徐 倩, 張春來(lái), 楊 燁, 張春燕, 趙春玲
(瀘州醫(yī)學(xué)院1生理教研室;2生物化學(xué)教研室,四川瀘州646000)
癲癇(epilepsy)是多基因介導(dǎo)的遺傳易感性和后天性諸 多因素等共同促成的一類復(fù)雜的慢性腦部疾病。海馬既是癲癇好發(fā)部位,也是癲癇研究最多的部位[1]。既往研究顯示,癲癇發(fā)作后引起包括腦神經(jīng)元凋亡在內(nèi)的神經(jīng)元死亡,人和動(dòng)物癲癇病灶中存在神經(jīng)元數(shù)目減少現(xiàn)象以海馬神經(jīng)元多見。馬桑內(nèi)酯(Coriaria lactone,CL)是從抗精神病中草藥馬桑寄生中提取的有效成分,具有強(qiáng)烈的致癇作用。采用CL建立癲癇模型是研究癲癇的重要手段[2]。人參皂甙Rb1(ginsenoside Rb1,GRb1)系從人參中提取的單體,可通過(guò)抗氧化、抑制一氧化氮合酶活性、減少一氧化氮的過(guò)量產(chǎn)生、阻止細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流減輕鈣超載;也有報(bào)道[3]提示GRb1具有拮抗海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用。但GRb1對(duì)癲癇的治療國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法,通過(guò)雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)、質(zhì)譜分析和生物信息學(xué)等技術(shù)方法,獲得大鼠海馬組織蛋白質(zhì)圖譜,以尋找與CL癲癇損傷及GRb1神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)的蛋白成分,為深入了解癲癇發(fā)病機(jī)制、發(fā)掘早期診斷的標(biāo)志物以及有價(jià)值的治療性靶分子奠定基礎(chǔ)。
健康成年雄性SD大鼠,體重240-260 g,由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科提供;馬桑內(nèi)酯購(gòu)自華西醫(yī)科大學(xué)制藥廠;人參皂甙Rb1購(gòu)自成都蓉金醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司;蛋白定量和雙向電泳所用試劑均購(gòu)自Bio-Rad。主要實(shí)驗(yàn)儀器包括:組織勻漿器(北京鼎國(guó)公司),Labofuge 400R冷凍離心機(jī)(Heraeus),Protean IEF 電泳儀(Bio-Rad),Protean II Multi-Cell垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad),凝膠圖像掃描儀 PowerLook 1100(UMAX),4700串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(ABI)。
2.1 模型制備及動(dòng)物分組 參照柴慧霞等[4]制作的大鼠癲癇模型,并參照Diehl等[5]的癲癇分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)癲癇發(fā)作進(jìn)行分級(jí):0級(jí):無(wú)異常行為;I級(jí):須動(dòng),咀嚼,跑動(dòng);Ⅱ級(jí):頭面部抽搐;Ⅲ級(jí):上肢或下肢間斷性抽搐;IV級(jí):四肢和軀干持續(xù)節(jié)律性抽搐;V級(jí):四肢和軀干強(qiáng)直性抽搐或伴有翻滾、跌倒等表現(xiàn)。Ⅲ級(jí)及Ⅲ級(jí)以下為輕型發(fā)作,Ⅳ級(jí)及以上為重型發(fā)作。
選取雄性成年SD大鼠30只,隨機(jī)均分為3組:對(duì)照組、CL致癇組和GRb1+CL致癇組。GRb1+CL致癇組大鼠用GRb1(30 mg/kg)每天灌胃1次,連續(xù)3 d,第4 d腹腔注射CL(4 mg/kg),觀察其行為學(xué)改變。自腹腔注射CL后開始計(jì)時(shí),3 h后取材。CL致癇組除實(shí)驗(yàn)前3 d用等量生理鹽水灌胃外,余處理同GRb1+CL致癇組。對(duì)照組除第1 d腹腔注射等量生理鹽水外,余處理同CL致癇組。
2.2 樣品制備及雙向電泳 根據(jù)癲癇發(fā)作程度、潛伏期及發(fā)作持續(xù)時(shí)間等確定造模成功。每組各取3只大鼠斷頭處死取腦組織并剝離海馬,取海馬組織60 mg+300 mL裂解液冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min離心1 h,收集的上清液即為蛋白質(zhì)提取物。用Bradford法測(cè)定各樣品的總蛋白含量,分裝,-80℃保存?zhèn)溆?。采?7 cm的線性固定pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)預(yù)制干膠條(pH 4 -7),每根膠條上樣量260 μg,按照Bio-Rad說(shuō)明書進(jìn)行第一向固相pH梯度等電聚焦,總伏時(shí)數(shù)約為80 000。隨后按常規(guī)方法進(jìn)行第二向SDS-PAGE。
2.3 數(shù)據(jù)分析及質(zhì)譜鑒定 采用銀染法對(duì)雙向電泳后的凝膠進(jìn)行染色。采用ImageMaster 2D Platinum 5.0分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)的差異分析,以GRb1+CL致癇組凝膠作為參考膠分別與對(duì)照組和CL致癇組凝膠進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)匹配,在CL致癇組和GRb1+CL致癇組分別選取相對(duì)表達(dá)量差異達(dá)5倍以上的蛋白斑點(diǎn)各3個(gè),膠內(nèi)酶切,進(jìn)行 MALDI-TOF-MS鑒定,獲得各蛋白斑點(diǎn)的肽指紋圖譜。再結(jié)合這些蛋白斑點(diǎn)的pI和MW等信息,使用肽指紋圖譜匹配軟件Mascot檢索匹配GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)的鑒定。
采用SPSS 11.5軟件分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。單變量配對(duì)資料之間的比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。
對(duì)照組大鼠未見癇性發(fā)作。CL組癇性發(fā)作程度較高,在注射CL后15-20 min左右即出現(xiàn)Ⅲ一Ⅳ級(jí)發(fā)作,持續(xù)5-10 min,間隔3-5 min再次發(fā)作,但程度較前次輕,之后發(fā)作間隔時(shí)間延長(zhǎng),程度逐漸減輕。與CL組相比,Rb1+CL組大鼠的癇性發(fā)作程度明顯減低,潛伏期變長(zhǎng),持續(xù)時(shí)間變短(P<0.01),差異顯著,見表 1、2。
表1 各組大鼠癲癇發(fā)作級(jí)別比較Table 1.Comparison of seizure intensity among the three groups
表2 各組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期和持續(xù)時(shí)間比較Table 2.Comparison of latent period and duration time among the three groups(min.±s.n=10)
表2 各組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期和持續(xù)時(shí)間比較Table 2.Comparison of latent period and duration time among the three groups(min.±s.n=10)
##P <0.01 vs control group;**P <0.01 vs CL epileptic group.
Control 0 0 CL epileptic 16.29 ±0.37## 7.51 ±0.48##GRb1+CL epileptic 34.35 ±0.42** 2.45 ±0.39**
GRb1+CL 致癇組與CL致癇組和對(duì)照組相比,蛋白質(zhì)圖譜發(fā)生了明顯改變,主要表現(xiàn)為蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)量的增減和灰度值的變化。GRb1+CL致癇組與對(duì)照組的差異蛋白斑點(diǎn)有84個(gè),GRb1+CL致癇組與CL致癇組的差異蛋白斑點(diǎn)有120個(gè),這些表達(dá)差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)絕大部分集中于pH 4.2-6.7的偏酸性區(qū)域,相對(duì)分子量主要介于16-96 kD,見圖1、2。
Figure 1.2-DE maps of proteome from hippocampus of rats in each group.A:control group;B:CL epileptic group;C:GRb1+CL epileptic group.圖1 各組大鼠海馬組織蛋白質(zhì)2-DE圖譜
Figure 2.Identified protein spots by mass spectrometry.A:CL epileptic group;B:GRb1+CL epileptic group.圖2 質(zhì)譜鑒定的蛋白點(diǎn)
篩選出的6個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè),獲得了各蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的肽指紋圖譜(圖3所示為所檢測(cè)的第6點(diǎn)的蛋白質(zhì)肽指紋圖譜)。鑒定出的這6個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)為腦肌酸激酶(brain creatine kinase)、內(nèi)吞蛋白A1(endophilin-A1)、UPF0628蛋白C10orf96同源物(UPF0628 protein C10orf96 homolog)、細(xì)胞色素P-450(cytochrome P-450)、光導(dǎo)素樣蛋白(phosducin-like protein)及橋整合蛋白3(bridging integrator 3),見表3。其中前3個(gè)蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于CL致癇組,后3個(gè)蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于對(duì)照組。
Figure 3.Peptide mass fingerprinting of the number 6 protein spot from 2-DE maps of GRb1+CL group.圖3 GRb1+CL組2-DE圖譜中蛋白斑點(diǎn)6的肽指紋圖譜
表3 質(zhì)譜分析鑒定的蛋白質(zhì)Table 3.Identified proteins by mass spectrometry
已鑒定出6個(gè)差異表達(dá)的蛋白斑點(diǎn),其中腦肌酸激酶、吞蛋白A1和UPF0628蛋白C10orf96同源物在CL致癇組表達(dá)高于GRb1+CL致癇組,由此推測(cè)它們可能與CL所致的癲癇發(fā)作和海馬神經(jīng)元損傷有關(guān),也可能與GRb1減輕癲癇發(fā)作和神經(jīng)元損傷有關(guān)。
腦肌酸激酶,是在腦內(nèi)催化ATP和肌酸轉(zhuǎn)化為ADP和磷酸肌酸的特殊同工酶,可能在小腦的發(fā)育過(guò)程中參與ATP的產(chǎn)生過(guò)程。有研究表明,腦肌酸激酶活性高低與原發(fā)腦實(shí)質(zhì)損傷程度成正比,損傷越重,對(duì)腦實(shí)質(zhì)破壞范圍越大,腦肌酸激酶活性越高。本實(shí)驗(yàn)中CL致癇組腦肌酸激酶表達(dá)上調(diào)說(shuō)明可能與CL誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)生后引起的腦損傷有關(guān)。同時(shí)腦肌酸激酶在GRb1+CL致癇組表達(dá)下調(diào)說(shuō)明可能是由于GRb1抑制其活性而產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用。內(nèi)吞蛋白A1,是一種脂質(zhì)酵素,屬于內(nèi)吞蛋白家族,含有1個(gè)BAR結(jié)構(gòu)域和1個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域,其功能和磷脂酶A2相反,與突觸囊泡的內(nèi)吞作用相關(guān),負(fù)責(zé)在細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)。UPF0628蛋白C10orf96同源物屬于UPF0628蛋白質(zhì)家族,其功能尚未闡明。
細(xì)胞色素P-450、光導(dǎo)素樣蛋白和橋整合蛋白 3在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于對(duì)照組,推測(cè)可能是GRb1通過(guò)抑制這3種蛋白質(zhì)的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。細(xì)胞色素P-450是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類含血紅素和硫羥基的蛋白。細(xì)胞色素P-450同工酶是血紅蛋白超級(jí)家族,參與外源性物質(zhì)的代謝,所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可能有毒性或致癌性。P-450代謝活性產(chǎn)物造成細(xì)胞損傷有2條途徑[6]:(1)藥物活性代謝產(chǎn)物直接與細(xì)胞內(nèi)大分子如DNA、蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合,破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),導(dǎo)致細(xì)胞凋亡(壞死);(2)通過(guò)與氧分子作用產(chǎn)生活性氧產(chǎn)物,從而引起細(xì)胞突變,脂質(zhì)過(guò)氧化破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白,大量Ca2+內(nèi)流激活Ca2+依賴蛋白酶和核酸酶,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院Myasoedova認(rèn)為[7],在一定條件下細(xì)胞色素P-450能夠產(chǎn)生活性氧,最近在線粒體中也發(fā)現(xiàn)微粒體細(xì)胞色素P-450的類似物,推測(cè)它能導(dǎo)致線粒體功能紊亂、細(xì)胞凋亡,還可能參與了一些疾病的發(fā)生。細(xì)胞色素P-450在 GRb1+CL致癇組表達(dá)下調(diào),說(shuō)明GRb1可能通過(guò)抑制細(xì)胞色素P-450的表達(dá)而起到抗細(xì)胞凋亡的作用。光導(dǎo)素樣蛋白,通常以βγ復(fù)合物的形式存在,是一種GTP結(jié)合蛋白,為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。有研究認(rèn)為[8],光導(dǎo)素樣蛋白作為分子伴侶參與G蛋白βγ二聚體的裝配過(guò)程,其缺失可抑制G蛋白βγ二聚體的形成,影響G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的信號(hào)傳遞過(guò)程。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在難治性癲癇的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[9],胞外信號(hào)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)通過(guò)跨膜結(jié)構(gòu)酪氨酸受體激酶、G蛋白耦聯(lián)受體;神經(jīng)細(xì)胞黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞直接接觸都可激活胞內(nèi)蛋白激酶,如絲裂素活化蛋白激酶、蛋白激酶C,通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元生長(zhǎng)、分化、凋亡和誘導(dǎo)神經(jīng)元重組等方式參與難治性癲癇的發(fā)病。橋整合蛋白3,包含1個(gè)BAR結(jié)構(gòu)域,與胞質(zhì)分裂和分隔有關(guān),在纖絲狀肌動(dòng)蛋白的定位中有一定作用,以解聚時(shí)的球狀肌動(dòng)蛋白或聚合時(shí)的纖絲狀肌動(dòng)蛋白形式存在。正常細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白2種形態(tài)的轉(zhuǎn)換處于動(dòng)態(tài)平衡,共同行使細(xì)胞的變形運(yùn)動(dòng)、胞質(zhì)分裂、基質(zhì)附著和胞間連接等多項(xiàng)功能[10]。它們?cè)诩?xì)胞的形態(tài)維持、物質(zhì)運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量轉(zhuǎn)換及細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和分裂等多個(gè)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[11]。
本研究中已鑒定的相關(guān)蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等,提示癲癇發(fā)生和發(fā)展過(guò)程可能涉及相應(yīng)的病理生理過(guò)程。今后將結(jié)合細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從細(xì)胞整體生理活動(dòng)變化的角度分析上述已鑒定的差異表達(dá)蛋白質(zhì)在癲癇發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的生物學(xué)意義,以期獲得對(duì)癲癇發(fā)病機(jī)制更深刻的理解,發(fā)掘出早期診斷的標(biāo)志物以及有價(jià)值的治療性靶分子。
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