董志軍， 李曉紅， 董微麗， 張鐵民

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北承德067000)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病眼部并發(fā)癥中嚴(yán)重的致盲病變，是導(dǎo)致視力喪失的主要原因［1，2］。以往對DR發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在視網(wǎng)膜新生血管方面。近年的研究表明［3］，DR不僅有視網(wǎng)膜微血管病變，而且早期即存在視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的功能損害，視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)治療日益受到關(guān)注。本研究旨在通過觀察菩人丹超微粉(Purendan superfine powder，PRD)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討其對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的保護(hù)作用。

材料和方法

1 材料

1.1 藥物與試劑 菩人丹超微粉由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭組成，河北以嶺藥業(yè)集團(tuán)有限公司代加工生產(chǎn);鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購自Sigma;Trizol購自Invitrogen;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT－mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche;B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原2(B－cell leukemia/lymphoma 2，Bcl－2)和 B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原相關(guān)X蛋白(Bcl－associated X，Bax)兔抗多克隆抗體均購自Santa Cruz;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase－3)兔抗多克隆抗體購自Bioworld Technology;bcl－2、bax和 caspase－3引物購自上海生工公司;SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;RT－PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 動物 清潔級雄性Wistar大鼠［北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證編號為SCXK(京)2006－0009］，體重200－250g。

2 方法

2.1 動物分組、模型制備與給藥 將36只大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機(jī)化分組，分為正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組，每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用2%STZ(25 mg·kg－1·d－1，3 d)連續(xù)腹腔注射建立糖尿病動物模型，以血糖≥16.7 mmol·L－1作為成模標(biāo)準(zhǔn)［4］。模型成功建立后，依體表面積折算確定PRD治療組給藥劑量為 1.8 g 超微粉·kg－1·d－1，用蒸餾水配制成濃度為0.25 kg超微粉/L混懸液，按7.2 mL/kg動物體重灌胃，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃3個月。正常對照組及糖尿病模型組按7.2 mL/kg動物體重用蒸餾水灌胃。

2.2 標(biāo)本制備 PRD治療結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g·kg－1)大鼠，迅速取出雙側(cè)眼球，一側(cè)眼球浸于4%多聚甲醛固定液24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋，分別備用于TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡及免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達(dá);另一側(cè)眼球迅速利用動物手術(shù)顯微鏡在冰面上鈍性分離視網(wǎng)膜組織，投入液氮中保存，備用于RT－PCR法檢測bcl－2、bax、caspase－3 mRNA表達(dá)。

2.3 TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，proteinase K工作液消化15 min，TUNEL反應(yīng)液37℃孵育60 min，過氧化物酶(peroxidase，POD)轉(zhuǎn)化劑37℃孵育30 min，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色著染。凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)的確定:切片在×400顯微鏡下選取視網(wǎng)膜，以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目與同一視野神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)的比值作為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)。每只動物任選3張切片，每張切片選取5個視野，取平均值。

2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達(dá) 眼球平行視神經(jīng)連續(xù)矢狀切片，片厚4 μm，采用SP免疫組織化學(xué)染色方法檢測視網(wǎng)膜Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達(dá)。Ⅰ抗分別為Bcl－2、Bax和caspase－3多克隆抗體，稀釋濃度為1∶100，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以0.01 mmol·L－1PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。Bcl－2和Bax以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)，caspase－3以胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對免疫組化陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析:切片在×400顯微鏡下選取視網(wǎng)膜，以免疫陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。每只動物任選3張切片，每張切片選取5個視野，取平均值。

2.5 RT－PCR 檢測視網(wǎng)膜 bcl－2、bax和 caspase－3 mRNA表達(dá) 取液氮中保存的視網(wǎng)膜，按Trizol總RNA抽提說明書操作，提取視網(wǎng)膜組織的總RNA。取5 μL RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的28 S、18 S和5 S三條完整條帶，說明抽提的總RNA比較完整;紫外分光光度計(jì)檢測A260/A280值為1.9－2.1，說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為:30℃10 min;55℃30 min;99℃5 min;5℃5 min。PCR反應(yīng)條件:94℃2 min;94℃30 s;50℃ －65℃30 s;72℃1 min，第2步起循環(huán)。bcl－2引物序列為:正義鏈5'－TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT－3'，反義鏈5'－GCTGATTT-GACCATTTGCCTGA －3'，退火溫度為 55℃，30 個循環(huán)，產(chǎn)物大小為328 bp;bax引物序列為:正義鏈5'－GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT－3'，反義鏈 5'－GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC －3'，退火溫度為59℃，31個循環(huán)，產(chǎn)物大小為357 bp;caspase－3引物序列為:正義鏈5'－ATGTCGATGCAGCTAACCTCA －3'，反義鏈 5'－ TGTCTCAATACCGCAGTCCAG－3'，退火溫度為53℃，31個循環(huán)，產(chǎn)物大小為320 bp;β－actin引物序列為:正義鏈 5'－CATCCTGCGTCTGGACCT－3'，反義鏈 5'－ TCAGGAGGAGCAATGATCTTG－3'，退火溫度為58℃，29個循環(huán)，產(chǎn)物大小為480 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝初像，并用Quantity One－4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以目的條帶的光密度與β－actin條帶吸光度的比值作為各目的基因mRNA表達(dá)的相對水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 視網(wǎng)膜原位凋亡細(xì)胞檢測結(jié)果

各組大鼠視網(wǎng)膜切片均可見TUNEL陽性染色。TUNEL陽性產(chǎn)物位于胞核，呈棕褐色顆粒狀，陽性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層，呈散在分布。模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI較正常組明顯升高(P＜0.01);PRD治療組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI較模型組顯著降低(P＜0.01)，見表1、圖1。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)Table 1.Apoptotic index(AI)of retina in each group(±s.n=12)

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)Table 1.Apoptotic index(AI)of retina in each group(±s.n=12)

＊＊ P ＜0.01 vs diabetes model group.

Group AI Normal control 0.0236 ±0.0043＊＊Diabetes model 0.2244 ±0.0263 PRD treatment 0.1171 ±0.0196＊＊

Figure 1.Neuron apoptosis in retina detected by TUNEL staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖1 TUNEL法檢測各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡

2 免疫組織化學(xué)法檢測視網(wǎng)膜 Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白表達(dá)結(jié)果

Bcl－2、Bax和caspase－3免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)膩顆粒狀，Bcl－2和Bax免疫陽性產(chǎn)物位于胞漿，caspase－3免疫陽性產(chǎn)物位于胞核;陽性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層。糖尿病模型組與正常對照組比較，大鼠視網(wǎng)膜Bax和caspase－3蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.01)及Bcl－2蛋白表達(dá)、Bcl－2/Bax比值顯著降低(P ＜0.01)。PRD 治療組與模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜Bax和caspase－3蛋白表達(dá)均明顯降低，Bcl－2蛋白表達(dá)及Bcl－2/Bax比值顯著升高(P ＜0.01)，見表2、圖2－4。

3 RT－PCR檢測視網(wǎng)膜bcl－2、bax和caspase－3 mRNA表達(dá)結(jié)果

在 DNA marker的 328 bp、357 bp、320 bp 及 480 bp水平處分別可見清晰的bcl－2、bax和caspase－3及β－actin mRNA條帶。與正常組大鼠比較，糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜bax和caspase－3 mRNA表達(dá)明顯升高(P ＜0.01)，bcl－2 mRNA 表達(dá)和 bcl－2/bax比值顯著降低(P＜0.01)。PRD治療組與模型組比較，大鼠視網(wǎng)膜bax和caspase－3 mRNA表達(dá)均明顯降低(P ＜0.01)，bcl－2 mRNA 表達(dá)及 bcl－2/bax比值顯著升高(P ＜0.01)，見表3、圖5－7。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達(dá)Table 2.Bcl－2，Bax and caspase－3 protein expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl－2、Bax和caspase－3蛋白的表達(dá)Table 2.Bcl－2，Bax and caspase－3 protein expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs diabetes model group.

Group Bcl－2 Bax Bcl－2/Bax Caspase－3 Normal control 0.0799 ±0.0099＊＊ 0.0397 ±0.0072 ＊＊ 2.0482 ±0.3395＊＊ 0.1036 ±0.0121＊＊Diabetes model 0.0466 ±0.0074 0.0868 ±0.0083 0.5471 ±0.1364 0.3284 ±0.0254 PRD treatment 0.0624 ±0.0088＊＊ 0.0563 ±0.0061 ＊＊ 1.1183 ±0.1972＊＊ 0.1628 ±0.0133＊＊

Figure 2.Bcl－2 protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測各組視網(wǎng)膜組織Bcl－2蛋白表達(dá)

Figure 3.Bax protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測各組視網(wǎng)膜組織Bax蛋白表達(dá)

Figure 4.Caspase－3 protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測各組視網(wǎng)膜組織caspase－3蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜bcl－2、bax和caspase－3 mRNA的表達(dá)Table 3.Bcl－2，bax and caspase－3 mRNA expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

表3 各組大鼠視網(wǎng)膜bcl－2、bax和caspase－3 mRNA的表達(dá)Table 3.Bcl－2，bax and caspase－3 mRNA expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)

＊＊ P ＜0.01 vs diabetes model group.

Group Bcl－2 Bax Bcl－2/bax Caspase－3 Normal control 0.7365 ±0.0478＊＊ 0.3256 ±0.0181＊＊ 2.2615 ±0.0435＊＊ 0.1149 ±0.0284＊＊Diabetes model 0.2889 ±0.0310 0.7063 ±0.0274 0.4088 ±0.0349 0.6848 ±0.1003 PRD treatment 0.5252 ±0.0493＊＊ 0.4587 ±0.0602＊＊ 1.1495 ±0.0646＊＊ 0.3867 ±0.0369＊＊

Figure 5.Bcl－2 mRNA expression in retina detected by RTPCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖5 RT－PCR檢測各組視網(wǎng)膜組織bcl－2 mRNA表達(dá)

Figure 6.Bax mRNA expression in retina detected by RTPCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖6 RT－PCR檢測各組視網(wǎng)膜組織bax mRNA表達(dá)

Figure 7.Caspase－3 mRNA expression in retina detected by RT－PCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖7 RT－PCR檢測各組視網(wǎng)膜組織caspase－3 mRNA表達(dá)

討 論

DR包括微血管病變及神經(jīng)組織病變，二者共同損傷視網(wǎng)膜造成其功能下降。以往對微血管病變的研究較為廣泛和深入，但近年的研究表明，DR不僅存在視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的功能損害，而且常較微血管病變更早，甚至是微血管病變的啟動因素［5，6］。

細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育，維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞主動性死亡過程。視網(wǎng)膜神經(jīng)組織病變與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Barber等［7］研究發(fā)現(xiàn)，病程1個月時(shí)STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞為正常對照組的10倍。本研究結(jié)果與前人類似:糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜凋亡的神經(jīng)細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層，且神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常組明顯升高，因此提示視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡參與了DR的發(fā)生發(fā)展。

細(xì)胞凋亡的發(fā)生是在多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控下進(jìn)行的，尤其是bcl－2、bax基因與凋亡的調(diào)控關(guān)系非常密切［8，9］。bcl－2是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因，bax基因與bcl－2基因具有高度的同源序列，是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因［10］。當(dāng)bax占優(yōu)勢時(shí)，Bax蛋白同源二聚體形成，可誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡;當(dāng)Bcl－2占優(yōu)勢時(shí)，Bcl－2可以與Bax競爭結(jié)合，形成比Bax/Bax同源二聚體更穩(wěn)定的Bcl－2/Bax異源二聚體，從而使Bax/Bax同源二聚體分開，減弱Bax誘導(dǎo)凋亡的作用［11］。Bcl－2與Bax的平衡保證細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，二者比值的變化將決定細(xì)胞是生存還是凋亡，Bcl－2占優(yōu)勢、Bcl－2/bax比值升高則細(xì)胞存活;Bax占優(yōu)勢、Bcl－2/Bax 降低則細(xì)胞凋亡［12］。Caspase－3又被稱為“細(xì)胞死亡執(zhí)行者”，它的表達(dá)與活化代表了細(xì)胞凋亡的不可逆轉(zhuǎn)?；钚詂aspase－3可直接水解細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)及功能蛋白，導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)放大效應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜 Bcl－2、Bax及caspase－3蛋白表達(dá)主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層，與正常對照組比較，Bax、caspase－3表達(dá)明顯升高，Bcl－2表達(dá)及Bcl－2/Bax比值顯著降低，提示Bcl－2、Bax、caspase－3 確實(shí)在 DR 視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

菩人丹超微粉(PRD)是針對糖尿病病機(jī)關(guān)鍵“熱、虛、瘀”的中藥組方。本方以苦瓜(《廣東新語》又稱菩達(dá))清解郁熱;人參、丹參、葛根益氣生津、活血化瘀;制首烏補(bǔ)益精血，固腎益陰;水蛭祛瘀消癥，剔邪搜絡(luò)。諸藥協(xié)同，益氣養(yǎng)陰，調(diào)暢氣血，化瘀通絡(luò)?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)PRD具有抑制氧化應(yīng)激、對抗細(xì)胞凋亡失調(diào)和衰老、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織的修復(fù)與再生等作用［14，15］。本研究發(fā)現(xiàn)，PRD組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI、Bax、caspase－3的表達(dá)明顯低于模型組大鼠，Bcl－2表達(dá)及Bcl－2/Bax比值較模型組顯著升高。這表明PRD可通過上調(diào)抑制凋亡基因bcl－2表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因bax表達(dá)，抑制caspase－3的激活，從而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮對視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的保護(hù)作用。

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