徐 倩， 張春來(lái)， 楊 燁， 張春燕， 趙春玲

(瀘州醫(yī)學(xué)院1生理教研室;2生物化學(xué)教研室，四川瀘州646000)

癲癇(epilepsy)是多基因介導(dǎo)的遺傳易感性和后天性諸 多因素等共同促成的一類復(fù)雜的慢性腦部疾病。海馬既是癲癇好發(fā)部位，也是癲癇研究最多的部位［1］。既往研究顯示，癲癇發(fā)作后引起包括腦神經(jīng)元凋亡在內(nèi)的神經(jīng)元死亡，人和動(dòng)物癲癇病灶中存在神經(jīng)元數(shù)目減少現(xiàn)象以海馬神經(jīng)元多見。馬桑內(nèi)酯(Coriaria lactone，CL)是從抗精神病中草藥馬桑寄生中提取的有效成分，具有強(qiáng)烈的致癇作用。采用CL建立癲癇模型是研究癲癇的重要手段［2］。人參皂甙Rb1(ginsenoside Rb1，GRb1)系從人參中提取的單體，可通過(guò)抗氧化、抑制一氧化氮合酶活性、減少一氧化氮的過(guò)量產(chǎn)生、阻止細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流減輕鈣超載;也有報(bào)道［3］提示GRb1具有拮抗海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。但GRb1對(duì)癲癇的治療國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，通過(guò)雙向凝膠電泳(two－dimensional electrophoresis，2－DE)、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等技術(shù)方法，獲得大鼠海馬組織蛋白質(zhì)圖譜，以尋找與CL癲癇損傷及GRb1神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)的蛋白成分，為深入了解癲癇發(fā)病機(jī)制、發(fā)掘早期診斷的標(biāo)志物以及有價(jià)值的治療性靶分子奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

健康成年雄性SD大鼠，體重240－260 g，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供;馬桑內(nèi)酯購(gòu)自華西醫(yī)科大學(xué)制藥廠;人參皂甙Rb1購(gòu)自成都蓉金醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司;蛋白定量和雙向電泳所用試劑均購(gòu)自Bio－Rad。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括:組織勻漿器(北京鼎國(guó)公司)，Labofuge 400R冷凍離心機(jī)(Heraeus)，Protean IEF 電泳儀(Bio－Rad)，Protean II Multi－Cell垂直電泳系統(tǒng)(Bio－Rad)，凝膠圖像掃描儀 PowerLook 1100(UMAX)，4700串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ABI)。

2 方法

2.1 模型制備及動(dòng)物分組 參照柴慧霞等［4］制作的大鼠癲癇模型，并參照Diehl等［5］的癲癇分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)癲癇發(fā)作進(jìn)行分級(jí):0級(jí):無(wú)異常行為;I級(jí):須動(dòng)，咀嚼，跑動(dòng);Ⅱ級(jí):頭面部抽搐;Ⅲ級(jí):上肢或下肢間斷性抽搐;IV級(jí):四肢和軀干持續(xù)節(jié)律性抽搐;V級(jí):四肢和軀干強(qiáng)直性抽搐或伴有翻滾、跌倒等表現(xiàn)。Ⅲ級(jí)及Ⅲ級(jí)以下為輕型發(fā)作，Ⅳ級(jí)及以上為重型發(fā)作。

選取雄性成年SD大鼠30只，隨機(jī)均分為3組:對(duì)照組、CL致癇組和GRb1+CL致癇組。GRb1+CL致癇組大鼠用GRb1(30 mg/kg)每天灌胃1次，連續(xù)3 d，第4 d腹腔注射CL(4 mg/kg)，觀察其行為學(xué)改變。自腹腔注射CL后開始計(jì)時(shí)，3 h后取材。CL致癇組除實(shí)驗(yàn)前3 d用等量生理鹽水灌胃外，余處理同GRb1+CL致癇組。對(duì)照組除第1 d腹腔注射等量生理鹽水外，余處理同CL致癇組。

2.2 樣品制備及雙向電泳 根據(jù)癲癇發(fā)作程度、潛伏期及發(fā)作持續(xù)時(shí)間等確定造模成功。每組各取3只大鼠斷頭處死取腦組織并剝離海馬，取海馬組織60 mg+300 mL裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心1 h，收集的上清液即為蛋白質(zhì)提取物。用Bradford法測(cè)定各樣品的總蛋白含量，分裝，－80℃保存?zhèn)溆?。采?7 cm的線性固定pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)預(yù)制干膠條(pH 4 －7)，每根膠條上樣量260 μg，按照Bio－Rad說(shuō)明書進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦，總伏時(shí)數(shù)約為80 000。隨后按常規(guī)方法進(jìn)行第二向SDS－PAGE。

2.3 數(shù)據(jù)分析及質(zhì)譜鑒定 采用銀染法對(duì)雙向電泳后的凝膠進(jìn)行染色。采用ImageMaster 2D Platinum 5.0分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的差異分析，以GRb1+CL致癇組凝膠作為參考膠分別與對(duì)照組和CL致癇組凝膠進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)匹配，在CL致癇組和GRb1+CL致癇組分別選取相對(duì)表達(dá)量差異達(dá)5倍以上的蛋白斑點(diǎn)各3個(gè)，膠內(nèi)酶切，進(jìn)行 MALDI－TOF－MS鑒定，獲得各蛋白斑點(diǎn)的肽指紋圖譜。再結(jié)合這些蛋白斑點(diǎn)的pI和MW等信息，使用肽指紋圖譜匹配軟件Mascot檢索匹配GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的鑒定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5軟件分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。單變量配對(duì)資料之間的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 大鼠行為學(xué)改變

對(duì)照組大鼠未見癇性發(fā)作。CL組癇性發(fā)作程度較高，在注射CL后15－20 min左右即出現(xiàn)Ⅲ一Ⅳ級(jí)發(fā)作，持續(xù)5－10 min，間隔3－5 min再次發(fā)作，但程度較前次輕，之后發(fā)作間隔時(shí)間延長(zhǎng)，程度逐漸減輕。與CL組相比，Rb1+CL組大鼠的癇性發(fā)作程度明顯減低，潛伏期變長(zhǎng)，持續(xù)時(shí)間變短(P＜0.01)，差異顯著，見表 1、2。

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別比較Table 1.Comparison of seizure intensity among the three groups

表2 各組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期和持續(xù)時(shí)間比較Table 2.Comparison of latent period and duration time among the three groups(min.±s.n=10)

表2 各組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期和持續(xù)時(shí)間比較Table 2.Comparison of latent period and duration time among the three groups(min.±s.n=10)

##P ＜0.01 vs control group;＊＊P ＜0.01 vs CL epileptic group.

Control 0 0 CL epileptic 16.29 ±0.37## 7.51 ±0.48##GRb1+CL epileptic 34.35 ±0.42＊＊ 2.45 ±0.39＊＊

2 蛋白質(zhì)圖譜改變

GRb1+CL 致癇組與CL致癇組和對(duì)照組相比，蛋白質(zhì)圖譜發(fā)生了明顯改變，主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)量的增減和灰度值的變化。GRb1+CL致癇組與對(duì)照組的差異蛋白斑點(diǎn)有84個(gè)，GRb1+CL致癇組與CL致癇組的差異蛋白斑點(diǎn)有120個(gè)，這些表達(dá)差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)絕大部分集中于pH 4.2－6.7的偏酸性區(qū)域，相對(duì)分子量主要介于16－96 kD，見圖1、2。

Figure 1.2－DE maps of proteome from hippocampus of rats in each group.A:control group;B:CL epileptic group;C:GRb1+CL epileptic group.圖1 各組大鼠海馬組織蛋白質(zhì)2－DE圖譜

Figure 2.Identified protein spots by mass spectrometry.A:CL epileptic group;B:GRb1+CL epileptic group.圖2 質(zhì)譜鑒定的蛋白點(diǎn)

3 蛋白質(zhì)鑒定

篩選出的6個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI－TOF－MS檢測(cè)，獲得了各蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的肽指紋圖譜(圖3所示為所檢測(cè)的第6點(diǎn)的蛋白質(zhì)肽指紋圖譜)。鑒定出的這6個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)為腦肌酸激酶(brain creatine kinase)、內(nèi)吞蛋白A1(endophilin－A1)、UPF0628蛋白C10orf96同源物(UPF0628 protein C10orf96 homolog)、細(xì)胞色素P－450(cytochrome P－450)、光導(dǎo)素樣蛋白(phosducin－like protein)及橋整合蛋白3(bridging integrator 3)，見表3。其中前3個(gè)蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于CL致癇組，后3個(gè)蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于對(duì)照組。

Figure 3.Peptide mass fingerprinting of the number 6 protein spot from 2－DE maps of GRb1+CL group.圖3 GRb1+CL組2－DE圖譜中蛋白斑點(diǎn)6的肽指紋圖譜

表3 質(zhì)譜分析鑒定的蛋白質(zhì)Table 3.Identified proteins by mass spectrometry

討 論

已鑒定出6個(gè)差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)，其中腦肌酸激酶、吞蛋白A1和UPF0628蛋白C10orf96同源物在CL致癇組表達(dá)高于GRb1+CL致癇組，由此推測(cè)它們可能與CL所致的癲癇發(fā)作和海馬神經(jīng)元損傷有關(guān)，也可能與GRb1減輕癲癇發(fā)作和神經(jīng)元損傷有關(guān)。

腦肌酸激酶，是在腦內(nèi)催化ATP和肌酸轉(zhuǎn)化為ADP和磷酸肌酸的特殊同工酶，可能在小腦的發(fā)育過(guò)程中參與ATP的產(chǎn)生過(guò)程。有研究表明，腦肌酸激酶活性高低與原發(fā)腦實(shí)質(zhì)損傷程度成正比，損傷越重，對(duì)腦實(shí)質(zhì)破壞范圍越大，腦肌酸激酶活性越高。本實(shí)驗(yàn)中CL致癇組腦肌酸激酶表達(dá)上調(diào)說(shuō)明可能與CL誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)生后引起的腦損傷有關(guān)。同時(shí)腦肌酸激酶在GRb1+CL致癇組表達(dá)下調(diào)說(shuō)明可能是由于GRb1抑制其活性而產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用。內(nèi)吞蛋白A1，是一種脂質(zhì)酵素，屬于內(nèi)吞蛋白家族，含有1個(gè)BAR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域，其功能和磷脂酶A2相反，與突觸囊泡的內(nèi)吞作用相關(guān)，負(fù)責(zé)在細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)。UPF0628蛋白C10orf96同源物屬于UPF0628蛋白質(zhì)家族，其功能尚未闡明。

細(xì)胞色素P－450、光導(dǎo)素樣蛋白和橋整合蛋白 3在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于對(duì)照組，推測(cè)可能是GRb1通過(guò)抑制這3種蛋白質(zhì)的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。細(xì)胞色素P－450是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類含血紅素和硫羥基的蛋白。細(xì)胞色素P－450同工酶是血紅蛋白超級(jí)家族，參與外源性物質(zhì)的代謝，所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能有毒性或致癌性。P－450代謝活性產(chǎn)物造成細(xì)胞損傷有2條途徑［6］:(1)藥物活性代謝產(chǎn)物直接與細(xì)胞內(nèi)大分子如DNA、蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合，破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(壞死);(2)通過(guò)與氧分子作用產(chǎn)生活性氧產(chǎn)物，從而引起細(xì)胞突變，脂質(zhì)過(guò)氧化破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白，大量Ca2+內(nèi)流激活Ca2+依賴蛋白酶和核酸酶，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院Myasoedova認(rèn)為［7］，在一定條件下細(xì)胞色素P－450能夠產(chǎn)生活性氧，最近在線粒體中也發(fā)現(xiàn)微粒體細(xì)胞色素P－450的類似物，推測(cè)它能導(dǎo)致線粒體功能紊亂、細(xì)胞凋亡，還可能參與了一些疾病的發(fā)生。細(xì)胞色素P－450在 GRb1+CL致癇組表達(dá)下調(diào)，說(shuō)明GRb1可能通過(guò)抑制細(xì)胞色素P－450的表達(dá)而起到抗細(xì)胞凋亡的作用。光導(dǎo)素樣蛋白，通常以βγ復(fù)合物的形式存在，是一種GTP結(jié)合蛋白，為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。有研究認(rèn)為［8］，光導(dǎo)素樣蛋白作為分子伴侶參與G蛋白βγ二聚體的裝配過(guò)程，其缺失可抑制G蛋白βγ二聚體的形成，影響G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞過(guò)程。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［9］，胞外信號(hào)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)酪氨酸受體激酶、G蛋白耦聯(lián)受體;神經(jīng)細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞直接接觸都可激活胞內(nèi)蛋白激酶，如絲裂素活化蛋白激酶、蛋白激酶C，通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化、凋亡和誘導(dǎo)神經(jīng)元重組等方式參與難治性癲癇的發(fā)病。橋整合蛋白3，包含1個(gè)BAR結(jié)構(gòu)域，與胞質(zhì)分裂和分隔有關(guān)，在纖絲狀肌動(dòng)蛋白的定位中有一定作用，以解聚時(shí)的球狀肌動(dòng)蛋白或聚合時(shí)的纖絲狀肌動(dòng)蛋白形式存在。正常細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白2種形態(tài)的轉(zhuǎn)換處于動(dòng)態(tài)平衡，共同行使細(xì)胞的變形運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂、基質(zhì)附著和胞間連接等多項(xiàng)功能［10］。它們?cè)诩?xì)胞的形態(tài)維持、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)換及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和分裂等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［11］。

本研究中已鑒定的相關(guān)蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等，提示癲癇發(fā)生和發(fā)展過(guò)程可能涉及相應(yīng)的病理生理過(guò)程。今后將結(jié)合細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從細(xì)胞整體生理活動(dòng)變化的角度分析上述已鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)在癲癇發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)意義，以期獲得對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制更深刻的理解，發(fā)掘出早期診斷的標(biāo)志物以及有價(jià)值的治療性靶分子。

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