韓江全， 于奎營(yíng)， 胡泳濤， 林冬融， 黃名璐

(遵義醫(yī)學(xué)院第五附屬(珠海)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東珠海519100)

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是1974年由Gospodarowicz等從牛腦垂體中提取的一種具有多種生物學(xué)活性的多肽因子，正常情況下可促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，病理情況下參與損傷組織的修復(fù)，研究表明，bFGF可促進(jìn)神經(jīng)元存活及生長(zhǎng)，對(duì)受損神經(jīng)細(xì)胞起明顯保護(hù)作用，是一種有效的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。最近報(bào)道bFGF能減少缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［1］，但其具體作用機(jī)制目前尚未完全明了，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察bFGF對(duì)腦缺血再灌注損傷后腦組織中Fractalkine含量及凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目的影響，探討bFGF對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)機(jī)制，從而為bFGF的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康雄性SD大鼠36只(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)中心實(shí)驗(yàn)室提供)，周齡8－9周，體重250－280 g，隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(12只)，缺血再灌注組(12只)，bFGF組(12只)。每大組各取6只用于TTC染色，6只用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞及fractalkine檢測(cè)。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型的制備 實(shí)驗(yàn)大鼠以戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔麻醉，采用Longa線栓法建立大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，缺血再灌注組及bFGF組均予缺血1 h后，分別于再灌注24 h各取6只大鼠灌注取腦，固定、脫水、透明、包埋，正常組不做任何處理，假手術(shù)組只分離不插線，于術(shù)后24 h各取6只灌注取腦，固定、脫水、透明、包埋。

2.2 給藥方法 bFGF由北京博奧森公司提供，用注射用水稀釋，bFGF組腹腔注射10 μg·kg－1，缺血后即刻給藥，其余組同時(shí)腹腔注射等量生理鹽水。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分 參照Z(yǔ)ea Longa 5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，分別于各時(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分:0分:無神經(jīng)功能缺失癥狀;1分:輕度局灶性神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展對(duì)側(cè)前肢);2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈);3分:重度局灶性神經(jīng)功能缺失(向?qū)?cè)傾倒);4分:不能自發(fā)行走，意識(shí)水平降低。

2.4 測(cè)定梗死面積 3組動(dòng)物各取6只于缺血再灌注24 h行神經(jīng)功能評(píng)分后處死，NS灌注后取腦，置于－20℃冰箱中速凍20 min后，自視交叉前后(因?yàn)榇竽X中動(dòng)脈在視交叉外側(cè)向后外走行，它的深穿支一般在視交叉平面垂直穿入周圍的基底節(jié)區(qū)，在此平面可見到壞死區(qū)、半暗帶和正常區(qū))分別行冠狀切片，厚度2 mm/片，置于20 g/L氯化2，4，5－三苯四氮唑(TTC)溶液，37℃避光孵育30 min，4%多聚甲醛固定24 h，拍照并計(jì)算梗死面積。

2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法原位標(biāo)記DNA片段檢測(cè)凋亡細(xì)胞，具體操作嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基公司產(chǎn)品)說明書進(jìn)行。在缺血半暗帶區(qū)取5個(gè)高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)(鏡下核染為棕黃色)，計(jì)算每高倍視野內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞均數(shù)。

2.6 免疫組化檢測(cè)fractalkine表達(dá) 采用SABC法，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，過氧化氫封閉，抗原熱修復(fù)20 min，血清封閉，抗體稀釋液1:100稀釋Ⅰ抗(fractalkine rabbit mAb，購(gòu)自北京博奧森生物制劑有限責(zé)任公司)。滴加Ⅰ抗，4℃孵育過夜，次日室溫復(fù)溫30min，移去Ⅰ抗，4℃過夜，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗，滴加生物素化的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h，PBS洗，滴加ABC復(fù)合物37℃孵育1 h，PBS液洗，DAB顯色，脫水透明封片，顯微鏡觀察，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，在每張切片皮質(zhì)區(qū)隨機(jī)取不相重復(fù)的5個(gè)視野，數(shù)碼相機(jī)拍照，MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)對(duì)所拍圖像進(jìn)行分析，統(tǒng)一光飽和度、亮度和色調(diào)，取平均灰度級(jí)算術(shù)均數(shù)用于各組間比較。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件分析系統(tǒng)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用單因素方差分析檢驗(yàn)。取α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

結(jié) 果

1 HE染色腦組織病理學(xué)變化

假手術(shù)組中未見梗死改變，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，胞膜、核膜清晰，核仁明顯;缺血再灌注組及bFGF組可見穩(wěn)定梗死灶，皮質(zhì)梗死中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞脫失明顯，殘存細(xì)胞多無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核固縮深染，核仁消失。梗死區(qū)周圍神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目減少，且腫脹、壞死、脫失，分布不均勻，細(xì)胞周圍及間隙增寬，水腫明顯。bFGF組梗死灶中心神經(jīng)細(xì)胞脫失亦較明顯，較缺血再灌注組無明顯差別，缺血半暗帶內(nèi)細(xì)胞形態(tài)較缺血組規(guī)則，腦組織損害程度明顯減輕，見圖1。

Figure 1.The hematoxylin and eosin staining of cerebral cortex of ischemic penumbra(×400).圖1 各組腦缺血半暗帶皮層組織HE染色

2 神經(jīng)功能評(píng)分

假手術(shù)組全部動(dòng)物均未檢測(cè)到神經(jīng)功能缺損(0分)，其余各組大鼠麻醉清醒后即出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損。神經(jīng)功能缺損評(píng)分方差分析:(1)缺血再灌注組與假手術(shù)組比較，神經(jīng)功能缺損程度明顯加重，P＜0.05;(2)bFGF組與缺血再灌注組比較，神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯降低，P＜0.05，見表1。

3 TTC染色測(cè)梗死面積

假手術(shù)組TTC染色后未見有白色梗死區(qū)域，缺血再灌注組與bFGF組可見到明顯蒼白色梗死區(qū)，與缺血再灌注組相比，bFGF組白色梗死區(qū)域明顯減小(P＜0.05)，見表1、圖2。

4 TUNEL染色及光鏡下凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)

光鏡下假手術(shù)組可見少量凋亡細(xì)胞，缺血對(duì)照組可見有大量凋亡細(xì)胞，與假手術(shù)組相比明顯增多，P＜0.05;bFGF組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)與缺血對(duì)照組比較明顯減少，(P＜0.05)，見表1、圖3。

表1 各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分、梗死面積、凋亡細(xì)胞數(shù)目及免疫組化灰度級(jí)比較Table 1.The difference of functional score，infarct size，TUNEL+cell count and fractalkine expression among the three groups

5 Fractalkine免疫組織化學(xué)染色

假手術(shù)組可見fractalkine表達(dá)，缺血再灌注組與假手術(shù)組比較fractalkine表達(dá)減少，P＜0.05，bFGF組與缺血再灌注組比較fractalkine表達(dá)明顯增多，(P＜0.05)，見表1、圖4。

Figure 2.TTC staining of the brain slices 24 h after operation.The pale area represents the infarct region.圖2 術(shù)后24 h腦片TTC染色圖

Figure 3.The TUNEL staining of cerebral cortex of ischemic penumbra in different groups(×400).There were few apoptotic cells in sham group，and there were many apoptotic cells dyed brown in ischemia－refusion group.Compared with ischemia－refusion group，the number of brown cells in bFGF group was significantly reduced.圖3 腦缺血半暗帶皮層組織TUNEL染色

Figure 4.The IHC staining of fractalkine in cerebral cortex of ischemic penumbra(×400).圖4 各組腦缺血半暗帶皮層組織fractalkine免疫組織化學(xué)染色

討 論

缺血性腦損傷的機(jī)制比較復(fù)雜，涉及能量代謝障礙、局部酸中毒、炎癥介質(zhì)釋放、自由基損傷、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、興奮性氨基酸的毒性作用等［2］，其中炎癥反應(yīng)在缺血性腦損傷中起到重要作用，fractalkine(Fkn)即CX3CL1，屬于其中的CX3C家族，是一種新型的炎癥趨化因子，具有不同于其它趨化因子的作用，在生物體中，F(xiàn)kn主要起趨化和黏附作用［3］，Zhuang等［4］發(fā)現(xiàn)Fkn在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的聯(lián)系方面發(fā)揮重要作用。新近大量研究顯示Fkn在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害中起到重要保護(hù)作用，它抑制跨膜蛋白受體Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［5］，并能對(duì)抗谷氨酸的毒性作用，F(xiàn)kn還可阻止脂多糖(lipopolysaccharide)誘導(dǎo)細(xì)胞分泌TNF－α，有效減少損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡［6，7］。本實(shí)驗(yàn)中缺血再灌注組Fkn表達(dá)量較假手術(shù)組明顯減少，細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，進(jìn)一步表明Fkn參與了腦缺血再灌注損傷的病理過程。

尋找確切有效的腦保護(hù)藥物和措施一直是缺血性腦血管疾病研究的熱點(diǎn)，bFGF是一種具有多種生物學(xué)活性的營(yíng)養(yǎng)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，bFGF在保護(hù)神經(jīng)元免受各種因素所致神經(jīng)元變性和死亡中發(fā)揮著重要作用，其受體分布于多種神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜表面，bFGF與受體結(jié)合，引起受體二聚化，產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞效應(yīng)［8］。已有研究表明，腦組織受到各種損傷時(shí)，外源性bFGF可通過血腦屏障而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用［9］，目前認(rèn)為的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制主要涉及以下幾個(gè)方面:(1)抗興奮性氨基酸的興奮毒性作用;(2)阻止Ca2+內(nèi)流，維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)定;(3)降低NO神經(jīng)毒性作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與缺血再灌注組相比，bFGF組fractalkine表達(dá)明顯增多，細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，梗死面積明顯減小，這表明fractalkine具有明顯的抗細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)腦組織對(duì)缺血再灌注損傷的耐受作用;bFGF能減少腦缺血再灌注損傷后缺血半暗帶區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活，其神經(jīng)保護(hù)作用可能通過上調(diào)fractalkine表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。

［1］Ay I，Sugimori H，F(xiàn)inklestein SP.Intravenous basic fibroblast growthfactor(bFGF)decreases DNA fragmentation and prevents downregulation of Bcl－2 expression in the ischemic brain following middle cerebral artery occlusion in rats［J］.Brain Res Mol Brain Res，2001，87(1):71－80.

［2］韓江全，李 均，李官成.葛根素對(duì)大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)、紋狀體區(qū)神經(jīng)元凋亡及膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的影響［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，31(19):1912－1913.

［3］游天祿，黃志芳.Fractalkine及其意義［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè)，2001，21(5):381－383.

［4］Zhuang ZY，Kawasaki Y，Tan PH，et al.Role of the CX3CR1/p38 MAPK pathway in spinal microglia for the development of neuropathic pain following nerve injuryinduced cleavage of fractalkine［J］.Brain Behav Immun，2007，21(5):642 － 651.

［5］Boehme SA，Lio FM，Maciejewski － Lenoir D，et al.The chemokine fractalkine inhibits Fas－mediated cell death of brain microglia［J］.J Immunol，2000，165(1):397 －403.

［6］Kobayashi KS，Chamaillard M，Ogura Y，et al.Noddependent regulation of innate and adaptive immunity in the intestinal tract［J］.Science，2005，307(5710):731 －734.

［7］陳 然，管 晨，孫 益.Fractalkine的神經(jīng)保護(hù)作用［J］.中國(guó)病理生理雜志，2008，24(12):2484 － 2487，2492.

［8］Chua CC，Rahimi N，F(xiàn)orsten － Williams K，et al.Neparam sulfate proteoglycans function as receptors for fibroblast growth fator －2 activation of extracellular signal－regulated kinases 1 and 2［J］.Circ Res，2004，94(3):316 －323.

［9］洪 岸，沈?qū)毩?，?劍，等.堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)缺血再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性的研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2001，17(9):824，850.