膜細(xì)胞及滑膜組織中浸潤的單核/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等可產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)，參與RA的致病過程[3-4]。

白細(xì)胞介素23（IL-23）屬于IL-12家族成員，是一種重要的炎癥細(xì)胞因子，在抗感染免疫、抗腫瘤免疫及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[5]。IL-23可能與RA炎癥反應(yīng)、血管新生、關(guān)節(jié)軟骨、滑膜病變之間存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，目前國內(nèi)對(duì)IL-23在RA早期診斷和治療等方面的相關(guān)報(bào)道較少，故從基因水平和蛋白水平探討IL-23在RA患者體內(nèi)的表達(dá)及其與RF的關(guān)系，為RA的早期診斷和進(jìn)一步闡明RA的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

66例RA患者均來自山西省汾陽醫(yī)院門診或住院患者，均符合1987年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ARA）制定的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中，男 24例，女 42例；年齡 27～65歲，平均（47.3±7.2）歲。均排除高血壓、糖尿病、肝腎疾病、感染、腫瘤、心腦血管疾病和其他自身免疫性疾病等。42例健康對(duì)照組為健康體檢者，其中，男14例，女28例；年齡23～66歲，平均（46.5±7.8）歲。

1.2 臨床標(biāo)本的采集

所有研究對(duì)象采集空腹靜脈血2管，第一管全血3 ml，置于肝素抗凝管中，用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。第二管無抗凝劑3 ml，靜置30 min，離心后取血清，用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測IL-23和免疫比濁法檢測血清RF水平。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離

抽取3 ml淋巴細(xì)胞分離液（購自北京索萊寶科技有限公司）于無菌離心管中，將新鮮無菌留取的3 ml肝素抗凝血用等體積（3 ml）無菌生理鹽水（1∶1）稀釋后，緩慢加入到已裝有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，水平離心機(jī)離心（2 000 r/min，20 min），吸取中間的白膜層（PBMC），用5倍體積的無菌生理鹽水洗滌2次，最后用無菌生理鹽水稀釋至細(xì)胞濃度為1×107/ml。

1.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

1.4.1 RNA提取 將上述分離的PBMC按5×106個(gè)細(xì)胞中加入1 ml Trizol溶液，反復(fù)吹打使細(xì)胞徹底裂解。按1 ml Trizol加 200 μl氯仿（5∶1），劇烈震蕩 15 s，室溫靜置 5 min，4℃離心（12 000 r/min，15 min），小心吸取上清，按與上清 1∶1 的比例加入異丙醇（約 450 μl），上下顛倒混勻后，-20℃靜置 60 min，4℃離心（12 000 r/min，10 min），仔細(xì)將液體倒掉，加入 1 ml 75%的乙醇（DEPC 水配制），4℃離心（12 000 r/min，10 min）洗滌沉淀1次，加入適量DEPC處理水（20 μl）溶解 RNA，測OD值定量，以A260/A280，A260/A230比值判斷RNA樣品質(zhì)量，-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank人IL-23p19 cDNA序列設(shè)計(jì)引物，以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。IL-23p19（328 bp）：上游引物（5′-CTGCTTGCAAAGGATCCACC-3′），下游引物（5′-TTGAAGCGGAGAAGGAGACG-3′）。 β-actin（600 bp）：上游引物（5′-CACACTGTGCCCATCTACGA-3′），下游引物（5′-CTGCTTGCTGATCCACATCT-3′）。

1.4.3 RT-PCR 選用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2，按試劑盒說明書操作，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定PCR反應(yīng)條件和最適循環(huán)數(shù)，以保證PCR產(chǎn)物量與起始mRNA量呈線性相關(guān)。反應(yīng)結(jié)束后取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析儀（江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）上觀察拍照，分析電泳條帶的光密度值，以β-actin作內(nèi)參照，用相對(duì)光密度值代表mRNA的表達(dá)量。相對(duì)光密度值=（IL-23p19光密度值/β-actin光密度值）×100%。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，人IL-23 ELISA檢測試劑盒購自上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司（批號(hào)：SX01087），操作過程均嚴(yán)格按試劑說明書操作。采用BIO-RAD伯樂酶標(biāo)儀680于492 nm波長處測定OD值，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本的濃度。

1.6 免疫比濁法

檢測血清RF用OLYMPUS全自動(dòng)生化分析儀（北京九強(qiáng)公司），所用試劑為原裝配套試劑，檢測正常范圍＜14 IU/ml。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各指標(biāo)間的相關(guān)性檢驗(yàn)采用Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 RA患者與健康對(duì)照者PBMC中IL-23p19 mRNA表達(dá)水平比較

RT-PCR電泳圖中可見，健康對(duì)照組和RA患者組在328 bp處都有條帶出現(xiàn)，但在RA患者組的表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組（圖 1、表1），說明RA患者PBMC中 IL-23p19 mRNA的平均表達(dá)水平較健康對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達(dá)水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

表1 IL-23p19 mRNA和血清IL-23的平均表達(dá)水平（±s）Tab.1 The average expression level of IL-23p19 mRNA and serum IL-23(±s)

注：與健康對(duì)照相比，*P＜0.05Note：compared with the healthy group,*P＜0.05

RA組健康對(duì)照組組別 例數(shù)66 42 IL-23p19 mRNA（%）45.2±11.7*23.8±9.5血清 IL-23（ng/L）114.47±42.70*70.81±28.85

2.2 RA患者與健康對(duì)照者血清IL-23水平比較

RA患者血清中IL-23水平較健康對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 RA患者IL-23與RF之間的相關(guān)性分析

RA患者血清IL-23含量與RF含量無明顯相關(guān)性（r=0.389，P＞0.05)。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是多因素自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚，現(xiàn)在免疫機(jī)制越來越受到國內(nèi)外專家的關(guān)注。RA患者體內(nèi)多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)異常表達(dá)，它們之間通過相互作用、相互調(diào)節(jié)，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，可能直接或間接參與RA的發(fā)生和發(fā)展過程[6]。IL-23是2000年報(bào)道的細(xì)胞因子，是由p19和IL-12p40共同形成的類似于IL-12p35p40的、由二硫鍵連接的異源二聚體可溶性復(fù)合物。其功能研究證明，p19單獨(dú)不具有生物學(xué)活性，只有與p40共同構(gòu)成p19p40時(shí)才有生物學(xué)活性。IL-23雖然與IL-12共有p40亞單位，但以其自身獨(dú)特的亞單位p19與IL-12相區(qū)別。IL-23具有十分復(fù)雜的生物學(xué)功能，主要作用于記憶性CD4+T細(xì)胞，誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞的分化及IFN-γ產(chǎn)生[7]，還可作用于記憶性Th17細(xì)胞亞群誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17，參與免疫炎癥[8]。過去人們認(rèn)為IL-12在自身免疫性炎癥發(fā)揮中心作用，現(xiàn)在越來越多的研究表明在強(qiáng)直性脊柱炎（AS）、橋本甲狀腺炎（HT）等患者體內(nèi)IL-23的表達(dá)明顯增高[9-10]，所以IL-23在這些自身免疫性疾病的發(fā)展過程中可能發(fā)揮著重要的作用。但目前對(duì)于IL-23在RA發(fā)病中的作用沒有研究報(bào)道，本研究結(jié)果表明IL-23p19 mRNA和血清IL-23在RA組的表達(dá)水平都顯著高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明IL-23參與了RA的炎癥過程，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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