郭 堯, 楊智勇, 王春友
(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺病研究所,湖北武漢430022)
腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)最早于1975年被發(fā)現(xiàn),是由活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種能使腫瘤發(fā)生出血壞死的物質(zhì)[1]。在對(duì)TNF-α研究后發(fā)現(xiàn),TNF-α是一種重要的炎癥因子,促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展[2]。在多種因素的刺激作用下,TNF-α可以快速地表達(dá)分泌,在數(shù)小時(shí)后就可以達(dá)到分泌高峰水平[3,4]。TNF-α的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過程,包括轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平、翻譯后水平等等[5]。脊椎動(dòng)物DNA甲基化最顯著的特征是在基因組的某些區(qū)域內(nèi),富含密度較高的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu),即CpG島[6]。CpG島結(jié)構(gòu)廣泛存在于各種組織細(xì)胞基因中,在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用[7]。TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域無典型CpG島結(jié)構(gòu),但有散在的CpG雙核苷酸,這些CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)與核因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、cAMP應(yīng)答元件(cyclic AMP response element,CRE)、AP-1、Sp1、AP -2等一些重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切[8]。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞,對(duì)不同時(shí)點(diǎn)TNF-α表達(dá)水平與其基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行了研究,探討TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域散在CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)的甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系。
人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞購于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。RPMI-1640液體培養(yǎng)基購于Gibco,4℃保存。胎牛血清購于Gibco,-20℃保存。LPS購于Sigma。TNF-α酶聯(lián)免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒購于武漢博士德公司。DNA提取試劑盒購于Promega。甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒購于Qiagen。DNA純化回收試劑盒購于TaKaRa。
2.1 細(xì)胞培養(yǎng) THP-1細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開始用于實(shí)驗(yàn)。
2.2 TNF-α分泌峰值測(cè)定 使用終濃度為1 mg/L LPS刺激不同樣本THP-1細(xì)胞,每個(gè)樣本的細(xì)胞濃度為1.0 × 109cells/L。分別刺激 0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液,以 1 000 r/min離心5 min,取上清液,通過ELISA方法測(cè)定TNF-α蛋白分泌量,每個(gè)樣本做雙份測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次,結(jié)果以刺激不同時(shí)間的分泌量與未刺激時(shí)分泌量比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sE)表示。使用方差分析對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)分泌量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。
2.3 DNA甲基化轉(zhuǎn)化 將培養(yǎng)細(xì)胞分為3組。對(duì)照組:細(xì)胞不使用任何炎癥介質(zhì)刺激。1 mg/L LPS(4 h)組:細(xì)胞使用1 mg/L LPS刺激4 h。1 mg/L LPS(8 h)組:細(xì)胞使用1 mg/L LPS刺激8 h。刺激時(shí)間結(jié)束后,使用DNA提取試劑盒,分別從每組細(xì)胞中提取基因組DNA。提取的DNA采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。使用甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒,對(duì)所提取基因組DNA進(jìn)行甲基化轉(zhuǎn)化。該試劑盒采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法。轉(zhuǎn)化后分別純化回收每組樣本DNA。
2.4 PCR擴(kuò)增 分別對(duì)每組甲基化轉(zhuǎn)化后的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對(duì)TNF-α啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)甲基化PCR擴(kuò)增引物。正向引物5'-ccaaaagaaatggaggcaatag- 3',逆向引物 5'- gaccagctaagagggagagaag-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物為啟動(dòng)子區(qū)域-344到+57位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增后,對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使用DNA純化回收試劑盒對(duì)凝膠電泳后每組DNA片段分別進(jìn)行純化回收。
2.5 轉(zhuǎn)化及篩選 將純化回收的甲基化轉(zhuǎn)化后DNA片段通過TA連接進(jìn)入T載體,連接后將載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌,接種于新制含氨芐西林、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside,X-gal)和異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)的LB瓊脂培養(yǎng)板,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出培養(yǎng)板,挑選單克隆白色菌落再次接種于新制LB瓊脂培養(yǎng)板,于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后挑選單克隆白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中搖菌過夜。
2.6 基因測(cè)序 細(xì)菌培養(yǎng)后,送新鮮菌液進(jìn)行DNA測(cè)序。每組樣本選取5個(gè)克隆送Invitrogen公司測(cè)序。每組樣本測(cè)序結(jié)果以CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)甲基化數(shù)占擴(kuò)增區(qū)域總CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)數(shù)的百分率表示。采用χ2檢驗(yàn)比較間差異。
使用終濃度為1 mg/L LPS刺激THP-1細(xì)胞。培養(yǎng)液上清TNF-α分泌水平在刺激后2 h明顯升高。刺激4 h達(dá)到分泌高峰,濃度為未刺激時(shí)的(48.9±1.06)倍,與未刺激時(shí)相比明顯升高(P<0.01)。4 h后開始下降,刺激8 h有明顯降低,濃度為未刺激時(shí)的(36.30±1.65)倍,與刺激4 h時(shí)相比明顯下降(P<0.01),見圖1。各組甲基化率與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)TNF-α分泌量比值之間呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.99,P<0.01)。
Figure 1.The secretion level of TNF-α in LPS-stitmulatedTHP-1 cells.THP -1 cells were stimulated with 1mg/L LPS for the indicated time.The data were presented as ratios relative to unstimulated cells(0 h).±sE.n=4.**P <0.01 vs 0 h;△△P <0.01 vs 4 h.圖1 LPS刺激下THP-1細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α濃度的變化
基因測(cè)序結(jié)果表明,未受LPS刺激的THP-1細(xì)胞,其TNF-α基因啟動(dòng)子-344 bp到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site,TSS)區(qū)域內(nèi),11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)均處于甲基化狀態(tài),見圖2B。1 mg/L LPS刺激4 h后,TNF-α基因啟動(dòng)子-344 bp到TSS區(qū)域內(nèi)11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)中,僅有4個(gè)仍處于甲基化狀態(tài)。其中-119、-72、-49、-38等幾個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切的位點(diǎn),其CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)已去甲基化,見圖2C。1 mg/L LPS刺激8 h后,該區(qū)域內(nèi)11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)中,有9個(gè)處于甲基化狀態(tài)。其中-238、-169、-163、-161、-119、-72、-49等幾個(gè)位點(diǎn)開始恢復(fù)甲基化狀態(tài),-146和-38位點(diǎn)處于去甲基化狀態(tài)。-119、-72、-49等幾個(gè)與TF結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切的位點(diǎn),其CpG雙核苷酸處于甲基化狀態(tài),見圖2D。
Figure 2.The TNF - α promoter fragment ranging from -344 bp to TSS was analyzed by bisulfite sequencing.Filled black circles represent≥80%methylation at a given CpG after sequencing 5 individual clones.Open circles represent<20%methylation at a given CpG.Half-filled black circles represent between 20%and 80%methylation at a given CpG.A:the fragment contains 11 CpG dinucleotides(arrow:↑)and the TF binding sites for AP -1,AP -2,Sp1,NF - κB as well as cAMP response element(CRE)and TATA box;B:methylation status of gene promoter in unstimulated THP-1 cells;C:methylation status of gene promoter in 4 h LPS-stimulated THP-1 cells;D:methylation status of gene promoter in 8 h LPS-stimulated THP-1 cells.圖2 TNF-α基因啟動(dòng)子-344 bp到TSS區(qū)域甲基化狀態(tài)
TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域測(cè)序結(jié)果表明,CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)平均甲基化率,對(duì)照組為100%;1 mg/L LPS(4 h)組為21.8%;兩者之間差異顯著(P<0.01)。CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)平均甲基化率,1 mg/L LPS(8 h)組為41.8%,與1 mg/L LPS(4 h)組之間差異顯著(P<0.05)。
基因序列中存在的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu),其甲基化狀態(tài)對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用[5,8,9]。脊椎動(dòng)物DNA甲基化最顯著的特征是富含CpG島,即在基因組的某些區(qū)域內(nèi),富含密度較高的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)[6]。DNA甲基化影響基因表達(dá)的一個(gè)機(jī)制是甲基化CpG結(jié)構(gòu)直接影響TF與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,從而抑制轉(zhuǎn)錄[10]。查找TNF-α基因序列,發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域無典型CpG島結(jié)構(gòu)。此次實(shí)驗(yàn)采用基因測(cè)序法研究TNF-α基因啟動(dòng)子-344 bp到+57 bp區(qū)域,其中-344 bp到TSS區(qū)域內(nèi)含11個(gè)散在的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)。此區(qū)域內(nèi)還含有NF-κB、CRE、AP-1、Sp1、AP-2等關(guān)鍵 TF結(jié)合位點(diǎn),見圖 2A。其中,-119、-72、-49、-38等幾個(gè)位點(diǎn)的 CpG 雙核苷酸結(jié)構(gòu)與這些TF結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切。因此此區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)可能在TNF-α的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。
目前,對(duì)DNA甲基化的研究方法主要有甲基化特異性PCR法、限制性內(nèi)切酶甲基化分析法、重亞硫酸鹽甲基化測(cè)序法等,其中以重亞硫酸鹽測(cè)序法最為可靠和直觀[11]。本次實(shí)驗(yàn)采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化基因測(cè)序法對(duì)LPS刺激的THP-1細(xì)胞進(jìn)行研究。
本研究測(cè)定的THP-1細(xì)胞TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域含有11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu),未受刺激時(shí)均處于甲基化狀態(tài)。在受到LPS刺激后,TNF-α分泌在4 h達(dá)到高峰。此時(shí),所測(cè)序的5個(gè)克隆中,甲基化率達(dá)到或高于80%的位點(diǎn)只有1個(gè),甲基化率介于20%到80%之間的只有3個(gè),其余均處于去甲基化狀態(tài),整體甲基化水平最低,提示TNF-α基因表達(dá)增高與其啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化狀態(tài)有關(guān)。在LPS刺激8 h后,TNF-α分泌已開始降低,其基因啟動(dòng)子區(qū)域的11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)已開始部分恢復(fù)甲基化狀態(tài),甲基化率達(dá)到或高于20%的位點(diǎn)有9個(gè),其中甲基化率達(dá)到或高于80%的有2個(gè),只有2個(gè)位點(diǎn)為去甲基化狀態(tài),1個(gè)位點(diǎn)繼續(xù)保持去甲基化。
總體上來看,當(dāng)TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域散在的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)甲基化水平較高時(shí),基因不表達(dá)或低表達(dá);當(dāng)其甲基化水平較低時(shí),基因高表達(dá)。TNF-α分泌量與TNF-α啟動(dòng)子區(qū)域整體甲基化水平呈明顯負(fù)相關(guān)。從每一個(gè)CpG雙核苷酸位點(diǎn)情況來看,-238、-169、-163、-161、-119、-72和-49這幾個(gè)位點(diǎn)的甲基化率與TNF-α分泌量相關(guān)性和整體水平一致。-119、-72和-49位點(diǎn)與部分重要TF結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切,因此可能通過影響 TF與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合,從而抑制轉(zhuǎn)錄。而-303、-146和-38這3個(gè)位點(diǎn)甲基化率與TNF-α分泌量無明顯相關(guān)性,其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。
TNF-α是參與炎癥反應(yīng)的重要因子。TNF-α通過刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子,使之易黏附于白細(xì)胞,刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子,引起白細(xì)胞在炎癥部位聚集,產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[12]。TNF-α基因的表達(dá),受多種因素的調(diào)控。近年來對(duì)TNF-α基因的表達(dá)調(diào)控研究較多的,是各種炎癥介質(zhì)的影響,以及各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用[3,4]。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)毒素或其它一些炎癥介質(zhì)刺激時(shí),相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域特異性位點(diǎn)結(jié)合,使TNF-α基因轉(zhuǎn)錄開始或上調(diào),表達(dá)TNF-α[13]。除基因本身的改變外,表觀遺傳方式對(duì)TNF-α的表達(dá)調(diào)控作用還并不十分清楚。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同TNF-α表達(dá)水平與其基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平具有負(fù)相關(guān)性。TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)是否直接導(dǎo)致基因表達(dá)的改變,如果直接導(dǎo)致其改變又是通過何種具體機(jī)制影響基因的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。
[1]Carswell EA,Old LJ,Kassel RL,et al.An endotoxin -induced serum factor that causes necrosis of tumors[J].Proc Natl Acad Sci USA,1975,72(9):3666-3670.
[2]Pfeffer K.Biological functions of tumor necrosis factor cytokines and their receptors[J].Cytokine Growth Factor Rev,2003,14(3-4):185-191.
[3]Lee JY,Sullivan KE.Gamma interferon and lipopolysaccharide interact at the level of transcription to induce tumor necrosis factor alpha expression [J].Infect Immun,2001,69(5):2847-2852.
[4]張 方,李子玲,施 毅,等.LPS致大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NF-κB促進(jìn)TNF-α分泌[J].中國(guó)病理生理雜志,2007,23(7):1412 -1414.
[5]Sullivan KE,Reddy AB,Dietzmann K,et al.Epigenetic regulation of tumor necrosis fctor alpha[J].Mol Cell Blol,2007,27(14):5147-5160.
[6]Bird AP.CpG islands as gene markers in the vertebrate nucleus[J].Trends Genet,1987,3(1):342 -347.
[7]Han L,Zhao ZM.CpG islands or CpG clusters:how to identify functional GC -rich regions in a genome?[J].BMC Bioinformatics,2009,10:65.
[8]Pieper HC,Evert BO,Kaut O,et al.Different methylation of the TNF-alpha promoter in cortex and substantia nigra:Implications for selective neuronal vulnerability[J].Neurobiol Dis,2008,32(3):521 -527.
[9]Zhang Q,Wang HY,Bhutani G.Lack of TNFα expression protects anaplastic lymphoma kinase-positive T-cell lymphoma(ALK+TCL)cells from apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(37):15843 -15848.
[10]Bird AP.DNA methylation patterns and epigenetic memory[J].Genes Dev,2002,16(1):6 -21.
[11]Frommer M,McDonald LE,Millar DS,et al.A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89(5):1827-1831.
[12]Moon MK,Lee YJ,Kim JS,et al.Effect of caffeic acid on tumor necrosis factor-alpha-induced vascular inflammation in human umbilical vein endothelial cells[J].Biol Pharm Bull,2009,32(8):1371 -1377.
[13]Tsai EY,F(xiàn)alvo JV,Tsytsykova AV,et al.A lipopolysaccharide-specific enhancer complex involving Ets,Elk-1,Sp1,and CREB binding protein and p300 is recruited to the tumor necrosis factor alpha promoter in vivo[J].Mol Cell Biol,2000,20(16):6084 -6094.