何艷晶， 陳亞紅△， 齊永芬， 姚婉貞， 畢小瑞， 關(guān)育紅， 朱瑞霞， 唐朝樞

(北京大學(xué)1第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，2醫(yī)學(xué)部生理及病理生理系，3第三醫(yī)院兒科，北京100191)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是具有氣流受限特征的氣道慢性炎癥疾病，氧化應(yīng)激在COPD的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［1］，因此，調(diào)節(jié)氧化抗氧化平衡在COPD的治療中具有重要意義。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)既往被認(rèn)為是一種具有臭雞蛋氣味的有毒氣體。然而近年來研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物體內(nèi)，H2S可由3種酶催化產(chǎn)生，即是胱硫醚－γ－裂解酶(cystathionine－γ－lyase，CSE)、胱硫醚－β－合酶(cystathionine－βsynthase，CBS)和3－巰基丙酮酸鹽硫轉(zhuǎn)移酶(3－mercaptopyruvate sulphurtransferase，3 －MST)聯(lián)合半胱氨酸轉(zhuǎn)氨酶(cysteine aminotransferase，CAT)，它具有多種生理病理作用，包括抗氧化作用。然而它在COPD發(fā)病過程中是否具有抗氧化作用尚未闡明。本研究在香煙煙霧和脂多糖建立的COPD大鼠模型中探討H2S在COPD氧化應(yīng)激中的作用。

材料和方法

1 主要試劑

“都?！迸葡銦?市售，焦油含量17 mg，煙氣煙堿量1.2 mg)、炔丙基甘氨酸(DL －propargylglycine，PPG)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Escherichia coli，serotype O55∶B5)、硫氫化鈉(sodium hydrosulfide hydrate，NaHS)均購自Sigma，過碘酸－雪夫(periodic acid－Schiff，PAS)染色液試劑盒購自上海太陽生物技術(shù)有限公司，Masson三色染色試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測試盒、過氧化氫酶(catalase，CAT)測試盒均購自南京建成科技有限公司。CSE抗體購自Abnova，其它化學(xué)試劑均為分析純。

2 動物模型的建立及分組

健康雄性SD(Sprague－Dawley)大鼠32只，體重210－250 g，購于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物中心。按體重大小隨機(jī)分成4組，每組8只:對照組(A組)，吸煙 +LPS組(B組)，吸煙 +LPS+NaHS組(C組)，吸煙+LPS+PPG組(D組)。C組每次吸煙或LPS滴入前 2 h 腹腔注射 NaHS(14 μmol/kg，400 μmol/L)，D 組腹腔注射 PPG(37.5 mg·kg－1·d－1)，B組腹腔注射與C組相同劑量的生理鹽水。NaHS、PPG、LPS均用生理鹽水溶解。

參照 Mizutani等［2］和宋一平等［3］所用方法建立動物模型，有所改良。采用香煙煙霧吸入合并氣管內(nèi)滴入LPS建立動物模型，30 d后將動物處死。具體如下:大鼠放置于天津合普公司動式染毒箱內(nèi)被動吸煙，每天2次，每次1.5－2 h(2次間隔6 h以上)，每次點煙器中放置20根香煙，每5根香煙輪流點燃并燃燒充分。第1－4 d、6－18 d、20－30 d連續(xù)吸煙，第5、19 d氣管內(nèi)滴入LPS。動物用1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，頸部消毒條件下行正中切口，逐層分離，暴露氣管，直視下將吸有200 μL LPS(500 mg/L)的1 mL注射器插入氣管內(nèi)，緩慢注入(5 min內(nèi)注完，對照組給予相同劑量生理鹽水)，隨后迅速將動物直立旋轉(zhuǎn)，盡量使藥液在肺內(nèi)分布均勻，后將固定大鼠的鼠板斜立，與水平面成60度，持續(xù)該體位20 min。常規(guī)皮膚縫合，注意無菌操作。

3 肺功能測定

經(jīng)30 d被動吸煙聯(lián)合氣管內(nèi)注射LPS后，全部大鼠行肺功能測定。

按文獻(xiàn)［4］方法測定肺功能，腹腔注射20%烏拉坦麻醉大鼠，氣管插管后與Powerlab多導(dǎo)生理測試儀相連，設(shè)置小動物呼吸機(jī)潮氣量為10 mL/kg，呼吸頻率為60次/min。經(jīng)Chart 4.1軟件分析測定每只大鼠吸氣峰流速(peak inspiratory flow，PIF)、呼氣峰流速(peak expiratory flow，PEF)、氣道內(nèi)壓(intra－pressure，IP)和氣道內(nèi)壓最大上升斜率(maximum rising slope of IP，IP slope)。

4 肺組織病理觀察

取左肺，4%中性多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，PAS染色及Masson三色染色。對大鼠小氣道7項指標(biāo)以及肺氣腫和色素沉著進(jìn)行光鏡下病理學(xué)觀察并評分［5］，采用盲法診斷。評分指標(biāo):(1)小氣道腔內(nèi)是否有黏液和細(xì)胞阻塞;(2)小氣道上皮是否有壞死糜爛;(3)小氣道上皮細(xì)胞杯狀細(xì)胞化生;(4)小氣道上皮細(xì)胞鱗狀化生;(5)小氣道管壁炎細(xì)胞浸潤;(6)小氣道管壁纖維結(jié)締組織增生;(7)小氣道管壁平滑肌增生;(8)小氣道管壁色素沉著;(9)肺氣腫。評分標(biāo)準(zhǔn):正常為0分，輕度異常為1分，中度異常為2分，重度異常為3分。根據(jù)以上9項指標(biāo)對觀察到的病變進(jìn)行評分，將所有分值相加，即為每例標(biāo)本得分總分。

5 血漿中硫化氫含量測定

第16 d，吸煙1次后，對照組和CS+LPS組大鼠內(nèi)眥靜脈取血，30 d后，動物麻醉固定，腹主動脈取血后處死，5×105U/L肝素鈉抗凝，全血4℃、4 000 r/min離心10 min，分離出血漿存于－80℃冰箱待測。參考耿彬等［6］方法測定血漿中硫化氫水平。采用敏感硫電極(上海雷磁 PXS－270)測定血漿硫化氫水平，結(jié)果用μmol/L表示。

6 肺組織CSE蛋白表達(dá)

－80℃凍存的肺組織，稱重，加入預(yù)冷的組織蛋白裂解液，冰上勻漿，勻漿液4℃、13 000 r/min離心10 min，上清液用考馬斯亮藍(lán)法行蛋白定量，用10%SDS－PAGE(十二烷基磺酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳)進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡分析。以β－actin為內(nèi)參照，用NIH的Image J圖像分析軟件分析CSE和βactin灰度值。CSE與β－actin的灰度比值表示CSE蛋白相對表達(dá)量。

7 肺組織中MDA含量、T－SOD和CAT活性測定

準(zhǔn)確稱量肺組織，按10%比例(W/V)加入冷生理鹽水于玻璃勻漿器中冰上勻漿，勻漿液4℃、4 000 r/min離心10 min，上清液用考馬斯亮藍(lán)法行蛋白定量。MDA含量、CAT活性和SOD活性測定按試劑盒說明操作，MDA含量結(jié)果以 μmol/g protein表示，CAT活性和SOD活性結(jié)果以103U/g protein表示。

8 統(tǒng)計學(xué)處理

用Prism 5統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。病理評分組間差異采用Friedman檢驗，兩兩之間比較采用Dunn's檢驗，結(jié)果以中位數(shù)、最大值和最小值表示。其余數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間比較采用Tukey's檢驗;兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。

結(jié) 果

1 一般情況

吸煙及氣管滴入LPS后，大鼠精神差，活動減少，毛色黃，失去光澤，體重較對照組減輕。CS+LPS+PPG組大鼠較CS+LPS組大鼠體重下降明顯，活動少，見表1。

表1 4組大鼠實驗前后體重比較Table 1.Body weight of rats before and after experiment(g.±s.n=7)

表1 4組大鼠實驗前后體重比較Table 1.Body weight of rats before and after experiment(g.±s.n=7)

*P ＜0.05 vs control group;##P ＜0.01 vs CS+LPS group.

Control 246.4 ±6.4 436.7 ±34.9 CS+LPS 241.5 ±15.1 384.4 ±18.4*CS+LPS+NaHS 241.9 ±6.1 394.0 ±24.1 CS+LPS+PPG 239.4 ±9.4 305.2 ±37.7##

2 肺功能

與對照組相比，CS+LPS組大鼠PEF下降24%(P ＜0.01)，IP升高66%(P ＜0.01)。NaHS或 PPG干預(yù)后，與CS+LPS比較，無顯著差異。4組大鼠肺功能變化見表2。

表2 4組大鼠肺功能比較Table 2.Lung functions in 4 groups of rats(±s.n=7)

表2 4組大鼠肺功能比較Table 2.Lung functions in 4 groups of rats(±s.n=7)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group.PIF:peak inspiratory flow;PEF:peak expiratory flow;IP:intra－pressure;IP slope:maximum rising slope of IP.

Control 3.09±0.19 6.13±0.99 0.90±0.42 91.99).67±3.42±16.26 CS+LPS 2.97±0.12 4.68±0.16＊＊ 1.49±0.16＊＊ 95.52±8.23 CS+LPS+NaHS 2.96±0.10 4.93±0.13 1.33±0.20 91.07±4.92 CS+LPS+PPG 2.96±0.10 4.80±0.27 1.45±0.18 87

3 病理學(xué)檢查

病理學(xué)結(jié)果見圖1、2和3，病理評分結(jié)果見圖4。光鏡下可見CS+LPS組氣道黏液及細(xì)胞阻塞、氣道上皮壞死脫落、杯狀上皮化生、氣道壁炎癥細(xì)胞浸潤、氣道壁膠原纖維沉積等表現(xiàn)，病理評分較對照組升高(P＜0.01)。NaHS干預(yù)后上述病變均減輕，病理評分較CS+LPS組下降(P＜0.05);PPG干預(yù)后，與CS+LPS組相比肺組織病理評分無顯著差異。

Figure 1.Hematoxylin and eosion staining of lung tissue sections.A，B:control group;C，D:CS+LPS group;E，F(xiàn):CS+LPS+NaHS group;G，H:CS+LPS+PPG group.A，C，E，G:×10;B，D，F(xiàn)，H:×20.圖1 肺組織HE染色

Figure 2.Periodic acid －Schiff(PAS)staining of lung tissue sections.The arrows denote positive substances.A，B:control group;C，D，E，F(xiàn):CS+LPS+NaHS group;G，H:CS+LPS+PPG group.A，C，E，G:×10;B，D，F(xiàn)，H:×20.圖2 肺組織PAS染色

Figure 3.Masson trichrome staining of lung tissue sections.A，B:control group;C，D:CS+LPS group;E，F(xiàn):CS+LPS+NaHS group;G，H:CS+LPS+PPG group.A，C，E，G:×10;B，D，F(xiàn)，H:×20.圖3 肺組織Masson三色染色

Figure 4.Pathological scores of rat lung tissues.n=8.＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs CS+LPS group.The central line in each scatter plot denotes the median value，and the lower and upper line denote minimum and maximum values，respectively.圖4 大鼠肺組織病理評分

4 硫化氫通路

第16 d，CS+LPS組血漿中H2S含量較對照組升高26%(P ＜0.05)，見圖 5A;30 d后，CS+LPS+PPG組較CS+LPS組H2S含量降低22%(P＜0.01)，見圖5B。CS+LPS組中CSE蛋白表達(dá)較對照組升高(P＜0.01);與 CS+LPS組比較，CS+LPS+NaHS組和CS+LPS+PPG組無顯著差異，見圖6A、B。

5 氧化/抗氧化平衡

在CS+LPS組，肺組織中MDA含量比對照組升高24%(P＜0.05)，NaHS干預(yù)后，MDA含量較 CS+LPS組降低21%(P＜0.05)，見圖7A;在 CS+LPS組，肺組織中總SOD活性較對照組升高47%(P＜0.01)，CAT活性升高52%(P ＜0.01)，NaHS或 PPG干預(yù)后，與CS+LPS組相比，CAT活性無顯著差異，而PPG干預(yù)后，總SOD活性下降33%(P＜0.05)，見圖7B、C。

Figure 5.Hydrogen sulfide in plasma of rats.A:H2S content in plasma of rats on d 16.±s.n=6.*P＜0.05 vs control group.B:H2S content in plasma of rats after 30 d.±s.n=7.##P＜0.01 vs CS+LPS group.圖5 大鼠血漿中H2S含量

Figure 6.Western blotting analysis of CSE protein expression in lung tissues of rats and relative intensity normalized to the expression of β－actin.±s.n=4.＊＊P＜0.01 vs control group.圖6 大鼠肺組織中CSE蛋白表達(dá)

Figure 7.MDA content(A)，total SOD activity(B)and CAT activity(C)in lung tissues.±s.n=7(A)，n=6－7(B)，n=7－8(C).*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05 vs CS+LPS group.圖7 肺組織中MDA含量、總SOD活性和CAT活性

討 論

H2S是一種無色、可溶于水、具有臭雞蛋氣味的可燃?xì)怏w，過去一直認(rèn)為是一種毒氣，而近年來發(fā)現(xiàn)，H2S可在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生，它具有多種生理病理作用，包括抗氧化應(yīng)激作用，是繼一氧化氮(nitric oxide，NO)、一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子［7］。

已有研究表明，在神經(jīng)細(xì)胞、心肺缺血再灌注等細(xì)胞和動物模型中［8－10］，H2S可通過抗氧化損傷而起到保護(hù)作用。我們前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期COPD患者血漿中，H2S含量升高，而在急性加重期，H2S含量下降［11］;在哮喘大鼠模型中，血漿和肺組織中H2S含量下降，肺組織中CSE蛋白也下調(diào)［4］，說明內(nèi)源性H2S可能參與COPD和哮喘的發(fā)病過程，其機(jī)制尚未完全闡明。那么H2S在COPD中的作用機(jī)制是否可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激發(fā)揮作用呢?本研究采用吸煙聯(lián)合氣管內(nèi)滴入LPS方法建立COPD大鼠模型，可觀察到大鼠體重下降，肺功能下降;HE染色、PAS染色及Masson三色染色肺組織病理切片可觀察到氣道黏液及細(xì)胞阻塞、氣道上皮壞死脫落、杯狀上皮化生、氣道壁炎癥細(xì)胞浸潤、氣道壁膠原纖維沉積等表現(xiàn)，說明動物模型建立成功。給予NaHS后，病理切片可見黏液分泌及氣道壁膠原纖維沉積明顯減輕，但大鼠肺功能未見顯著改善，而前期我們實驗研究發(fā)現(xiàn)，H2S可改善哮喘大鼠肺功能［4］，可減輕吸煙大鼠離體氣管張力［12］?？赡芟cCOPD發(fā)病機(jī)制不一，哮喘患者氣道平滑肌增生明顯［13］，而COPD患者以氣道纖維化為主［14］，因而H2S在COPD大鼠模型中并未明顯改善肺功能，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。也許加大H2S供體NaHS使用劑量(在有效劑量范圍內(nèi))，可能對改善肺功能效果更明顯。給予CSE酶抑制劑PPG后，與模型組相比，病變相差不大，與我們前期實驗［12］中發(fā)現(xiàn)PPG阻斷內(nèi)源性H2S生成后肺組織病變更嚴(yán)重不太一致，可能與本實驗研究中使用PPG作用時間較短有關(guān)，具體病變機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

活性氧物質(zhì)生成增多將修飾脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和硫醇基氧化，改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。MDA是一個廣泛用于脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物。有報道，在 COPD患者的血漿中MDA含量升高，COPD患者紅細(xì)胞中SOD和CAT活力升高或降低，但也有不變的［15，16］。本研究中，模型組大鼠肺組織中MDA含量升高，SOD和CAT活力也升高。機(jī)體可能上調(diào)抗氧化酶的活力，起到代償性防御作用，但還不足以對抗氧化應(yīng)激引起的損傷。外源給予NaHS，可抑制MDA的生成，減輕肺組織氧化損傷，起到抗氧化作用，這與Fu等［9］報道相一致。而在此研究中，與模型組相比，硫化氫沒有升高SOD和CAT活力，用PPG內(nèi)源性阻斷H2S生成后，SOD活力下降。與Fu等［9］報道在肺缺血再灌注模型中H2S升高SOD和CAT活力不太一致。原因可能是COPD中的氧化損傷機(jī)制與肺缺血再灌注損傷機(jī)制不同。近來研究證明，H2S的抗氧化損傷作用機(jī)制主要有以下幾點:(1)通過Nrf－2(nuclear factor erythroid－2－related factor 2，核因子網(wǎng)織紅細(xì)胞相關(guān)因子－2)依賴途徑誘導(dǎo)抗氧化分子如硫氧還蛋白的生成，起到抗氧化作用［10］;(2)可升高細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的生成以及將谷胱甘肽分配到線粒體中提高抗氧化能力［8］;(3)可以抑制NADH氧化酶，從而抑制活性氧物質(zhì)的產(chǎn)生［17］。然而，H2S在吸煙聯(lián)合脂多糖誘導(dǎo)的COPD大鼠模型中，其抗氧化機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

本研究第16 d，發(fā)現(xiàn)模型組血漿中H2S水平較對照組升高，30 d后，給予PPG后，測定到H2S水平較模型組大鼠下降，而其它3組H2S水平?jīng)]有差異?？赡茉贑OPD發(fā)展的不同時期，血漿H2S水平處于動態(tài)變化之中。我們觀察到，模型組CSE蛋白表達(dá)水平升高，這種變化可能是在病理狀態(tài)下的一種代償性保護(hù)機(jī)制，CSE/H2S途徑參與了COPD的發(fā)病。CSE可在mRNA轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平及翻譯后修飾受到調(diào)控。已報道，一氧化氮供體－S－亞硝基－N－乙酰青霉胺可以上調(diào)CSE的表達(dá)，另一種一氧化氮供體－硝普鈉，則可以提高CSE的活性［18］，近來一項研究表明，CSE活性由鈣離子鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)［19］。至于在COPD疾病狀態(tài)下，CSE活性是否有改變，CSE mRNA如何被調(diào)控，以及CSE/H2S與其它氣體信號分子之間有無相互調(diào)節(jié)作用，均有待進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，內(nèi)源性CSE/H2S體系參與了大鼠COPD的發(fā)病過程。應(yīng)用外源性H2S通過減輕氧化應(yīng)激而起到保護(hù)作用。

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