董志軍, 李曉紅, 董微麗, 張鐵民
(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科,河北承德067000)
糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病眼部并發(fā)癥中嚴(yán)重的致盲病變,是導(dǎo)致視力喪失的主要原因[1,2]。以往對DR發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在視網(wǎng)膜新生血管方面。近年的研究表明[3],DR不僅有視網(wǎng)膜微血管病變,而且早期即存在視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的功能損害,視網(wǎng)膜神經(jīng)保護(hù)治療日益受到關(guān)注。本研究旨在通過觀察菩人丹超微粉(Purendan superfine powder,PRD)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響,探討其對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的保護(hù)作用。
1.1 藥物與試劑 菩人丹超微粉由苦瓜、人參、丹參、制首烏、葛根、水蛭組成,河北以嶺藥業(yè)集團(tuán)有限公司代加工生產(chǎn);鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)購自Sigma;Trizol購自Invitrogen;脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche;B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原2(B-cell leukemia/lymphoma 2,Bcl-2)和 B細(xì)胞白血病/淋巴瘤相關(guān)抗原相關(guān)X蛋白(Bcl-associated X,Bax)兔抗多克隆抗體均購自Santa Cruz;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)兔抗多克隆抗體購自Bioworld Technology;bcl-2、bax和 caspase-3引物購自上海生工公司;SP免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司;RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。
1.2 動(dòng)物 清潔級雄性Wistar大鼠[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證編號為SCXK(京)2006-0009],體重200-250g。
2.1 動(dòng)物分組、模型制備與給藥 將36只大鼠應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行完全隨機(jī)化分組,分為正常對照組、糖尿病模型組和PRD治療組,每組12只。糖尿病模型組、PRD治療組大鼠均采用2%STZ(25 mg·kg-1·d-1,3 d)連續(xù)腹腔注射建立糖尿病動(dòng)物模型,以血糖≥16.7 mmol·L-1作為成模標(biāo)準(zhǔn)[4]。模型成功建立后,依體表面積折算確定PRD治療組給藥劑量為 1.8 g 超微粉·kg-1·d-1,用蒸餾水配制成濃度為0.25 kg超微粉/L混懸液,按7.2 mL/kg動(dòng)物體重灌胃,每天灌胃1次,連續(xù)灌胃3個(gè)月。正常對照組及糖尿病模型組按7.2 mL/kg動(dòng)物體重用蒸餾水灌胃。
2.2 標(biāo)本制備 PRD治療結(jié)束后,10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.5 g·kg-1)大鼠,迅速取出雙側(cè)眼球,一側(cè)眼球浸于4%多聚甲醛固定液24 h,常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋,分別備用于TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡及免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白表達(dá);另一側(cè)眼球迅速利用動(dòng)物手術(shù)顯微鏡在冰面上鈍性分離視網(wǎng)膜組織,投入液氮中保存,備用于RT-PCR法檢測bcl-2、bax、caspase-3 mRNA表達(dá)。
2.3 TUNEL法原位檢測細(xì)胞凋亡 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水,proteinase K工作液消化15 min,TUNEL反應(yīng)液37℃孵育60 min,過氧化物酶(peroxidase,POD)轉(zhuǎn)化劑37℃孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈棕褐色著染。凋亡指數(shù)(apoptotic index,AI)的確定:切片在×400顯微鏡下選取視網(wǎng)膜,以TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目與同一視野神經(jīng)細(xì)胞總數(shù)的比值作為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)。每只動(dòng)物任選3張切片,每張切片選取5個(gè)視野,取平均值。
2.4 免疫組織化學(xué)染色檢測Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá) 眼球平行視神經(jīng)連續(xù)矢狀切片,片厚4 μm,采用SP免疫組織化學(xué)染色方法檢測視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)。Ⅰ抗分別為Bcl-2、Bax和caspase-3多克隆抗體,稀釋濃度為1∶100,DAB 顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。以0.01 mmol·L-1PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。Bcl-2和Bax以胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng),caspase-3以胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)對免疫組化陽性結(jié)果進(jìn)行定量分析:切片在×400顯微鏡下選取視網(wǎng)膜,以免疫陽性產(chǎn)物面積占視野面積的比值作為目的蛋白的相對表達(dá)水平。每只動(dòng)物任選3張切片,每張切片選取5個(gè)視野,取平均值。
2.5 RT-PCR 檢測視網(wǎng)膜 bcl-2、bax和 caspase-3 mRNA表達(dá) 取液氮中保存的視網(wǎng)膜,按Trizol總RNA抽提說明書操作,提取視網(wǎng)膜組織的總RNA。取5 μL RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳,可見明顯的28 S、18 S和5 S三條完整條帶,說明抽提的總RNA比較完整;紫外分光光度計(jì)檢測A260/A280值為1.9-2.1,說明RNA沒有被污染。取3 μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,反應(yīng)條件為:30℃10 min;55℃30 min;99℃5 min;5℃5 min。PCR反應(yīng)條件:94℃2 min;94℃30 s;50℃ -65℃30 s;72℃1 min,第2步起循環(huán)。bcl-2引物序列為:正義鏈5'-TGGGATGCCTTTGTGGAACTAT-3',反義鏈5'-GCTGATTT-GACCATTTGCCTGA -3',退火溫度為 55℃,30 個(gè)循環(huán),產(chǎn)物大小為328 bp;bax引物序列為:正義鏈5'-GAGCGAGTGTCTCCGGCGAATT-3',反義鏈 5'-GCCACAAAGATGGTCACTGTCTGC -3',退火溫度為59℃,31個(gè)循環(huán),產(chǎn)物大小為357 bp;caspase-3引物序列為:正義鏈5'-ATGTCGATGCAGCTAACCTCA -3',反義鏈 5'- TGTCTCAATACCGCAGTCCAG-3',退火溫度為53℃,31個(gè)循環(huán),產(chǎn)物大小為320 bp;β-actin引物序列為:正義鏈 5'-CATCCTGCGTCTGGACCT-3',反義鏈 5'- TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3',退火溫度為58℃,29個(gè)循環(huán),產(chǎn)物大小為480 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,采用ZF型紫外透射反射分析儀攝初像,并用Quantity One-4.6.2軟件進(jìn)行定量分析,以目的條帶的光密度與β-actin條帶吸光度的比值作為各目的基因mRNA表達(dá)的相對水平。
各組大鼠視網(wǎng)膜切片均可見TUNEL陽性染色。TUNEL陽性產(chǎn)物位于胞核,呈棕褐色顆粒狀,陽性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層,呈散在分布。模型組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI較正常組明顯升高(P<0.01);PRD治療組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI較模型組顯著降低(P<0.01),見表1、圖1。
表1 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)Table 1.Apoptotic index(AI)of retina in each group(±s.n=12)
表1 各組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)Table 1.Apoptotic index(AI)of retina in each group(±s.n=12)
** P <0.01 vs diabetes model group.
Group AI Normal control 0.0236 ±0.0043**Diabetes model 0.2244 ±0.0263 PRD treatment 0.1171 ±0.0196**
Figure 1.Neuron apoptosis in retina detected by TUNEL staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖1 TUNEL法檢測各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡
Bcl-2、Bax和caspase-3免疫陽性產(chǎn)物呈棕黃色細(xì)膩顆粒狀,Bcl-2和Bax免疫陽性產(chǎn)物位于胞漿,caspase-3免疫陽性產(chǎn)物位于胞核;陽性細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層。糖尿病模型組與正常對照組比較,大鼠視網(wǎng)膜Bax和caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)及Bcl-2蛋白表達(dá)、Bcl-2/Bax比值顯著降低(P <0.01)。PRD 治療組與模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜Bax和caspase-3蛋白表達(dá)均明顯降低,Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值顯著升高(P <0.01),見表2、圖2-4。
在 DNA marker的 328 bp、357 bp、320 bp 及 480 bp水平處分別可見清晰的bcl-2、bax和caspase-3及β-actin mRNA條帶。與正常組大鼠比較,糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜bax和caspase-3 mRNA表達(dá)明顯升高(P <0.01),bcl-2 mRNA 表達(dá)和 bcl-2/bax比值顯著降低(P<0.01)。PRD治療組與模型組比較,大鼠視網(wǎng)膜bax和caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯降低(P <0.01),bcl-2 mRNA 表達(dá)及 bcl-2/bax比值顯著升高(P <0.01),見表3、圖5-7。
表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)Table 2.Bcl-2,Bax and caspase-3 protein expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)
表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá)Table 2.Bcl-2,Bax and caspase-3 protein expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)
**P <0.01 vs diabetes model group.
Group Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax Caspase-3 Normal control 0.0799 ±0.0099** 0.0397 ±0.0072 ** 2.0482 ±0.3395** 0.1036 ±0.0121**Diabetes model 0.0466 ±0.0074 0.0868 ±0.0083 0.5471 ±0.1364 0.3284 ±0.0254 PRD treatment 0.0624 ±0.0088** 0.0563 ±0.0061 ** 1.1183 ±0.1972** 0.1628 ±0.0133**
Figure 2.Bcl-2 protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測各組視網(wǎng)膜組織Bcl-2蛋白表達(dá)
Figure 3.Bax protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測各組視網(wǎng)膜組織Bax蛋白表達(dá)
Figure 4.Caspase-3 protein expression in retina by immunohistochemical staining(×400).A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測各組視網(wǎng)膜組織caspase-3蛋白表達(dá)
表3 各組大鼠視網(wǎng)膜bcl-2、bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)Table 3.Bcl-2,bax and caspase-3 mRNA expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)
表3 各組大鼠視網(wǎng)膜bcl-2、bax和caspase-3 mRNA的表達(dá)Table 3.Bcl-2,bax and caspase-3 mRNA expression levels in retina of rats in each group(±s.n=12)
** P <0.01 vs diabetes model group.
Group Bcl-2 Bax Bcl-2/bax Caspase-3 Normal control 0.7365 ±0.0478** 0.3256 ±0.0181** 2.2615 ±0.0435** 0.1149 ±0.0284**Diabetes model 0.2889 ±0.0310 0.7063 ±0.0274 0.4088 ±0.0349 0.6848 ±0.1003 PRD treatment 0.5252 ±0.0493** 0.4587 ±0.0602** 1.1495 ±0.0646** 0.3867 ±0.0369**
Figure 5.Bcl-2 mRNA expression in retina detected by RTPCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖5 RT-PCR檢測各組視網(wǎng)膜組織bcl-2 mRNA表達(dá)
Figure 6.Bax mRNA expression in retina detected by RTPCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖6 RT-PCR檢測各組視網(wǎng)膜組織bax mRNA表達(dá)
Figure 7.Caspase-3 mRNA expression in retina detected by RT-PCR.A:normal control group;B:diabetes model group;C:PRD treatment group.圖7 RT-PCR檢測各組視網(wǎng)膜組織caspase-3 mRNA表達(dá)
DR包括微血管病變及神經(jīng)組織病變,二者共同損傷視網(wǎng)膜造成其功能下降。以往對微血管病變的研究較為廣泛和深入,但近年的研究表明,DR不僅存在視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的功能損害,而且常較微血管病變更早,甚至是微血管病變的啟動(dòng)因素[5,6]。
細(xì)胞凋亡是多細(xì)胞有機(jī)體為調(diào)控機(jī)體發(fā)育,維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過程。視網(wǎng)膜神經(jīng)組織病變與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。Barber等[7]研究發(fā)現(xiàn),病程1個(gè)月時(shí)STZ糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中凋亡的神經(jīng)細(xì)胞為正常對照組的10倍。本研究結(jié)果與前人類似:糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜凋亡的神經(jīng)細(xì)胞主要分布于視網(wǎng)膜的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層,且神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)較正常組明顯升高,因此提示視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡參與了DR的發(fā)生發(fā)展。
細(xì)胞凋亡的發(fā)生是在多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控下進(jìn)行的,尤其是bcl-2、bax基因與凋亡的調(diào)控關(guān)系非常密切[8,9]。bcl-2是一種抑制細(xì)胞凋亡的基因,bax基因與bcl-2基因具有高度的同源序列,是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因[10]。當(dāng)bax占優(yōu)勢時(shí),Bax蛋白同源二聚體形成,可誘導(dǎo)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡;當(dāng)Bcl-2占優(yōu)勢時(shí),Bcl-2可以與Bax競爭結(jié)合,形成比Bax/Bax同源二聚體更穩(wěn)定的Bcl-2/Bax異源二聚體,從而使Bax/Bax同源二聚體分開,減弱Bax誘導(dǎo)凋亡的作用[11]。Bcl-2與Bax的平衡保證細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),二者比值的變化將決定細(xì)胞是生存還是凋亡,Bcl-2占優(yōu)勢、Bcl-2/bax比值升高則細(xì)胞存活;Bax占優(yōu)勢、Bcl-2/Bax 降低則細(xì)胞凋亡[12]。Caspase-3又被稱為“細(xì)胞死亡執(zhí)行者”,它的表達(dá)與活化代表了細(xì)胞凋亡的不可逆轉(zhuǎn)。活性caspase-3可直接水解細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)及功能蛋白,導(dǎo)致蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)放大效應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn),糖尿病模型組大鼠視網(wǎng)膜 Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白表達(dá)主要位于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層和內(nèi)核層,與正常對照組比較,Bax、caspase-3表達(dá)明顯升高,Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值顯著降低,提示Bcl-2、Bax、caspase-3 確實(shí)在 DR 視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
菩人丹超微粉(PRD)是針對糖尿病病機(jī)關(guān)鍵“熱、虛、瘀”的中藥組方。本方以苦瓜(《廣東新語》又稱菩達(dá))清解郁熱;人參、丹參、葛根益氣生津、活血化瘀;制首烏補(bǔ)益精血,固腎益陰;水蛭祛瘀消癥,剔邪搜絡(luò)。諸藥協(xié)同,益氣養(yǎng)陰,調(diào)暢氣血,化瘀通絡(luò)?,F(xiàn)代藥理研究證實(shí)PRD具有抑制氧化應(yīng)激、對抗細(xì)胞凋亡失調(diào)和衰老、改善微循環(huán)、促進(jìn)組織的修復(fù)與再生等作用[14,15]。本研究發(fā)現(xiàn),PRD組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞AI、Bax、caspase-3的表達(dá)明顯低于模型組大鼠,Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值較模型組顯著升高。這表明PRD可通過上調(diào)抑制凋亡基因bcl-2表達(dá)、下調(diào)促凋亡基因bax表達(dá),抑制caspase-3的激活,從而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡,發(fā)揮對視網(wǎng)膜神經(jīng)組織的保護(hù)作用。
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