郭 堯， 楊智勇， 王春友

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院胰腺病研究所，湖北武漢430022)

腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF－α)最早于1975年被發(fā)現(xiàn)，是由活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種能使腫瘤發(fā)生出血壞死的物質(zhì)［1］。在對(duì)TNF－α研究后發(fā)現(xiàn)，TNF－α是一種重要的炎癥因子，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展［2］。在多種因素的刺激作用下，TNF－α可以快速地表達(dá)分泌，在數(shù)小時(shí)后就可以達(dá)到分泌高峰水平［3，4］。TNF－α的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，包括轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平、翻譯后水平等等［5］。脊椎動(dòng)物DNA甲基化最顯著的特征是在基因組的某些區(qū)域內(nèi)，富含密度較高的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)，即CpG島［6］。CpG島結(jié)構(gòu)廣泛存在于各種組織細(xì)胞基因中，在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用［7］。TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域無(wú)典型CpG島結(jié)構(gòu)，但有散在的CpG雙核苷酸，這些CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)與核因子κB(nuclear factorκB，NF－κB)、cAMP應(yīng)答元件(cyclic AMP response element，CRE)、AP－1、Sp1、AP －2等一些重要的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切［8］。本研究采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激人單核細(xì)胞系THP－1細(xì)胞，對(duì)不同時(shí)點(diǎn)TNF－α表達(dá)水平與其基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)進(jìn)行了研究，探討TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域散在CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)的甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)調(diào)控之間的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

人單核細(xì)胞系THP－1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。RPMI－1640液體培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco，4℃保存。胎牛血清購(gòu)于Gibco，－20℃保存。LPS購(gòu)于Sigma。TNF－α酶聯(lián)免疫分析(enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司。DNA提取試劑盒購(gòu)于Promega。甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒購(gòu)于Qiagen。DNA純化回收試劑盒購(gòu)于TaKaRa。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) THP－1細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)液中，置于含5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)開始用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 TNF－α分泌峰值測(cè)定 使用終濃度為1 mg/L LPS刺激不同樣本THP－1細(xì)胞，每個(gè)樣本的細(xì)胞濃度為1.0 × 109cells/L。分別刺激 0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、8 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液，以 1 000 r/min離心5 min，取上清液，通過(guò)ELISA方法測(cè)定TNF－α蛋白分泌量，每個(gè)樣本做雙份測(cè)定。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，結(jié)果以刺激不同時(shí)間的分泌量與未刺激時(shí)分泌量比值的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±sE)表示。使用方差分析對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)分泌量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估。

2.3 DNA甲基化轉(zhuǎn)化 將培養(yǎng)細(xì)胞分為3組。對(duì)照組:細(xì)胞不使用任何炎癥介質(zhì)刺激。1 mg/L LPS(4 h)組:細(xì)胞使用1 mg/L LPS刺激4 h。1 mg/L LPS(8 h)組:細(xì)胞使用1 mg/L LPS刺激8 h。刺激時(shí)間結(jié)束后，使用DNA提取試劑盒，分別從每組細(xì)胞中提取基因組DNA。提取的DNA采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度。使用甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒，對(duì)所提取基因組DNA進(jìn)行甲基化轉(zhuǎn)化。該試劑盒采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法。轉(zhuǎn)化后分別純化回收每組樣本DNA。

2.4 PCR擴(kuò)增 分別對(duì)每組甲基化轉(zhuǎn)化后的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。針對(duì)TNF－α啟動(dòng)子區(qū)域設(shè)計(jì)甲基化PCR擴(kuò)增引物。正向引物5＇－ccaaaagaaatggaggcaatag－ 3＇，逆向引物 5＇－ gaccagctaagagggagagaag－3＇。擴(kuò)增產(chǎn)物為啟動(dòng)子區(qū)域－344到+57位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增后，對(duì)其進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。使用DNA純化回收試劑盒對(duì)凝膠電泳后每組DNA片段分別進(jìn)行純化回收。

2.5 轉(zhuǎn)化及篩選 將純化回收的甲基化轉(zhuǎn)化后DNA片段通過(guò)TA連接進(jìn)入T載體，連接后將載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌，接種于新制含氨芐西林、5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(5－bromo－4－chloro－3－indolyl－β－D－galactopyranoside，X－gal)和異丙基硫代－β－D－半乳糖苷(isopropyl β－D－thiogalactoside，IPTG)的LB瓊脂培養(yǎng)板，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后取出培養(yǎng)板，挑選單克隆白色菌落再次接種于新制LB瓊脂培養(yǎng)板，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后挑選單克隆白色菌落于LB液體培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜。

2.6 基因測(cè)序 細(xì)菌培養(yǎng)后，送新鮮菌液進(jìn)行DNA測(cè)序。每組樣本選取5個(gè)克隆送Invitrogen公司測(cè)序。每組樣本測(cè)序結(jié)果以CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)甲基化數(shù)占擴(kuò)增區(qū)域總CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)數(shù)的百分率表示。采用χ2檢驗(yàn)比較間差異。

結(jié) 果

1 LPS刺激下THP－1細(xì)胞TNF－α的表達(dá)變化

使用終濃度為1 mg/L LPS刺激THP－1細(xì)胞。培養(yǎng)液上清TNF－α分泌水平在刺激后2 h明顯升高。刺激4 h達(dá)到分泌高峰，濃度為未刺激時(shí)的(48.9±1.06)倍，與未刺激時(shí)相比明顯升高(P＜0.01)。4 h后開始下降，刺激8 h有明顯降低，濃度為未刺激時(shí)的(36.30±1.65)倍，與刺激4 h時(shí)相比明顯下降(P＜0.01)，見圖1。各組甲基化率與相應(yīng)時(shí)點(diǎn)TNF－α分泌量比值之間呈明顯負(fù)相關(guān)(r=－0.99，P＜0.01)。

Figure 1.The secretion level of TNF－α in LPS－stitmulatedTHP－1 cells.THP －1 cells were stimulated with 1mg/L LPS for the indicated time.The data were presented as ratios relative to unstimulated cells(0 h).±sE.n=4.＊＊P ＜0.01 vs 0 h;△△P ＜0.01 vs 4 h.圖1 LPS刺激下THP－1細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF－α濃度的變化

2 TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA甲基化分析

基因測(cè)序結(jié)果表明，未受LPS刺激的THP－1細(xì)胞，其TNF－α基因啟動(dòng)子－344 bp到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(transcription start site，TSS)區(qū)域內(nèi)，11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)均處于甲基化狀態(tài)，見圖2B。1 mg/L LPS刺激4 h后，TNF－α基因啟動(dòng)子－344 bp到TSS區(qū)域內(nèi)11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)中，僅有4個(gè)仍處于甲基化狀態(tài)。其中－119、－72、－49、－38等幾個(gè)與轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切的位點(diǎn)，其CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)已去甲基化，見圖2C。1 mg/L LPS刺激8 h后，該區(qū)域內(nèi)11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)中，有9個(gè)處于甲基化狀態(tài)。其中－238、－169、－163、－161、－119、－72、－49等幾個(gè)位點(diǎn)開始恢復(fù)甲基化狀態(tài)，－146和－38位點(diǎn)處于去甲基化狀態(tài)。－119、－72、－49等幾個(gè)與TF結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切的位點(diǎn)，其CpG雙核苷酸處于甲基化狀態(tài)，見圖2D。

Figure 2.The TNF － α promoter fragment ranging from －344 bp to TSS was analyzed by bisulfite sequencing.Filled black circles represent≥80%methylation at a given CpG after sequencing 5 individual clones.Open circles represent＜20%methylation at a given CpG.Half－filled black circles represent between 20%and 80%methylation at a given CpG.A:the fragment contains 11 CpG dinucleotides(arrow:↑)and the TF binding sites for AP －1，AP －2，Sp1，NF － κB as well as cAMP response element(CRE)and TATA box;B:methylation status of gene promoter in unstimulated THP－1 cells;C:methylation status of gene promoter in 4 h LPS－stimulated THP－1 cells;D:methylation status of gene promoter in 8 h LPS－stimulated THP－1 cells.圖2 TNF－α基因啟動(dòng)子－344 bp到TSS區(qū)域甲基化狀態(tài)

TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域測(cè)序結(jié)果表明，CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)平均甲基化率，對(duì)照組為100%;1 mg/L LPS(4 h)組為21.8%;兩者之間差異顯著(P＜0.01)。CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)平均甲基化率，1 mg/L LPS(8 h)組為41.8%，與1 mg/L LPS(4 h)組之間差異顯著(P＜0.05)。

討 論

基因序列中存在的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)，其甲基化狀態(tài)對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控有重要作用［5，8，9］。脊椎動(dòng)物DNA甲基化最顯著的特征是富含CpG島，即在基因組的某些區(qū)域內(nèi)，富含密度較高的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)［6］。DNA甲基化影響基因表達(dá)的一個(gè)機(jī)制是甲基化CpG結(jié)構(gòu)直接影響TF與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄［10］。查找TNF－α基因序列，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域無(wú)典型CpG島結(jié)構(gòu)。此次實(shí)驗(yàn)采用基因測(cè)序法研究TNF－α基因啟動(dòng)子－344 bp到+57 bp區(qū)域，其中－344 bp到TSS區(qū)域內(nèi)含11個(gè)散在的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)。此區(qū)域內(nèi)還含有NF－κB、CRE、AP－1、Sp1、AP－2等關(guān)鍵 TF結(jié)合位點(diǎn)，見圖 2A。其中，－119、－72、－49、－38等幾個(gè)位點(diǎn)的 CpG 雙核苷酸結(jié)構(gòu)與這些TF結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切。因此此區(qū)域DNA甲基化狀態(tài)可能在TNF－α的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。

目前，對(duì)DNA甲基化的研究方法主要有甲基化特異性PCR法、限制性內(nèi)切酶甲基化分析法、重亞硫酸鹽甲基化測(cè)序法等，其中以重亞硫酸鹽測(cè)序法最為可靠和直觀［11］。本次實(shí)驗(yàn)采用重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化基因測(cè)序法對(duì)LPS刺激的THP－1細(xì)胞進(jìn)行研究。

本研究測(cè)定的THP－1細(xì)胞TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域含有11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)，未受刺激時(shí)均處于甲基化狀態(tài)。在受到LPS刺激后，TNF－α分泌在4 h達(dá)到高峰。此時(shí)，所測(cè)序的5個(gè)克隆中，甲基化率達(dá)到或高于80%的位點(diǎn)只有1個(gè)，甲基化率介于20%到80%之間的只有3個(gè)，其余均處于去甲基化狀態(tài)，整體甲基化水平最低，提示TNF－α基因表達(dá)增高與其啟動(dòng)子區(qū)域去甲基化狀態(tài)有關(guān)。在LPS刺激8 h后，TNF－α分泌已開始降低，其基因啟動(dòng)子區(qū)域的11個(gè)CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)已開始部分恢復(fù)甲基化狀態(tài)，甲基化率達(dá)到或高于20%的位點(diǎn)有9個(gè)，其中甲基化率達(dá)到或高于80%的有2個(gè)，只有2個(gè)位點(diǎn)為去甲基化狀態(tài)，1個(gè)位點(diǎn)繼續(xù)保持去甲基化。

總體上來(lái)看，當(dāng)TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域散在的CpG雙核苷酸結(jié)構(gòu)甲基化水平較高時(shí)，基因不表達(dá)或低表達(dá);當(dāng)其甲基化水平較低時(shí)，基因高表達(dá)。TNF－α分泌量與TNF－α啟動(dòng)子區(qū)域整體甲基化水平呈明顯負(fù)相關(guān)。從每一個(gè)CpG雙核苷酸位點(diǎn)情況來(lái)看，－238、－169、－163、－161、－119、－72和－49這幾個(gè)位點(diǎn)的甲基化率與TNF－α分泌量相關(guān)性和整體水平一致。－119、－72和－49位點(diǎn)與部分重要TF結(jié)合位點(diǎn)相鄰或關(guān)系密切，因此可能通過(guò)影響 TF與啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而抑制轉(zhuǎn)錄。而－303、－146和－38這3個(gè)位點(diǎn)甲基化率與TNF－α分泌量無(wú)明顯相關(guān)性，其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

TNF－α是參與炎癥反應(yīng)的重要因子。TNF－α通過(guò)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，使之易黏附于白細(xì)胞，刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子，引起白細(xì)胞在炎癥部位聚集，產(chǎn)生炎癥反應(yīng)［12］。TNF－α基因的表達(dá)，受多種因素的調(diào)控。近年來(lái)對(duì)TNF－α基因的表達(dá)調(diào)控研究較多的，是各種炎癥介質(zhì)的影響，以及各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用［3，4］。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)毒素或其它一些炎癥介質(zhì)刺激時(shí)，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域特異性位點(diǎn)結(jié)合，使TNF－α基因轉(zhuǎn)錄開始或上調(diào)，表達(dá)TNF－α［13］。除基因本身的改變外，表觀遺傳方式對(duì)TNF－α的表達(dá)調(diào)控作用還并不十分清楚。此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同TNF－α表達(dá)水平與其基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化水平具有負(fù)相關(guān)性。TNF－α基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)是否直接導(dǎo)致基因表達(dá)的改變，如果直接導(dǎo)致其改變又是通過(guò)何種具體機(jī)制影響基因的表達(dá)值得進(jìn)一步研究。

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