蔡 耘， 張緒超， 陳惠芹， 吳北燕， 黃紹良

(1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院兒科，廣東廣州510630;2中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院干細(xì)胞研究中心，廣東廣州510120;3廣東省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，廣東廣州510080)

胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化特性，對(duì)其造血分化研究不僅是探索機(jī)體造血發(fā)生發(fā)育機(jī)制的重要手段［1］，亦有助于成體造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的體外擴(kuò)增和臨床應(yīng)用，由ESCs誘導(dǎo)分化的HSCs還可能成為臨床移植新的供體來(lái)源［2］。在ESCs體外定向誘導(dǎo)為HSCs模型中，基質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境的選擇是重要環(huán)節(jié)。我們的前期工作已分別制備人主動(dòng)脈－性腺－中腎區(qū)(aorta－gonadmesonephros，AGM)基質(zhì)細(xì)胞系［3］及胎肝(fetal liver，F(xiàn)L)基質(zhì)細(xì)胞系［4］，并發(fā)現(xiàn)前者可促進(jìn)小鼠ESCs定向分化為HSCs［5］。現(xiàn)進(jìn)一步以上述兩種基質(zhì)細(xì)胞為飼養(yǎng)層，結(jié)合造血因子與ESCs分階段共培養(yǎng)，觀察HSCs分化效率與造血功能，并以小鼠移植模型檢測(cè)其安全性及體內(nèi)造血重建能力，為 ESCs源性HSCs的制備提供研究基礎(chǔ)。

材料和方法

1 細(xì)胞株

小鼠E14胚胎干細(xì)胞系(建株自129/Ola雄鼠)由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院干細(xì)胞研究中心引進(jìn)，人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞株hAGM3和hAGM4取自孕28－35 d經(jīng)米非司酮及米索前列醇藥物流產(chǎn)的人胚AGM組織［3］，人FL基質(zhì)細(xì)胞取自孕16－20周經(jīng)米索前列醇藥物引產(chǎn)的胎兒肝臟組織［4］。所取胚胎均經(jīng)流/引產(chǎn)者知情同意，實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 動(dòng)物

無(wú)特定病原體(SPF級(jí))BALB/c雌鼠，7－8周齡，體質(zhì)量16－18g;6－8周齡NOD－SCID小鼠，體質(zhì)量18－20g，均由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(粵)2004－0011。動(dòng)物置于無(wú)菌層流室動(dòng)物潔凈飼養(yǎng)柜中，所有操作均在無(wú)菌層流環(huán)境中進(jìn)行，對(duì)動(dòng)物的處置符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》。

3 主要試劑

H－DMEM、IMDM、I型膠原酶、β－巰基乙醇、L－丙氨酰－L谷氨酰胺二肽(glutamax－I)、非必需氨基酸和丙酮酸鈉均購(gòu)于Gibco BRL，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)于Hyclone，絲裂霉素C購(gòu)于Sigma，小鼠白血病抑制因子(mouse leukemia inhibitory factor，mLIF)購(gòu)自Chemicon，小鼠骨形成蛋白4(bone morphogenesis protein，BMP －4)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)、FMS樣酪氨酸激酶3配體(FMS－like tyrosine kinase 3 ligand，F(xiàn)lt－3L)和促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)購(gòu)自Peprotech，大鼠抗小鼠抗體 FITC－Flk－1、FITC－Sca－1和PE－c－Kit均購(gòu)于Ebiosciences，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基 MethocultTMGF+M4434購(gòu)于 Stem Cell，聚苯乙烯Transwell 6孔培養(yǎng)系統(tǒng)購(gòu)于Nunc。

4 人AGM區(qū)及FL基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層的制備

將本室建立的人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞［3］接種至6孔板，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基為含 20%FBS、5% 馬血清、10 μmol/L β －巰基乙醇、2 mmol/L glutamax－I和1 μmol/L 氫化可的松的α－最小必需培養(yǎng)基(α－minimum essential medium，α－MEM)。細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80% －90%時(shí)予10 mg/L絲裂霉素C處理2 h，PBS洗3次，加培養(yǎng)基備用。以上述方法制備人FL基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層，培養(yǎng)基為含 15%FBS、10 μmol/L β － 巰基乙醇、2 mmol/L glutamax－I和1 μmol/L 氫化可的松的H－DMEM。

5 分階段誘導(dǎo)ESCs向HSCs分化

5.1 誘導(dǎo)小鼠E14 ESCs向擬胚體(embryoid body，EB)分化 按本室方法［5］進(jìn)行小鼠E14 ESCs傳代培養(yǎng)。誘導(dǎo)前將ESCs按2×107cells/L接種至35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，加入含1%甲基纖維素、15%FBS、0.1 mmol/L β－巰基乙醇、2 mmol/L L－谷氨酰胺、25 μg/L BMP4及10 μg/L VEGF的IMDM半固體培養(yǎng)基，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中，每2－3 d半量換液，觀察EB形成情況，培養(yǎng)9 d時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Flk－1+及Sca－1+c－Kit+細(xì)胞含量。

5.2 EB細(xì)胞在人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)及檢測(cè) 取上述培養(yǎng)9d的EB消化成單細(xì)胞懸液，以4×105cells/well接種于transwell 6孔板插入子中，加入含 15%FBS、4 μg/L bFGF、10 μg/L IL － 6、25 μg/L BMP4、20 μg/L FLT －3L 及50 μg/L SCF 的IMDM，底層為人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2－3 d半量換液。培養(yǎng)6d時(shí)收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sca－1+c－Kit+細(xì)胞含量，并取1×105細(xì)胞以1 mL甲基纖維素半固體培養(yǎng)基接種于35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2及飽和濕度條件下行粒單系集落形成單位(colony－forming unit－granulocyte/macrophage，CFU－GM)、紅系爆式集落形成單位(erythroid burst－forming unit，BFU － E)、混合集落形成單位(colony－forming unit－granulocytes/erythrocytes/monocytes/megakaryocytes，CFU － GEMM)和高增殖潛能集落形成單位(high proliferative potential colony－forming unit，CFU －HPP)培養(yǎng)，計(jì)數(shù)各集落產(chǎn)率及集落總數(shù)。

5.3 經(jīng)人AGM區(qū)誘導(dǎo)后EB細(xì)胞在人FL基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層上培養(yǎng)及檢測(cè) 收集經(jīng)人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)6 d的EB來(lái)源細(xì)胞，按5.2方法與人FL基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)液另添加2×103U/L EPO。培養(yǎng)6 d時(shí)收集細(xì)胞檢測(cè)Sca－1+c－Kit+細(xì)胞含量并行造血細(xì)胞集落培養(yǎng)。

6 誘導(dǎo)后細(xì)胞的體內(nèi)致瘤實(shí)驗(yàn)

經(jīng)人AGM區(qū)及FL基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的EB來(lái)源細(xì)胞，以1×1010/L濃度注射0.5 mL于NOD－SCID小鼠大腿內(nèi)側(cè)皮下，對(duì)照組用未分化的ESCs，以5×108cells/L濃度注射0.5 mL。每組5只，飼養(yǎng)6周后觀察畸胎瘤。

7 移植實(shí)驗(yàn)分組與方法

BALB/c雌鼠隨機(jī)分為4組，每組9只:(1)人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)組(EB+AGM，下同);(2)人AGM區(qū)+FL基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)組(EB+AGM+FL，下同);(3)照射對(duì)照組;(4)正常對(duì)照組。(1)－(3)組術(shù)前8 h接受8.0 Gy［60Co］γ射線全身一次性輻照，劑量率0.5 Gy/min，(1)、(2)組每只受鼠經(jīng)尾靜脈注射相應(yīng)誘導(dǎo)后細(xì)胞2×106，照射對(duì)照組注射IMDM培養(yǎng)液200 μL，正常對(duì)照組不照射，僅注射IMDM培養(yǎng)液 200 μL。

8 移植后監(jiān)測(cè)指標(biāo)

8.1 受鼠生存狀況及移植物抗宿主病檢查 觀察受鼠生存情況至移植后60 d，繪制生存曲線。觀察受鼠有無(wú)脫毛、腹瀉、皮膚黏膜潰爛等情況，取有上述表現(xiàn)的受鼠和存活60 d受鼠皮膚、肝臟、腸管觀察移植物抗宿主病(graft－versus－h(huán)ost disease，GVHD)組織病理學(xué)改變。

8.2 受鼠外周血象檢測(cè) 移植后7、14、21、60 d檢測(cè)各組存活小鼠外周血白細(xì)胞(white blood cell，WBC)、紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)和血小板(platelet，PLT)計(jì)數(shù)。

8.3 植入證據(jù)檢測(cè) 取移植后60 d各實(shí)驗(yàn)組存活受鼠骨髓細(xì)胞懸液，提取DNA，PCR擴(kuò)增供體來(lái)源Y染色體性別決定基因sry，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)文獻(xiàn)［6］，上游引物為5’－ TGA ACG CAT TCA TGG TGT GGT－3’，下游引物為5’－ AAT CTC TGT GCC TCC TGG AA－3’，產(chǎn)物片段157 bp。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，Sybr Gold染色，凝膠成像儀中成像分析。

9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，各實(shí)驗(yàn)組間運(yùn)用t檢驗(yàn)或單因素方差分析及最小顯著性差異t檢驗(yàn);生存分析采用Kaplan－Meier法及l(fā)og－rank檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 小鼠E14 ESCs形成擬胚體

將脫離小鼠胚胎成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層2－3代的E14 ESCs接種于甲基纖維素半固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)2－3 d后細(xì)胞逐漸形成小的EB，至5－8 d時(shí)EB明顯增多、變大，鏡下可見(jiàn)其結(jié)構(gòu)為一群致密的細(xì)胞團(tuán)，9－12 d時(shí)EB形成達(dá)到高峰，見(jiàn)圖1。9 d時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)其 Flk－1+細(xì)胞含量為(27.53±2.84)%。

Figure 1.Embryoid bodies(EB)cultured in semisolid medium for 9 days(×100).圖1 半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)9 d的擬胚體

2 人AGM區(qū)及FL基質(zhì)細(xì)胞程序誘導(dǎo)EB細(xì)胞分化為HSCs

取培養(yǎng)9 d的EB細(xì)胞與人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層在Transwell體系中共培養(yǎng)，6 d時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Sca－1+c－Kit+細(xì)胞含量為(13.12±1.30)%，較誘導(dǎo)前的(5.42±1.63)%明顯升高，P＜0.05。再將上述初步誘導(dǎo)后的EB細(xì)胞與人FL基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)后Sca－1+c－Kit+細(xì)胞含量為(21.96±2.54)%，顯著高于誘導(dǎo)前及人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞初步誘導(dǎo)的EB細(xì)胞，P ＜0.05。

比較單純經(jīng)人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)、人AGM區(qū)+FL基質(zhì)細(xì)胞依次誘導(dǎo)EB來(lái)源細(xì)胞的造血細(xì)胞集落計(jì)數(shù)，可見(jiàn)后者集落總數(shù)及各集落產(chǎn)率明顯優(yōu)于前者，P ＜0.05，見(jiàn)表1。

表1 不同培養(yǎng)體系誘導(dǎo)EB細(xì)胞形成的造血集落分析結(jié)果Table 1.CFU assay of cells derived from EB cells in different culture systems(colonies.±s.n=3)

表1 不同培養(yǎng)體系誘導(dǎo)EB細(xì)胞形成的造血集落分析結(jié)果Table 1.CFU assay of cells derived from EB cells in different culture systems(colonies.±s.n=3)

*P ＜0.05 vs EB+AGM group.

Group CFU－GM BFU－E CFU－GEMM CFU－HPP Total CFU EB+AGM 130±28 69±18 7±2 23±5 206±41 EB+AGM+FL 344±42* 150±21* 26±8* 44±6* 520±52*

3 ESCs來(lái)源HSCs腫瘤安全性檢測(cè)結(jié)果

NOD－SCID小鼠接種經(jīng)人AGM區(qū)及FL基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)的ESCs，觀察6周未見(jiàn)注射部位腫塊形成，解剖后見(jiàn)接種部位及相鄰區(qū)域組織結(jié)構(gòu)正常，探查全身及胸、腹腔未見(jiàn)腫瘤，證實(shí)該ESCs來(lái)源HSCs無(wú)形成畸胎瘤的危險(xiǎn)性。而對(duì)照組注射未分化ESCs后2周可見(jiàn)局部皮膚隆起，腫塊進(jìn)行性增大，6周時(shí)平均體積為6.5 cm3，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)為畸胎瘤，見(jiàn)圖2。

4 移植后受鼠生存狀況及GVHD觀察結(jié)果

各移植組均未見(jiàn)明顯GVHD表現(xiàn)。60 d，正常對(duì)照組全部存活;照射對(duì)照組和EB+AGM組在2周內(nèi)全部死亡，中位生存時(shí)間分別為8 d、12 d;EB+AGM+FL組存活率77.8%(7/9)，死亡時(shí)間為13 d和15 d。Kaplan－Meier生存函數(shù)曲線如圖3所示，EB+AGM+FL組生存率顯著高于照射對(duì)照組和EB+AGM組(P＜0.01)。雖然照射對(duì)照組和EB+AGM組均全部死亡，但后者生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于前者(P＜0.01)。

Figure 2.Teratoma in NOD －SCID mice after subcutaneous injection of E14 ESCs.A:a mouse with subcutaneous teratoma;B:the isolated teratoma;C:cartilage and epithelial tissues in teratoma(HE staining，×100).圖2 E14 ESCs在NOD－SCID小鼠體內(nèi)形成畸胎瘤

Figure 3.Survival plots of recipient mice after transplantation圖3 移植后各組小鼠生存函數(shù)曲線

5 移植后受鼠外周血象檢測(cè)結(jié)果

照射對(duì)照組輻照后外周血WBC和PLT迅速減少，于10 d內(nèi)全部死于造血衰竭;EB+AGM組在14 d時(shí)WBC、RBC有一定恢復(fù)，但仍明顯低于正常值，15 d內(nèi)死亡;EB+AGM+FL組14 d血象顯著改善，21 d除PLT計(jì)數(shù)外，WBC和RBC已達(dá)正常水平，60 d血象全面恢復(fù)。EB+AGM+FL組WBC和PLT計(jì)數(shù)在不同時(shí)點(diǎn)均明顯優(yōu)于照射對(duì)照組和EB+AGM組，P ＜0.05，見(jiàn)表2。

6 供體植入證據(jù)檢測(cè)結(jié)果

移植后60 d，EB+AGM+FL組存活7只受鼠均檢測(cè)到Y(jié)染色體sry基因，說(shuō)明ESCs來(lái)源的供體細(xì)胞成功植入，正常對(duì)照組檢測(cè)陰性，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Gel electrophoresis of sry gene in bone marrow cells of recipient mice 60 d after transplantation.M:DNA ladder marker;Lane 1:negative control;Lane 9:positive control;Lane 2－f8:EB+AGM+FL group.圖4 移植后60 d受鼠骨髓細(xì)胞中供體sry基因檢測(cè)結(jié)果

表2 實(shí)驗(yàn)組小鼠不同時(shí)點(diǎn)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2.The result of peripheral blood cell count in experimental groups at different time points(±s.n=9)

表2 實(shí)驗(yàn)組小鼠不同時(shí)點(diǎn)外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2.The result of peripheral blood cell count in experimental groups at different time points(±s.n=9)

▲P＜0.05 vs EB+AGM group at the same time point;*P＜0.05 vs normal group at the same time point;△P＜0.05 vs irradiation group at the same time point.

EB+AGM EB+AGM+FL Irradiation Normal WBC(×109/L) 7 0.20 ±0.02* 0.45 ±0.10＊▲△ 0.21 ±0.03*Peripheral blood Days after transplantation 4.86 ±0.52 14 1.04 ±0.08* 2.77 ±0.21＊▲ /21 / 4.22 ±0.21 /60 / 4.38 ±0.61 /PLT(×109/L) 7 36±2* 60±6＊▲△ 32±3* 261±45 14 35±2* 67±4＊▲ /21 / 203±24* /60 / 239±30 /RBC(×1012/L) 7 3.03 ±0.11* 3.01 ±0.47＊▲△ 2.01 ±0.10* 7.82 ±1.02 14 5.35 ±0.83* 6.32 ±0.87* /21 / 6.71 ±0.72 /60 / 6.95 ±0.88 /

討 論

目前研究ESCs造血分化能力已得到證實(shí)，體外可誘導(dǎo)出紅系、粒單系、巨核系、淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞及肥大細(xì)胞等，CD34+c－Kit+HSCs的獲得比例因誘導(dǎo)條件不同而在16%至67%不等［7］。但欲產(chǎn)生足夠數(shù)量的功能性HSCs，尚需進(jìn)一步闡明造血發(fā)生發(fā)育機(jī)制，改善誘導(dǎo)條件，充分模擬造血微環(huán)境，體外建立有效的誘導(dǎo)擴(kuò)增體系。本研究按照造血發(fā)生發(fā)育的時(shí)空順序，將小鼠ESCs首先誘導(dǎo)為EB，接著依次在人胚造血發(fā)生發(fā)育位點(diǎn)的AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞和FL造血期基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)條件下，逐步觀察HSCs分化比例及造血重建功能，期望獲得更高效、高產(chǎn)率的HSCs，為研究ESCs造血分化的分子機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑸榭刂圃煅只瘯r(shí)相、尋求更好的ESCs造血分化誘導(dǎo)條件提供研究資料。

哺乳動(dòng)物的確定造血(definitive hematopoiesis)發(fā)生于胚內(nèi)的主動(dòng)脈旁胚臟壁(paraaortic splanchnopleura，P－Sp)/AGM區(qū)，其發(fā)生具有時(shí)間和空間的高度限制性。小鼠長(zhǎng)期重建造血的HSCs(longterm repopulating hematopoietic stem cells，LTRHSCs)在胚胎7.5－9.5 d的P－Sp和10.5－11.5 d的AGM區(qū)產(chǎn)生，然后遷移至FL大量擴(kuò)增，接近出生時(shí)再遷移至骨髓并維持生后個(gè)體終生造血［8］。其中，AGM區(qū)微環(huán)境對(duì)永久造血細(xì)胞的產(chǎn)生提供了必需的分化條件，包括細(xì)胞外基質(zhì)成分和可能的造血調(diào)控因子［9］。我們的前期研究已證實(shí)FL基質(zhì)細(xì)胞能分泌構(gòu)成造血微環(huán)境所需的基質(zhì)成分，如Fibronectin、α－SMA等細(xì)胞外基質(zhì)蛋白及黏附分子CD44、CD29，從而在FL造血期對(duì)HSCs黏附、分化及遷移過(guò)程發(fā)揮重要作用［4］。利用AGM區(qū)和FL基質(zhì)細(xì)胞作為飼養(yǎng)層分階段誘導(dǎo)ESCs來(lái)源EB細(xì)胞的進(jìn)一步造血分化符合胚胎發(fā)育中造血位點(diǎn)的遷移規(guī)律。

本研究利用Transwell非接觸共培養(yǎng)體系可確保在誘導(dǎo)分化過(guò)程中準(zhǔn)確收集產(chǎn)物細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并采用c－Kit、Sca－l作為原始造血干細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)各階段ESCs向HSCs發(fā)育的水平。結(jié)果顯示EB來(lái)源細(xì)胞經(jīng)人AGM區(qū)→FL基質(zhì)細(xì)胞程序誘導(dǎo)后，Sca－1+c－Kit+細(xì)胞含量顯著升高，達(dá)到(21.96±2.54)%，而CFU產(chǎn)率亦明顯優(yōu)于誘導(dǎo)前及人AGM區(qū)基質(zhì)細(xì)胞初步誘導(dǎo)的EB細(xì)胞。何志旭等［10］以FL基質(zhì)細(xì)胞上清液聯(lián)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞飼養(yǎng)層誘導(dǎo)小鼠E14.1 ESCs，CD34+Sca－1+比例達(dá)到(58.64±4.20)%。與本研究結(jié)果比較，差異可能主要在于使用不同的HSCs標(biāo)記物。本研究中Sca－1+c－Kit+雙標(biāo)記細(xì)胞指示較原始HSCs，包括長(zhǎng)期和短期HSCs以及多能干細(xì)胞［11］。本研究結(jié)果提示按胚胎造血位點(diǎn)遷移規(guī)律，程序化誘導(dǎo) ESCs向HSCs分化有明顯的優(yōu)勢(shì)，尤其在FL水平，擴(kuò)增效應(yīng)明顯高于人AGM飼養(yǎng)層體系。

本研究在ESCs定向造血分化發(fā)育模型基礎(chǔ)上，分析了各誘導(dǎo)組獲得HSCs在致死劑量輻射小鼠體內(nèi)的造血重建能力。ESCs來(lái)源HSCs在動(dòng)物體內(nèi)造血重建能力、動(dòng)物存活率與移植細(xì)胞的數(shù)量、誘導(dǎo)條件、受體輻照劑量、移植細(xì)胞分選情況有密切關(guān)系。Burt等［12］發(fā)現(xiàn)經(jīng) SCF、IL －3、IL －6 等細(xì)胞因子誘導(dǎo)EB所形成的細(xì)胞，若未經(jīng)分選經(jīng)尾靜脈輸注受鼠可致全部動(dòng)物死亡，而經(jīng)骨髓腔注射則有2% －12%的長(zhǎng)期存活率，約30%(2/7)受鼠出現(xiàn)畸胎瘤。受鼠接受分選后的c－Kit+CD45+細(xì)胞移植則全部獲得造血重建和100%的長(zhǎng)期存活率(100 d)。本研究中誘導(dǎo)的ESCs來(lái)源細(xì)胞均未經(jīng)分選，EB+AGM組全部死亡，而EB+AGM+FL組60 d存活率77.8%，21 d外周血象基本恢復(fù)，PCR顯示ESCs來(lái)源供體細(xì)胞成功植入，未見(jiàn)GVHD相應(yīng)皮膚黏膜改變，接種NOD－SCID小鼠亦無(wú)畸胎瘤產(chǎn)生，說(shuō)明經(jīng)人AGM區(qū)→FL基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)后獲得的HSCs安全、有效，免疫耐受性好，但具體植入水平有待進(jìn)一步研究。

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