王露茜， 賈 靜， 郭明發(fā)， 張 耀， 張翔宇， 郭軍軍， 耿若君， 李 炳， 鐘 華， 李東亮△

(1新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)教研室，河南新鄉(xiāng)453003;2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海200025;)

一氧化氮(nitric oxide，NO)在缺血性腦損傷中具有損傷及保護(hù)雙重作用，與組織損傷的發(fā)展進(jìn)程和產(chǎn)生一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的類(lèi)型密切相關(guān)。在腦組織中，L－精氨酸(L－arginine，L－Arg)作為底物在NOS的作用下生成NO。將NO前體和NOS抑制劑應(yīng)用于腦缺血的研究已有報(bào)道，但作用結(jié)果尚有爭(zhēng)議［1］。L－Arg在精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase，ADC)作用下脫羧基產(chǎn)生胍丁胺(agmatine，AGM)。AGM作為一種新型神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)，具有增強(qiáng)阿片類(lèi)藥物鎮(zhèn)痛效果、減少缺血再灌注損傷、保護(hù)神經(jīng)元等作用［2］。因其具有良好的藥理學(xué)鎮(zhèn)痛作用，因此將其應(yīng)用于腦損傷的治療將具有雙重療效。但AGM和NO的相互作用目前尚無(wú)一致報(bào)道［3］。本實(shí)驗(yàn)利用線(xiàn)栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，在大鼠腦缺血后分別給予NO前體L－Arg、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)抑制劑氨基胍(aminoguanidine，AG)及AGM，求證它們對(duì)缺血性腦損傷的保護(hù)作用，并探討各自的腦保護(hù)作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

L－Arg、AG和AGM購(gòu)自Sigma;iNOS免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司;NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物工程有限公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康成年雄性Sprague－Dawley大鼠90只，清潔級(jí)，體重(280±20)g，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將75只大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、AG組、L－Arg組和AGM組，每組15只。每組根據(jù)再灌注時(shí)間又隨機(jī)分為再灌注12 h組、再灌注24 h組和再灌注72 h組，每組5只。假手術(shù)組只作頸部切開(kāi)，分離頸總動(dòng)脈但不插拴線(xiàn);AG組、L－Arg組和AGM組均于缺血模型成功建立后即刻給藥，AG組腹腔注射給予AG(100 mg/kg)1 mL，L－Arg組腹腔注射給予L－Arg(500 mg/kg)1 mL，AGM組尾靜脈給予AGM(40 mg/kg)1 mL;模型組腹腔注射等容積的滅菌生理鹽水。

2.2 動(dòng)物模型的制備 參照Longa等［4］的線(xiàn)栓法，采用頸內(nèi)動(dòng)脈線(xiàn)栓法建立大鼠右側(cè)MCAO模型。大腦中動(dòng)脈栓塞2 h后，乙醚麻醉下抽出栓線(xiàn)，恢復(fù)大腦中動(dòng)脈血液灌注。再灌注后20 min待動(dòng)物清醒，參照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)給予行為學(xué)評(píng)分:無(wú)神經(jīng)病學(xué)征象為0分;豎毛，輕度運(yùn)動(dòng)低下為0.5分，前肢屈曲，有運(yùn)動(dòng)障礙為1分;行動(dòng)不協(xié)調(diào)，屈曲姿勢(shì)，旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)為2分;偏癱，不能站立行走為3分;痙攣，昏睡為4分，死亡為5分。分?jǐn)?shù)越高，動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。

2.3 取材與NO檢測(cè) 用水合氯醛(3 mL·kg－1)麻醉大鼠后迅速打開(kāi)胸腔暴露心臟，右心室取血 3 mL，3 000 r·min－1，離心 10 min，提上清，打入 1 mL Eppendorf管中置于超低溫冰箱待用。將灌注針頭迅速自左心室插入到升主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，依次灌注生理鹽水100 mL，多聚甲醛(20 g·L－1，pH 7.4)300 mL，3 h完畢。大鼠斷頭取腦，置于多聚甲醛(20 g·L－1，4 ℃)24 h ，常規(guī)脫水，在 20% 蔗糖溶液和30%蔗糖溶液進(jìn)一步脫水固定。冰凍切片厚10 μm，放入腦片保護(hù)液中4℃保存1 d。大腦切片進(jìn)行常規(guī)蘇木素伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，觀察腦內(nèi)海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及損傷情況。血清NO含量測(cè)定時(shí)，先取出備用血清，用Bio Tek ELX800酶標(biāo)儀，嚴(yán)格按NO檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)NO含量。

2.4 iNOS表達(dá)檢測(cè) 以免疫組化ABC法觀察腦內(nèi)iNOS表達(dá)變化。顯微鏡下計(jì)數(shù)各組每只大鼠相應(yīng)腦區(qū)內(nèi)iNOS陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)。在高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算平均百分率。根據(jù)細(xì)胞染色程度和著色細(xì)胞比例確定計(jì)分:不染色=0，輕度染色=1，中度染色=2，強(qiáng)染色=3;無(wú)細(xì)胞著色=0，＜25%細(xì)胞著色=1，26% －50%細(xì)胞著色=2，51% －75%細(xì)胞著色=3，＞75%細(xì)胞著色=4。兩者計(jì)分之和大于或等于2為陽(yáng)性，2－3分為+;4－5分為++;6－7分為+++。結(jié)果的判定由2位不知實(shí)驗(yàn)資料情況的臨床病理醫(yī)師進(jìn)行計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 大鼠行為學(xué)變化

各組大鼠行為學(xué)評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。缺血再灌注12 h，LArg組行為學(xué)評(píng)分顯著低于模型組(P＜0.05);AG組(P＜0.01)和AGM組(P＜0.05)在缺血再灌注24 h，其行為學(xué)評(píng)分均顯著低于模型組，而在缺血再灌注12 h，均明顯高于LArg組(P＜0.05)。其余指標(biāo)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 術(shù)后12、24、72 h 5組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分Table 1.The neurobehavioral scores in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

表1 術(shù)后12、24、72 h 5組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分Table 1.The neurobehavioral scores in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs L － Arg group.

Group 12 h 24 h 72 h Sham operation 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 3.00 ±1.22 Model 3.40 ±0.89 3.80 ±0.45 3.80 ±0.84 L －Arg 2.35 ±0.38* 3.00 ±0.71 3.20 ±0.84 AG 3.20 ±0.44△ 2.40 ±0.71＊＊ 3.00 ±0.71 AGM 3.00 ±0.71△ 2.60 ±0.55*

2 血清NO含量變化

各組大鼠血清中NO含量結(jié)果見(jiàn)表2。與假手術(shù)組相比，模型組、L－Arg組、AG組和 AGM組在缺血再灌注12、24、72 h的NO含量均顯著增加(P＜0.05);與模型組相比，LArg組在缺血再灌注12 h的NO含量顯著升高(P＜0.01);AG組和AGM組在缺血再灌注24、72 h的NO含量顯著降低(P＜0.05)。AG組和 AGM組在缺血再灌注12、24、72 h的NO含量均顯著低于L－Arg組(P＜0.05);其余指標(biāo)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 術(shù)后12、24、72 h 5組大鼠血清中NO含量Table 2.The content of NO in serum in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

表2 術(shù)后12、24、72 h 5組大鼠血清中NO含量Table 2.The content of NO in serum in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation(±s.n=5)

#P ＜0.05 vs sham operation group;*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;△P ＜0.05 vs L－Arg group.

Sham operation 946.60 ±214.31 1 093.30±465.83 884.66±295.69 Model 2 500.00±480.10# 3 872.20±449.62# 3 600.00±443.12#L －Arg 4 366.60 ±696.04#＊＊ 3 886.50±360.68# 3 500.00 ±488.61#AG 2 286.60±447.23#△ 3 133.30±320.07#＊△2 966.60±702.37#＊△AGM 2 260.0±408.74#△ 2 841.60±403.95#＊△2 611.10±454.73#＊△

3 HE染色病理觀察

光鏡下假手術(shù)組腦組織未見(jiàn)明顯異常;隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組手術(shù)側(cè)的海馬區(qū)和皮層區(qū)組織均出現(xiàn)明顯改變，擴(kuò)張的血管周?chē)兄行粤＜?xì)胞浸潤(rùn)，神經(jīng)元細(xì)胞可見(jiàn)核周水腫，細(xì)胞輪廓消失、溶解等壞死性改變等程度加重。與模型組相比，L－Arg 12 h組、AG 24 h組和AGM 24 h組病變范圍明顯縮小，變性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，間質(zhì)水腫程度明顯減弱。

4 iNOS的表達(dá)

各組大鼠免疫組織化學(xué)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表3。與假手術(shù)組相比，各時(shí)點(diǎn)模型組及治療組的iNOS陽(yáng)性細(xì)胞均明顯增加(P＜0.05)。與模型組相比，缺血再灌注L－Arg組iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在3個(gè)時(shí)點(diǎn)無(wú)顯著差異(P＞0.05)，而AG組、AGM組均明顯減少(P＜0.05)。而與L－Arg組相比，AG組和AGM組的iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在3個(gè)時(shí)點(diǎn)均顯著降低(P＜0.05)。AG組和AGM組相比，在3個(gè)時(shí)點(diǎn)iNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

Figure 1.Neuronal changes in different groups 12 h and 24 h after reperfusion following ischemia(HE staining，×400).A:sham operation group(12 h);B:model group(12 h);C:L－Arg group(12 h);D:model group(24 h);E:AG group(24 h);F:AGM group(24 h).

圖1 各組大鼠缺血再灌注12 h和24 h后神經(jīng)元變化表3 5組大鼠免疫組化iNOS陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)情況Table 3.Positive cells with iNOS protein in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation detected by immunohistochemical method(±s.n=5)

圖1 各組大鼠缺血再灌注12 h和24 h后神經(jīng)元變化表3 5組大鼠免疫組化iNOS陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)情況Table 3.Positive cells with iNOS protein in the 5 groups 12 h，24 h and 72 h after operation detected by immunohistochemical method(±s.n=5)

#P＜0.05 vs sham operation group;*P＜0.05 vs model group;△P＜0.05 vs L－Arg group.

Group 12 h 24 h 72 h Sham operation 0.40 ±0.55 0.40 ±0.55 0.20 ±0.03 Model 5.20 ±0.84# 5.20 ±1.10# 4.95 ±0.11#L － Arg 5.16 ±0.29# 4.60 ±0.55# 5.20 ±0.25#AG 1.80 ±0.84#＊△ 3.20 ±0.45#＊△ 4.08 ±0.88#＊△AGM 1.86 ±0.11#＊△ 3.31 ±0.18#＊△ 3.92 ±0.11#＊△

討 論

作為強(qiáng)烈的血管舒張因子和信息物質(zhì)，NO在急性局灶性腦缺血損傷中的作用倍受研究者關(guān)注。NOS是NO合成的關(guān)鍵因素，體內(nèi)NO含量的多少及其生物作用完全依賴(lài)于NOS的活性。因此，對(duì)NOS的測(cè)定是深入研究NO生理病理作用的重要環(huán)節(jié)。NOS在腦內(nèi)至少有3種同工酶，分別為神經(jīng)元型 NOS(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、iNOS和內(nèi)皮型NOS(endothelial nitric oxide synthase，eNOS);其中nNOS和eNOS為結(jié)構(gòu)型同工酶(constitutive nitric oxide synthase，cNOS)，與維持神經(jīng)傳遞和血管舒張等生理功能有關(guān);iNOS為誘導(dǎo)型同工酶，廣泛存在于小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、中性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中［5］。在生理情況下，iNOS并不表達(dá);但病理?xiàng)l件下，一些細(xì)胞可誘導(dǎo)iNOS基因轉(zhuǎn)錄，啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成，生成大量iNOS。iNOS的高表達(dá)產(chǎn)生大量的NO導(dǎo)致后續(xù)的過(guò)氧脂質(zhì)化過(guò)程可引起DNA斷裂、神經(jīng)元凋亡和血腦屏障開(kāi)放，因此iNOS被認(rèn)為是一種“病理型”酶［6］。

本實(shí)驗(yàn)中，與模型組相比，L－Arg組在缺血再灌注12 h血清中NO含量顯著升高，而大鼠行為學(xué)評(píng)分也有明顯改善，HE染色發(fā)現(xiàn)病變范圍縮小，變性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少。該結(jié)果與以往研究相符，證實(shí)在腦缺血再灌注損傷早期，由NOS催化底物L(fēng)－Arg生成一定量的NO可起保護(hù)作用。但是隨著缺血再灌注損傷的延續(xù)，以及NO釋放“第二窗”的開(kāi)始，缺血再灌注損傷24 h后，iNOS催化產(chǎn)生的NO逐漸增多［7］，而大劑量的NO則產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)給予大鼠iNOS抑制劑(AG)治療后，可觀察到各時(shí)點(diǎn)大鼠血清中NO含量均較模型組有所下降，其中缺血再灌注24 h AG組NO含量顯著降低，行為學(xué)評(píng)分和腦組織病理性變化也有顯著改善。但L－Arg在24 h、AG在12 h對(duì)腦組織保護(hù)作用不明顯。

Figure 2.Expression of iNOS protein in different groups 12 h and 24 h after reperfusion following ischemia(immunohistochemical staining，×200).A:sham operation group(12 h);B:model group(12 h);C:L－Arg group(12 h);D:model group(24 h);E:AG group(24 h);F:AGM group(24 h).圖2 各組大鼠缺血再灌注12 h和24 h后iNOS 蛋白表達(dá)

有報(bào)道認(rèn)為，AGM是NO合成的前體，且其舒血管作用可完全被NOS抑制劑L－NAME或去除肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞所取消［8］。而Galea等［9］研究結(jié)果顯示，AGM 不是NO 的前體，而是NOS的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可抑制NO的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)中AGM組在缺血再灌注12 h、24 h、72 h腦組織中NO含量均較模型組有所降低，且最大抑制活性發(fā)生在缺血再灌注24 h。在暫時(shí)性腦缺血模型中，iNOS在6 h就有表達(dá)，6－24 h作用明顯［10］，因此我們推測(cè)AGM是NOS競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，且主要抑制iNOS。

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，我們?cè)俅斡^察到NO參與缺血性腦損傷的發(fā)展及其雙重作用。它們可能通過(guò)不同機(jī)制對(duì)缺血腦組織起不同作用，依賴(lài)于NO的不同來(lái)源和NOS在腦缺血不同時(shí)期的表達(dá)。腦缺血早期NO具有保護(hù)作用的機(jī)制可能是:升高平滑肌cGMP水平舒張腦血管;抑制血小板或白細(xì)胞黏附聚集;阻斷N－甲基－D－天冬氨酸(N－methyl－D－aspartate，NMDA)受體［11］;對(duì)突觸傳遞介質(zhì)的調(diào)節(jié);降低神經(jīng)元胞漿中游離鈣的水平。但是，其詳細(xì)作用機(jī)理及臨床應(yīng)用效果有待進(jìn)一步深入研究。腦AGM作為一種內(nèi)源性物質(zhì)，能阻斷NMDA受體通道，進(jìn)入神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞后則調(diào)節(jié)NOS的表達(dá)及活性，抑制一氧化氮合酶(NOS)活性［12］。缺血再灌注后期，腦組織內(nèi)iNOS生成過(guò)量NO加重缺血再灌注損傷。但以往的研究認(rèn)為iNOS選擇性抑制劑AG，主要抑制NOS活性，減少NO生成，從而減輕過(guò)量NO介導(dǎo)的興奮性氨基酸毒性、減少氧自由基的生成、鈣超載、線(xiàn)粒體損傷等造成的缺血腦損傷［13，14］。但我們的研究發(fā)現(xiàn):應(yīng)用AG和AGM后，iNOS的蛋白表達(dá)均出現(xiàn)了下降，通過(guò)減少iNOS的數(shù)量減少NO的大量生成。但AG和AGM抑制作用的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，12 h內(nèi)我們可以應(yīng)用L－Arg來(lái)促進(jìn)NO的釋放，12－24 h之間可以應(yīng)用AG、AGM抑制NO的產(chǎn)生。這2種方法可用于保護(hù)腦組織。選擇具有高度選擇性、高效低毒的臨床新藥，同時(shí)選擇合適的給藥時(shí)機(jī)和給藥途徑，將為臨床缺血性卒中早期治療開(kāi)辟新的途徑，也為早期用溶栓等方法恢復(fù)腦血供后預(yù)防缺血再灌注損傷提供更佳的治療方案。

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