朱鐵年， 劉建坤， 劉桂紅， 張玉娜， 張利眾， 趙瑞景

(1中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院腫瘤科，河北石家莊050082;2河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北石家莊050011;3河北醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，河北石家莊050017)

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在糖尿病心肌病的發(fā)生中起重要作用［1］。臨床資料顯示，糖尿病患者未出現(xiàn)明顯微血管病變時(shí)也可出現(xiàn)心力衰竭，提示有糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DC)的發(fā)生。DC的發(fā)病機(jī)制迄今未完全明了。本研究以高脂喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射建立的2型糖尿病大鼠模型為研究對象，通過使用抗氧化制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)處理動(dòng)物，觀察氧化應(yīng)激對糖尿病心肌病發(fā)生的影響及其PDTC的保護(hù)作用。

材料和方法

1 動(dòng)物與飼料

健康8周齡雄性Wistar大鼠37只，體重180－210 g，購于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。高脂飼料參照Reed等［2］報(bào)道的配方自行配制。

2 主要試劑

STZ及PDTC購自Sigma;抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和抗硝基酪氨酸(nitrotyrosine，NT)抗體購于Santa Cruz;免疫組化用PV6001、PV6002試劑盒及DAB顯色劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH －Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒購于南京建成生物公司。

3 方法

3.1 復(fù)制2型糖尿病模型 參照Reed等［2］方法建立2型糖尿病大鼠模型。37只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)普通飼料1周后，隨機(jī)分成2組，12只為正常對照組(normal control，NC)，喂普通飼料，25 只為高脂飲食組(high－fat diet，HFD)，喂高脂飼料。飼養(yǎng)條件為:室溫(23±3)℃，室內(nèi)相對濕度 (50±5)%，自由光照。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由攝取食物和水，體重每周記錄1次。喂養(yǎng)8周后，HFD組通過口服葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素敏感性試驗(yàn)證實(shí)產(chǎn)生胰島素抵抗后，過夜禁食12 h，給予STZ(27 mg/kg)1次性腹腔注射，對照組給予同等量生理鹽水腹腔注射，3 d后隨機(jī)血糖大于11.1 mmol/L者為2型糖尿病模型成功。將造模成功的24只糖尿病大鼠隨機(jī)分為2組:12只為糖尿病模型組(diabetes mellitus，DM組)，12只為PDTC治療組(PDTC組)。PDTC治療組給予PDTC(50 mg/kg)腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射1周，DM組和NC組大鼠給予同等量生理鹽水腹腔注射。治療1周后，過夜禁食12 h，留取血液標(biāo)本，用于檢測血糖及其它生化指標(biāo)，斷頭處死各組大鼠，速取出心臟，冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，取部分左心室組織固定于3%戊二醛中，用于電鏡檢測;部分組織于10%中性甲醛中固定后，行HE、免疫組化染色;部分組織經(jīng)70%乙醇固定后，用于流式細(xì)胞儀檢測;剩余組織置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 血液生化指標(biāo)測定 采用快速血糖儀檢測血糖水平，血脂水平按照試劑盒方法測定。

3.3 心臟組織中氧化應(yīng)激生化指標(biāo)的測定 取出液氮中保存的左心室組織，于冰上制備組織勻漿，低溫離心機(jī)3 000 r/min離心15 min，留取上清，嚴(yán)格按照試劑盒說明分別測定MDA的含量、SOD和GSHPx的活性。

3.4 心肌細(xì)胞凋亡細(xì)胞百分率檢測 將經(jīng)70%乙醇固定后的心肌組織，用搓網(wǎng)法制備成單細(xì)胞懸液，經(jīng)碘化丙啶(propidium iodide，PI)于4℃染色30 min后，流式細(xì)胞儀測定凋亡細(xì)胞百分率。

3.5 電鏡觀察心臟超微結(jié)構(gòu) 經(jīng)3%戊二醛固定的心肌組織，制備電鏡超薄切片，用透射電鏡觀察心臟的超微結(jié)構(gòu)。

3.6 心臟組織形態(tài)學(xué)觀察 取甲醛固定后的各組大鼠心臟組織，分別進(jìn)行石蠟包埋、切片、HE染色及免疫組化等處理后，光鏡觀察心臟形態(tài)學(xué)變化及iNOS和NT的表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件包處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異比較采用單因素方差分析。

結(jié) 果

1 血液各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測

糖尿病組大鼠各項(xiàng)血脂均明顯高于正常對照組(P＜0.05)。PDTC組大鼠除甘油三酯水平明顯降低外，總膽固醇、低密度脂蛋白和游離脂肪酸均與糖尿病組無顯著差異，見表1。

表1 各組間生化指標(biāo)比較Table 1.Comparison of biochemical parameters among the three groups(±s.n=12)

表1 各組間生化指標(biāo)比較Table 1.Comparison of biochemical parameters among the three groups(±s.n=12)

*P ＜0.05 vs NC group;△P ＜0.05 vs DM group.NC:normal control group;DM:diabetes mellitus group;TC:total cholesterol;TG:triglycerides;LDL:low－density lipoprotein;FFA:free fatty acids.

Group TC(mmol/L)TG(mmol/L)LDL(mmol/L)FFA(mEq/L)NC 2.18 ±0.11 0.66 ±0.07 1.00 ±0.06 1.27 ±0.13 DM 8.79 ±1.83* 1.12 ±0.32* 5.65 ±1.34* 1.84 ±0.14*PDTC 7.93 ±1.23* 0.70 ±0.10△ 4.93 ±0.46* 1.65 ±0.19*

2 血糖水平

糖尿病組大鼠空腹血糖為(26.55±2.90)mmol/L，比正常對照組［(5.58 ±0.43)mmol/L］明顯增高，顯著差異(P＜0.01)。PDTC治療組空腹血糖為(11.55±2.89)mmol/L，比糖尿病組明顯降低 (P ＜0.01)，見圖 1。

Figure 1.Blood glucose level in various groups.±s.n=12.＊＊P ＜0.01 vs NC group;##P ＜0.01 vs DM group.圖1 各組大鼠血糖水平

3 心肌組織中SOD、GSH－Px活性和MDA含量

糖尿病組SOD和GSH－Px活性明顯低于正常對照組(P＜0.01)，PDTC治療后SOD和GSH－Px活性較糖尿病組明顯升高(P＜0.01或P＜0.05);糖尿病組MDA含量明顯高于正常對照組(P＜0.01)，PDTC治療后MDA含量較糖尿病組明顯降低(P ＜0.01)，見表 2。

表2 各組大鼠心肌組織MDA含量、SOD和GSH－Px活性比較Table 2.Camparison of MDA content，SOD and GSH －Px activity in cardiac tissues in each group(±s.n=12)

表2 各組大鼠心肌組織MDA含量、SOD和GSH－Px活性比較Table 2.Camparison of MDA content，SOD and GSH －Px activity in cardiac tissues in each group(±s.n=12)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs NC group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM group.SOD:superoxide dismutase;GSH － Px:glutathione peroxidase;MDA:malondialdehyde.

Group SOD(103U/g protein)GSH－Px(unit of activity)MDA(μmol/g protein)NC 188.73 ±1.49 2 437.51 ±259.19 0.89 ±0.17 DM 71.50 ±3.01＊＊ 1 667.32 ±81.16* 5.01 ±1.01*PDTC 161.00 ±2.55## 2 392.78 ±174.01# 1.60 ±0.64#

4 心肌細(xì)胞凋亡百分率

糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞凋亡百分率明顯高于正常對照組(P＜0.01);PDTC治療1周后凋亡率明顯低于糖尿病組(P＜0.05)，見表3。

表3 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡百分率Table 3.The apoptotic rate of cardiac cells in each group(%.±s.n=12)

＊＊P ＜0.01 vs NC group;#P ＜0.05 vs DM group.

NC 18.75 ±3.47 DM 25.88 ±1.63＊＊PDTC 20.99 ±4.01#

5 心肌超微結(jié)構(gòu)改變

透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)顯示，正常對照組:肌節(jié)對位整齊，線粒體結(jié)構(gòu)完好;糖尿病組:部分肌節(jié)錯(cuò)位，線粒體有嵴和膜的損傷，線粒體髓樣化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，糖原顆粒堆積，有脂滴;PDTC治療組:肌節(jié)對位基本整齊，線粒體內(nèi)只見很少數(shù)嵴溶解，肌漿網(wǎng)擴(kuò)張有改善，見圖2。

6 心肌病理形態(tài)改變及免疫組化結(jié)果

經(jīng)HE染色光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，糖尿病組心肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞變性壞死，心肌細(xì)胞間有脂肪細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤;PDTC治療組大鼠心肌損傷較糖尿病組明顯減輕。免疫組化結(jié)果顯示，iNOS和NT陽性表達(dá)信號呈棕黃色，糖尿病組大鼠心肌iNOS和NT染色明顯強(qiáng)于正常對照組;PDTC治療組iNOS和NT染色明顯弱于糖尿病組，見圖3。

Figure 2.The ultrastructural changes of cardiac cells in each group(×15 000).A:NC group;B:DM group;C:PDTC group.Red arrows show mitochondria，blue arrows show the cardiac muscle rods and green arrow shows mitochondrial damage.圖2 各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

Figure 3.Thc morphological changes and immunohistochemistry results of heart tissues in the three groups(×400).圖3 各組大鼠心肌HE及免疫組化染色結(jié)果

討 論

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是由于自由基與抗氧化系統(tǒng)失衡，使得機(jī)體促氧化能力高于抗氧化能力而造成的。已有研究發(fā)現(xiàn)，無論是1型還是2型糖尿病，都存在明顯的氧化應(yīng)激現(xiàn)象［3］。氧化應(yīng)激已經(jīng)被認(rèn)為是糖尿病各種并發(fā)癥的共同發(fā)病途徑［4］。

心肌中線粒體含量豐富，約占心肌面積的50%，線粒體功能發(fā)生輕微的變化就能引起心肌細(xì)胞的巨大變化［5］。在糖尿病狀態(tài)下，線粒體既是ROS過度產(chǎn)生的部位也是ROS作用的靶點(diǎn)，并形成正反饋。當(dāng)自由基產(chǎn)生過多，超過抗氧化酶的清除能力時(shí)，終將導(dǎo)致線粒體通透性改變及其功能紊亂，影響心肌收縮和舒張功能，促進(jìn)糖尿病心肌病的發(fā)生［6，7］。高血糖可使細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多，引起NF－κB活化。NF－κB活化后能調(diào)控其下游一系列基因如前炎癥性細(xì)胞因子腫瘤壞死因子α(TNF－α)、iNOS等的表達(dá)。iNOS表達(dá)增多，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的NO，活化的炎細(xì)胞釋放超氧陰離子()。NO可與迅速結(jié)合生成氧化作用更強(qiáng)的過氧亞硝基陰離子(ONOO－)，ONOO－可使蛋白質(zhì)酪氨酸殘基或游離酪氨酸發(fā)生硝基化反應(yīng)，形成最終產(chǎn)物NT。蛋白質(zhì)硝基化后能誘導(dǎo)酶活性喪失、細(xì)胞壞死和凋亡［8，9］?？寡趸瘎┛梢砸种芌OS的產(chǎn)生，減少DNA的氧化損傷，降低脂質(zhì)過氧化，改善體內(nèi)抗氧化防御體系，防止氧化應(yīng)激引起的疾病或并發(fā)癥的發(fā)生［10］。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿組大鼠心肌中MDA明顯高于正常對照組，SOD和GSH－Px活性顯著低于正常對照組;糖尿病組心肌iNOS、NT表達(dá)均明顯高于正常對照組。這些結(jié)果表明，糖尿病大鼠心肌處于氧化和抗氧化失衡狀態(tài)，于是導(dǎo)致線粒體損傷、細(xì)胞凋亡增加。

PDTC為二硫氨基酸酯，因其分子含有巰基(thiol)結(jié)構(gòu)，具有抗氧化及金屬螯合作用。已有研究表明，PDTC可降低糖尿病大鼠血糖［11］。我們的研究結(jié)果也證明，PDTC可明顯降低糖尿病大鼠的血糖水平，其機(jī)制與PDTC能抑制肝糖異生和促進(jìn)肝糖原合成有關(guān)［12］。PDTC還是一種高效的NF－κB抑制劑，可有效抑制氧化應(yīng)激所致的NF－κB活化，減少多種炎癥介質(zhì)的生成［13］。因此推測，PDTC可能還可通過抗氧化作用防止或減輕糖尿病心肌病的發(fā)生。我們的研究證實(shí)，經(jīng)PDTC治療后，糖尿病大鼠心肌組織MDA明顯下降，SOD、GSH－Px活性顯著升高，iNOS和NT表達(dá)明顯減少，心肌病變明顯減輕。本研究為抗氧化劑在預(yù)防糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展方面提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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