柱切換LC-MS/MS分析吸毒尿樣中的嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱?/h1>
2011-01-30 02:15:48葉海英張玉榮陳永生
質(zhì)譜學(xué)報(bào) 2011年3期
梁 晨,葉海英,張玉榮,汪 蓉,陳永生
(上海市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究管理中心,上海市現(xiàn)場(chǎng)物證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200083)
近年來(lái),隨著國(guó)際毒潮持續(xù)泛濫,境外毒品對(duì)我國(guó)的侵襲日益加劇,吸食或注射海洛因的人員也越來(lái)越多。為了打擊毒犯、維護(hù)正義,禁毒部門(mén)逐年加大對(duì)毒品案件的偵查力度。禁毒部門(mén)在偵破毒品案件時(shí),常與吸毒嫌疑人員打交道,由于“單抗免疫檢測(cè)試劑盒”容易受到某些藥物的干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性,不能直接單獨(dú)用于吸毒案件的定性依據(jù),因此定性檢驗(yàn)這類(lèi)人群體液中的毒品來(lái)判斷他們是否吸食毒品海洛因就尤為重要。海洛因進(jìn)入人體后,很快代謝為嗎啡和單乙酰嗎啡,幾乎檢測(cè)不到原體海洛因,而嗎啡屬于水溶性藥物,極性較大,應(yīng)用氣相色譜直接分析較為困難,而且靈敏度低。目前,已有很多 GC/MS法分析尿樣中嗎啡的報(bào)道,但檢材必須采用混合溶劑(V(氯仿)∶V(異丙醇)=9∶1的溶劑)提取、丙酸酐衍生化后用 GC/MS定性分析,樣品處理繁瑣,難以滿(mǎn)足實(shí)際案件快速檢驗(yàn)的需要[1-3]。
樣品前處理是生物樣品分析的重要步驟,也是費(fèi)時(shí)、工作量大的過(guò)程。柱切換技術(shù)通過(guò)閥切換將處理試樣與分析統(tǒng)一在一個(gè)系統(tǒng)中,不僅增加了處理樣品的安全性,而且減少了人為因素的影響,提高了方法的準(zhǔn)確度和精密度[4-5]。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)集液相色譜高效的在線(xiàn)分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性于一體,已成為法醫(yī)毒物分析強(qiáng)有力的工具。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式通過(guò)兩次離子選擇作用,鎖定目標(biāo)物的母離子-子離子對(duì),提高了分析的專(zhuān)一性和靈敏度[6]。本工作通過(guò)儀器改裝,將柱切換技術(shù)與LC/MS聯(lián)用,尿樣直接進(jìn)樣分析嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因和乙?？纱?。
要實(shí)現(xiàn)柱切換,儀器至少需配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥。實(shí)驗(yàn)室在購(gòu)買(mǎi)了整套的Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀后,為了實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)前處理(即柱切換功能),又增配了1臺(tái) Waters 1525高壓二元泵和1個(gè)十通切換閥。通過(guò)內(nèi)部流路的重新連接和改裝,用Alliance 2695的進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)大體積進(jìn)樣,1525高壓二元泵輸送預(yù)處理流動(dòng)相,樣品在預(yù)處理柱上被凈化和富集,沖洗一定時(shí)間(即預(yù)處理時(shí)間)后,通過(guò)十通切換閥,使分析流動(dòng)相進(jìn)入預(yù)處理柱,把被測(cè)組分沖入Alliance 2695的流路中,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間(即切換時(shí)間)后,十通切換閥又切換成原狀,Alliance 2695繼續(xù)輸送分析流動(dòng)相進(jìn)行色譜柱分離,并最終進(jìn)入到Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜中進(jìn)行檢測(cè),預(yù)處理柱則平衡準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣。切換過(guò)程示于圖1。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器和試劑
Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀:美國(guó) Waters公司產(chǎn)品,配有 Waters 1525高壓二元泵,Mass Lynx V4.1軟件,十通切換閥。
對(duì)照品:由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3:美國(guó)Cerilliant公司產(chǎn)品。
乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨(色譜純):購(gòu)自德國(guó)Merck公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;水為自制超純水。
儲(chǔ)備液:固體對(duì)照品配成1.0 g/L甲醇溶液,再按照濃度配成混合稀釋液。內(nèi)標(biāo)配成濃度為0.1 g/L甲醇溶液。
1.2 儀器條件
1.2.1 液相色譜條件 1)預(yù)處理柱型號(hào):Oasis?HLB 2.1 mm×20 mm×25μm;預(yù)處理柱柱溫:室溫;預(yù)處理流動(dòng)相:水;流速:1.0 mL/min;切換時(shí)間:0.60～3.00 min。2)分析柱型號(hào):Xterra?MS C182.1 mm×150 mm×3.5 μm;分析柱柱溫:35 ℃;分析流動(dòng)相 A:2 mmol/L甲酸銨和 0.05%甲酸的水溶液(0.126 g甲酸銨和 500μL甲酸,加水至 1 000 mL);分析流動(dòng)相B:2 mmol/L甲酸銨和0.05%甲酸的乙腈(0.126 g甲酸銨和500μL甲酸溶于40 mL水中,加入960 mL乙腈);流速:0.2 mL/min;梯度洗脫:0 min 90%A 10%B,5 min 90%A 10%B;7 min 40%A 60%B,12 min 40%A 60%B,12.05 min 90%A 10%B;進(jìn)樣量:100μL。
圖1 柱切換過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic representation of the column-switching set-up
1.2.2 質(zhì)譜條件 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,正離子掃描,電噴霧電壓3 200 V,霧化氣(N2)流速600 L/h,錐孔反吹氣(N2)流速50 L/h,離子源溫度105℃,碰撞氣為氬氣。
1.2.3 MRM參數(shù) 每個(gè)化合物設(shè)2對(duì)母離子-子離子對(duì),各參數(shù)列于表1。
表1 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜MRM參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters and diagnostic ions for morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2 結(jié)果
2.1 色譜圖
嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱蚣皟?nèi)標(biāo)在選定的液相色譜分析條件下,保留時(shí)間分別為 6.01、7.69、9.58、10.80、6.01 min,色譜行為良好,總離子流色譜圖示于圖2。
2.2 檢測(cè)限
當(dāng)信噪比(S/N)為3時(shí),各化合物的檢測(cè)限列于表2。
圖2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱蚣皟?nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖Fig.2 TIC of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2.3 線(xiàn)性關(guān)系和精密度
分別取不同量的對(duì)照品混合液于具塞尖底試管中,吹干后加入空白尿樣配成系列濃度的樣品。以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(y)對(duì)樣品中化合物的濃度(x)作圖,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù),各化合物的線(xiàn)性關(guān)系良好(表2)。高、中、低濃度日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次得日內(nèi)精密度,連續(xù)測(cè)定4天得日間精密度,列于表3。
2.4 案例應(yīng)用
本方法已經(jīng)應(yīng)用于多起實(shí)際案件的吸毒尿樣分析,其中一例吸毒致死案件的尿樣檢材中檢出嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虺煞?色譜圖示于圖3。
表2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻臋z測(cè)限和線(xiàn)性關(guān)系Table 2 The limit of detection,linear equation and coefficient of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,and acetylcodeine
表3 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因的日內(nèi)及日間精密度Table 3 Intra-and inter-day precision of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine and acetylcodeine
圖3 一例吸毒致死案件的尿樣色譜圖Fig.3 Chromatogram of a case
3 討論
在線(xiàn)固相萃取(SPE)的主要優(yōu)點(diǎn)有:1)前處理簡(jiǎn)單,自動(dòng)化操作,樣品只需簡(jiǎn)單處理或不經(jīng)處理即可進(jìn)樣分析,因此也適用于不穩(wěn)定藥物的分析;2)富集被測(cè)組分,提高了分析靈敏度,尤其是水溶性較大的組分,無(wú)法用液-液萃取時(shí),HPLC柱切換技術(shù)則很有效;3)由于進(jìn)樣體積較大,處理樣品的全過(guò)程由儀器程序控制,可獲得很高的精密度與重現(xiàn)性。
采用柱切換方法,切換時(shí)間的確定至關(guān)重要。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定預(yù)處理流動(dòng)相的沖洗時(shí)間,初始為狀態(tài)1,預(yù)處理柱和分析柱是并聯(lián)狀態(tài),進(jìn)樣后各化合物富集、保留在預(yù)處理柱上,0.60 min后切換到狀態(tài)2,既可除去尿液中的水溶性雜質(zhì)和鹽類(lèi),又使峰面積達(dá)到最大化,時(shí)間增加或者減少峰面積均減小。在狀態(tài)2時(shí),預(yù)處理柱和分析柱串聯(lián)在一起,分析流動(dòng)相將保留在預(yù)處理柱上的化合物洗脫進(jìn)入分析柱,3.00 min后回到狀態(tài)1,化合物繼續(xù)在分析柱上完成分離,時(shí)間增加峰面積不再增加,僅保留時(shí)間延長(zhǎng),因此確定切換時(shí)間為0.60～3.00 min。
液相色譜分析條件的確定:以乙腈和水作為流動(dòng)相主體,由于樣品離子化的需要,在水中需要加入甲酸和甲酸銨,其中甲酸主要起到改善峰形的作用,甲酸銨可以提高儀器信號(hào)的響應(yīng)值。由于梯度洗脫會(huì)影響色譜峰面積的穩(wěn)定性,通過(guò)在乙腈中加入相同濃度的甲酸和甲酸銨,保證梯度變化過(guò)程中甲酸和甲酸銨的濃度一致,改善了色譜峰面積的穩(wěn)定性。嗎啡類(lèi)生物堿水溶性較大,在色譜柱上不易保留,由于母體結(jié)構(gòu)相似,碎片離子也相同,為了方法定性定量的準(zhǔn)確性,避免相互干擾,有必要使分析的化合物能在保留時(shí)間上分開(kāi),于是采用了初始為10%水相的梯度洗脫,各化合物得到良好的分離。
[1]何國(guó)標(biāo),蔣碩勤,羅正堅(jiān).嗎啡類(lèi)毒品的固相萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào),2008,27(增刊):11-12.
[2]朱彬玲.尿中O6-乙酰嗎啡的膜式固相萃取及 GC/MS/SIM測(cè)定[J].漳州師范學(xué)院學(xué)報(bào),2007,20(2):88-91.
[3]呂海茹.尿中嗎啡常見(jiàn)檢測(cè)方法[J].刑事技術(shù),2008,2:29-31.
[4]梁 晨,郭幼梅,金琦蕓,等.柱切換高效液相色譜法測(cè)定尿中苯駢二氮雜卓類(lèi)藥物[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,2003,12(3):157-160.
[5]JAGERDEO E,MONTGOMERY M A,L EBEAU M A,et al.An automated SPE/LC/MS/MS method for the analysis of cocaine and metabolites in whole blood[J].Journal of Chromatography B,2008,874(1/2):15-20.
[6]向 平,沈 敏,沈保華,等.生物檢材中嗎啡類(lèi)生物堿的LC-MS/MS分析[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2006,22(1):52-57.
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近年來(lái),隨著國(guó)際毒潮持續(xù)泛濫,境外毒品對(duì)我國(guó)的侵襲日益加劇,吸食或注射海洛因的人員也越來(lái)越多。為了打擊毒犯、維護(hù)正義,禁毒部門(mén)逐年加大對(duì)毒品案件的偵查力度。禁毒部門(mén)在偵破毒品案件時(shí),常與吸毒嫌疑人員打交道,由于“單抗免疫檢測(cè)試劑盒”容易受到某些藥物的干擾出現(xiàn)假陽(yáng)性,不能直接單獨(dú)用于吸毒案件的定性依據(jù),因此定性檢驗(yàn)這類(lèi)人群體液中的毒品來(lái)判斷他們是否吸食毒品海洛因就尤為重要。海洛因進(jìn)入人體后,很快代謝為嗎啡和單乙酰嗎啡,幾乎檢測(cè)不到原體海洛因,而嗎啡屬于水溶性藥物,極性較大,應(yīng)用氣相色譜直接分析較為困難,而且靈敏度低。目前,已有很多 GC/MS法分析尿樣中嗎啡的報(bào)道,但檢材必須采用混合溶劑(V(氯仿)∶V(異丙醇)=9∶1的溶劑)提取、丙酸酐衍生化后用 GC/MS定性分析,樣品處理繁瑣,難以滿(mǎn)足實(shí)際案件快速檢驗(yàn)的需要[1-3]。
樣品前處理是生物樣品分析的重要步驟,也是費(fèi)時(shí)、工作量大的過(guò)程。柱切換技術(shù)通過(guò)閥切換將處理試樣與分析統(tǒng)一在一個(gè)系統(tǒng)中,不僅增加了處理樣品的安全性,而且減少了人為因素的影響,提高了方法的準(zhǔn)確度和精密度[4-5]。液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS/MS)聯(lián)用技術(shù)集液相色譜高效的在線(xiàn)分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性于一體,已成為法醫(yī)毒物分析強(qiáng)有力的工具。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式通過(guò)兩次離子選擇作用,鎖定目標(biāo)物的母離子-子離子對(duì),提高了分析的專(zhuān)一性和靈敏度[6]。本工作通過(guò)儀器改裝,將柱切換技術(shù)與LC/MS聯(lián)用,尿樣直接進(jìn)樣分析嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因和乙?？纱?。
要實(shí)現(xiàn)柱切換,儀器至少需配置雙泵輸液系統(tǒng)和高壓流路選擇閥。實(shí)驗(yàn)室在購(gòu)買(mǎi)了整套的Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀后,為了實(shí)現(xiàn)在線(xiàn)前處理(即柱切換功能),又增配了1臺(tái) Waters 1525高壓二元泵和1個(gè)十通切換閥。通過(guò)內(nèi)部流路的重新連接和改裝,用Alliance 2695的進(jìn)樣器實(shí)現(xiàn)大體積進(jìn)樣,1525高壓二元泵輸送預(yù)處理流動(dòng)相,樣品在預(yù)處理柱上被凈化和富集,沖洗一定時(shí)間(即預(yù)處理時(shí)間)后,通過(guò)十通切換閥,使分析流動(dòng)相進(jìn)入預(yù)處理柱,把被測(cè)組分沖入Alliance 2695的流路中,經(jīng)過(guò)一定時(shí)間(即切換時(shí)間)后,十通切換閥又切換成原狀,Alliance 2695繼續(xù)輸送分析流動(dòng)相進(jìn)行色譜柱分離,并最終進(jìn)入到Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜中進(jìn)行檢測(cè),預(yù)處理柱則平衡準(zhǔn)備下一次進(jìn)樣。切換過(guò)程示于圖1。
1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 儀器和試劑
Waters Alliance 2695/Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿液-質(zhì)聯(lián)用儀:美國(guó) Waters公司產(chǎn)品,配有 Waters 1525高壓二元泵,Mass Lynx V4.1軟件,十通切換閥。
對(duì)照品:由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;內(nèi)標(biāo)嗎啡-d3:美國(guó)Cerilliant公司產(chǎn)品。
乙腈、甲醇、甲酸、甲酸銨(色譜純):購(gòu)自德國(guó)Merck公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;水為自制超純水。
儲(chǔ)備液:固體對(duì)照品配成1.0 g/L甲醇溶液,再按照濃度配成混合稀釋液。內(nèi)標(biāo)配成濃度為0.1 g/L甲醇溶液。
1.2 儀器條件
1.2.1 液相色譜條件 1)預(yù)處理柱型號(hào):Oasis?HLB 2.1 mm×20 mm×25μm;預(yù)處理柱柱溫:室溫;預(yù)處理流動(dòng)相:水;流速:1.0 mL/min;切換時(shí)間:0.60～3.00 min。2)分析柱型號(hào):Xterra?MS C182.1 mm×150 mm×3.5 μm;分析柱柱溫:35 ℃;分析流動(dòng)相 A:2 mmol/L甲酸銨和 0.05%甲酸的水溶液(0.126 g甲酸銨和 500μL甲酸,加水至 1 000 mL);分析流動(dòng)相B:2 mmol/L甲酸銨和0.05%甲酸的乙腈(0.126 g甲酸銨和500μL甲酸溶于40 mL水中,加入960 mL乙腈);流速:0.2 mL/min;梯度洗脫:0 min 90%A 10%B,5 min 90%A 10%B;7 min 40%A 60%B,12 min 40%A 60%B,12.05 min 90%A 10%B;進(jìn)樣量:100μL。
圖1 柱切換過(guò)程示意圖Fig.1 Schematic representation of the column-switching set-up
1.2.2 質(zhì)譜條件 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,正離子掃描,電噴霧電壓3 200 V,霧化氣(N2)流速600 L/h,錐孔反吹氣(N2)流速50 L/h,離子源溫度105℃,碰撞氣為氬氣。
1.2.3 MRM參數(shù) 每個(gè)化合物設(shè)2對(duì)母離子-子離子對(duì),各參數(shù)列于表1。
表1 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜MRM參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters and diagnostic ions for morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2 結(jié)果
2.1 色譜圖
嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱蚣皟?nèi)標(biāo)在選定的液相色譜分析條件下,保留時(shí)間分別為 6.01、7.69、9.58、10.80、6.01 min,色譜行為良好,總離子流色譜圖示于圖2。
2.2 檢測(cè)限
當(dāng)信噪比(S/N)為3時(shí),各化合物的檢測(cè)限列于表2。
圖2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱蚣皟?nèi)標(biāo)的總離子流色譜圖Fig.2 TIC of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,acetylcodeine and morphine-d3
2.3 線(xiàn)性關(guān)系和精密度
分別取不同量的對(duì)照品混合液于具塞尖底試管中,吹干后加入空白尿樣配成系列濃度的樣品。以峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(y)對(duì)樣品中化合物的濃度(x)作圖,得到回歸方程和相關(guān)系數(shù),各化合物的線(xiàn)性關(guān)系良好(表2)。高、中、低濃度日內(nèi)重復(fù)測(cè)定6次得日內(nèi)精密度,連續(xù)測(cè)定4天得日間精密度,列于表3。
2.4 案例應(yīng)用
本方法已經(jīng)應(yīng)用于多起實(shí)際案件的吸毒尿樣分析,其中一例吸毒致死案件的尿樣檢材中檢出嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虺煞?色譜圖示于圖3。
表2 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙?？纱虻臋z測(cè)限和線(xiàn)性關(guān)系Table 2 The limit of detection,linear equation and coefficient of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine,and acetylcodeine
表3 嗎啡、O6-單乙酰嗎啡、可待因、乙酰可待因的日內(nèi)及日間精密度Table 3 Intra-and inter-day precision of morphine,O6-monoacetylmorphine,codeine and acetylcodeine
圖3 一例吸毒致死案件的尿樣色譜圖Fig.3 Chromatogram of a case
3 討論
在線(xiàn)固相萃取(SPE)的主要優(yōu)點(diǎn)有:1)前處理簡(jiǎn)單,自動(dòng)化操作,樣品只需簡(jiǎn)單處理或不經(jīng)處理即可進(jìn)樣分析,因此也適用于不穩(wěn)定藥物的分析;2)富集被測(cè)組分,提高了分析靈敏度,尤其是水溶性較大的組分,無(wú)法用液-液萃取時(shí),HPLC柱切換技術(shù)則很有效;3)由于進(jìn)樣體積較大,處理樣品的全過(guò)程由儀器程序控制,可獲得很高的精密度與重現(xiàn)性。
采用柱切換方法,切換時(shí)間的確定至關(guān)重要。通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定預(yù)處理流動(dòng)相的沖洗時(shí)間,初始為狀態(tài)1,預(yù)處理柱和分析柱是并聯(lián)狀態(tài),進(jìn)樣后各化合物富集、保留在預(yù)處理柱上,0.60 min后切換到狀態(tài)2,既可除去尿液中的水溶性雜質(zhì)和鹽類(lèi),又使峰面積達(dá)到最大化,時(shí)間增加或者減少峰面積均減小。在狀態(tài)2時(shí),預(yù)處理柱和分析柱串聯(lián)在一起,分析流動(dòng)相將保留在預(yù)處理柱上的化合物洗脫進(jìn)入分析柱,3.00 min后回到狀態(tài)1,化合物繼續(xù)在分析柱上完成分離,時(shí)間增加峰面積不再增加,僅保留時(shí)間延長(zhǎng),因此確定切換時(shí)間為0.60～3.00 min。
液相色譜分析條件的確定:以乙腈和水作為流動(dòng)相主體,由于樣品離子化的需要,在水中需要加入甲酸和甲酸銨,其中甲酸主要起到改善峰形的作用,甲酸銨可以提高儀器信號(hào)的響應(yīng)值。由于梯度洗脫會(huì)影響色譜峰面積的穩(wěn)定性,通過(guò)在乙腈中加入相同濃度的甲酸和甲酸銨,保證梯度變化過(guò)程中甲酸和甲酸銨的濃度一致,改善了色譜峰面積的穩(wěn)定性。嗎啡類(lèi)生物堿水溶性較大,在色譜柱上不易保留,由于母體結(jié)構(gòu)相似,碎片離子也相同,為了方法定性定量的準(zhǔn)確性,避免相互干擾,有必要使分析的化合物能在保留時(shí)間上分開(kāi),于是采用了初始為10%水相的梯度洗脫,各化合物得到良好的分離。
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