黃蔥蔥， 陳 果， 吳 艷， 連慶泉， 李 軍， 曹 紅

(溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院麻醉科，溫州醫(yī)學(xué)院疼痛醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州325027)

糖尿病神經(jīng)病理性痛(diabetic neuropathic pain，DNP)是糖尿病最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，至今尚缺乏有效的治療方法。目前越來(lái)越多研究提示MAPK家族及某些轉(zhuǎn)錄因子參與了DNP的發(fā)生與持續(xù)化過(guò)程［1］。姜黃素(curcumin，Cur)是從姜黃中提取的酚性色素，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等廣泛藥理作用，我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，在慢性結(jié)扎損傷模型(chronic constriction injury，CCI)大鼠模型中姜黃素具有神經(jīng)保護(hù)作用［2］，且對(duì)MAPK通路及活化蛋白－1(activator protein－1，AP－1)等轉(zhuǎn)錄因子的激活具有抑制作用［3］，但其在DNP中的作用尚缺乏研究，因此本研究旨在探討姜黃素對(duì)DNP大鼠的痛閾影響及p－ERK1/2－AP－1通路在其中的作用。

材料和方法

1 試劑與儀器

鏈唑霉素 (S0130，批號(hào)B64922)及Cur(28260，批號(hào) 1386823)購(gòu)自 Sigma?？?p－ERK1/2抗體(4376，兔單抗)購(gòu)自Cell Signaling Technology。AP－1探針寡核苷酸序列5'－CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA－3'－生物素標(biāo)記購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。2390型Electronic von Fery觸覺(jué)測(cè)痛儀及II T336型甩尾足底測(cè)試儀為IITC產(chǎn)品。

2 動(dòng)物造模及分組

清潔級(jí)雄性SD大鼠96只，體重220－250 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于20－25℃、晝夜交替環(huán)境中，自由攝食攝水，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境72 h。參照文獻(xiàn)［4］方法制備DNP大鼠模型，除正常對(duì)照組外，其余各組在禁食不禁飲12－16 h后腹腔注射鏈唑霉素(streptozocin，STZ)75 mg/kg。注射STZ后3 d尾靜脈非空腹血糖濃度＞16.7 mmol/L時(shí)為1型糖尿病，14 d后痛閾降低幅度＞基礎(chǔ)值15%者為DNP造模成功［5］。將大鼠隨機(jī)分為4組(n=24):正常對(duì)照組(control組)、DNP 組、DNP+溶劑(solvent，Sol)組(DNP+Sol組)、DNP+Cur 100 mg/kg組(DNP+Cur組)。DNP+Sol組、DNP+Cur組分別腹腔注射溶劑玉米油或姜黃素，按4 mL/kg，1次/d，持續(xù)2周。給藥后3、7、14 d測(cè)定機(jī)械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)、熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)及尾靜脈非空腹血糖值，隨即取出大鼠脊髓腰膨大及L4/L5背根神經(jīng)節(jié)。

3 行為學(xué)測(cè)定

給藥后3、7、14 d測(cè)定MWT和TWL的變化。

3.1 機(jī)械縮足閾值 置大鼠于透明的有機(jī)玻璃箱中，底為1 cm×1 cm的鐵絲網(wǎng)，實(shí)驗(yàn)前使之適應(yīng)15 min。手持電子壓力傳感器(探頭為直徑0.5 mm的剛性探針)由下向上垂直刺激大鼠后肢足底中部皮膚，勻速而緩慢地增加力度，直致大鼠出現(xiàn)快速縮足、舔足、甩尾等反應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)，記錄此時(shí)電子顯示器上的數(shù)值，單位為g，每次間隔30 s，左右兩后肢足底交替測(cè)試，每側(cè)3次，第1次數(shù)值波動(dòng)大，故只取后5次的平均值。

3.2 熱縮足潛伏期 將大鼠置于底為3 mm厚玻璃板的有機(jī)玻璃箱(22 cm×12 cm×22 cm)中，使其適應(yīng)15 min后用鹵素投光燈照射大鼠后肢足底中部皮膚。熱輻射刺激儀參數(shù)設(shè)定:加熱頭空閑時(shí)激光發(fā)射強(qiáng)度為20%;加熱頭測(cè)試工作時(shí)激光發(fā)射強(qiáng)度為60%;切斷時(shí)間25 s以防測(cè)試時(shí)間過(guò)長(zhǎng)對(duì)動(dòng)物造成損傷;觸發(fā)溫度30℃。記錄從照射開(kāi)始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時(shí)間即為T(mén)WL，每次間隔5 min，左右兩側(cè)交替進(jìn)行，每側(cè)3次，第1次數(shù)值波動(dòng)大，故只取后5次的平均值。

4 免疫組織化學(xué)染色

大鼠分別于藥物干預(yù)后3、7、14 d在4%水合氯醛40 mg/kg麻醉下，經(jīng)主動(dòng)脈灌注生理鹽水150mL，繼而灌注4%多聚甲醛250 mL，取大鼠L4/L5脊髓、背根神經(jīng)節(jié)，石蠟包埋，切片(4 mm)。60℃烤片至石蠟溶解，二甲苯梯度乙醇脫蠟?？乖邏簾嵝迯?fù)，3%過(guò)氧化氫封閉，滴加1∶100 p－ERK1/2的Ⅰ抗，4℃孵育24 h，取出后室溫復(fù)溫20－30 min，加Ⅱ抗37℃孵育30 min后PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染3 min，鹽酸化酒精酸化5 s，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察。細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞。陰性對(duì)照用0.01 mol/L PBS代替Ⅰ抗。采用Nikon E－800型顯微照相系統(tǒng)采集圖像。每隔5張切片取1張，計(jì)數(shù)脊髓背角I、Ⅱ?qū)覮issauer區(qū)和背根神經(jīng)節(jié)中間區(qū)p－ERK的陽(yáng)性細(xì)胞率，反映其表達(dá)水平。

5 免疫印跡(Western blotting)法檢測(cè)

動(dòng)物在4%水合氯醛40 mg/kg深麻醉下，迅速取出L4/L5脊髓節(jié)段與L4/L5背根神經(jīng)。用玻璃研磨器10倍于組織塊的冰冷裂解液將組織機(jī)械性地?fù)v碎成勻漿。提取總蛋白并根據(jù)BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度后備用。取等量樣本加至10%SDS－聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳，濃縮膠70 V，分離膠140 V。濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(聚偏二氟乙烯)。5%脫脂牛奶封閉1 h后加兔抗pERK1/2多克隆抗體(1∶1 000)4℃ 孵育過(guò)夜;TBST沖洗，3×15 min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗(1∶1 000)，室溫?fù)u床孵育1.5 h，用PBS洗滌后進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)熒光(enhanced chemiluminescence，ECL)反應(yīng)，后顯影、定影。X光圖片采用Quantity One圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行蛋白半定量分析。

6 電泳遷移率變動(dòng)分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)

動(dòng)物在4%水合氯醛40 mg/kg深麻醉下，迅速取出L4/L5脊髓節(jié)段與L4/L5背根神經(jīng)節(jié)，新鮮提取胞核蛋白備用。制備非變性6% 聚丙烯酰胺凝膠，并在0.5×TBE、100 V電壓下預(yù)電泳30－60 min。寡核苷酸探針與核蛋白結(jié)合反應(yīng)在20μL反應(yīng)體系中，依次加入2 μL 10×結(jié)合緩沖液(10 mmol/L Tris，500 mmol/L KC1，10 mmol/L DTT，pH7.5)和 1 μL Poly(dI·dC)(1 g/L)，1 μL 5%glycerol，1 μL 1 mmol/L MgCl2，1μL 1%nonidet P － 40、1 μL 0.5 mmol/L EDTA，10 μg核蛋白及 2 μL 雙鏈 AP －1 寡核苷酸探針(20 fmo1)，加超純水至20 μL，混勻后，室溫下反應(yīng)30 min。在上述反應(yīng)體系中加入上樣緩沖液后在0.5×TBE環(huán)境中100 V恒壓下電泳，至溴酚藍(lán)移動(dòng)到凝膠2/3－3/4處停止。將含有核蛋白－核苷酸探針復(fù)合物和游離探針的凝膠轉(zhuǎn)移至帶正電荷的尼龍膜，0.5×TBE，380 mA恒流，轉(zhuǎn)膜60 min。用紫外手提式分析儀(254 nm)在尼龍膜上方大約1 cm處照射10 min，使寡核苷酸探針交聯(lián)于尼龍膜上。封閉此膜，再加入鏈霉親和素偶合辣根過(guò)氧化酶室溫下?lián)u動(dòng)孵育15 min。后洗滌、平衡，進(jìn)行增強(qiáng)化學(xué)熒光反應(yīng)，即可顯影、定影。X光圖片采用Quantity One圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行蛋白半定量分析。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析。

結(jié) 果

1 造模前后血糖的變化

大鼠腹腔單次STZ注射前尾靜脈血糖值為(4.7±1.2)mmol/L，注射后3 d明顯升高至(30.9±6.8)mmol/L(P＜0.01)，并能持續(xù)到注射后28 d［(33.3±3.4)mmol/L］，P ＜0.01。

2 行為學(xué)結(jié)果

DNP組STZ誘導(dǎo)后14 d，MWT值較造模前明顯下降(P＜0.05)，且持續(xù)到STZ誘導(dǎo)后28 d(P＜0.05);TWL值較誘導(dǎo)前明顯縮短(P＜0.05)，并持續(xù)到STZ誘導(dǎo)后28 d。Cur組姜黃素治療7 d后行為學(xué)即有改善，與DNP組相比，可升高M(jìn)WT和延長(zhǎng)TWL(P＜0.05)，而DNP+Sol組與DNP組兩者之間行為學(xué)指標(biāo)無(wú)明顯差異，見(jiàn)表1。

表1 各組別不同時(shí)點(diǎn)機(jī)械痛閾和熱痛閾比較Table 1.Comparison of MTL and TWL among different groups(±s.n=24)

表1 各組別不同時(shí)點(diǎn)機(jī)械痛閾和熱痛閾比較Table 1.Comparison of MTL and TWL among different groups(±s.n=24)

*P ＜0.05 vs pre－model;#P ＜0.05 vs post－ model;△P ＜0.05 vs DNP group.

Post－treatment 3 d 7 d 14 d MWT(g) Control 64±14 63±15△ 65±11△ 63±11△ 64±9.10 Index Group Pre－model Post－model△DNP 64±17 40±10* 39±11＊ 38±11＊ 37±12＊DNP+Sol 63±17 39±10＊ 37±11＊ 39±11＊ 37±10＊DNP+Cur 64±15 39±10＊ 42±10＊ 47±10＊#△ 56±12＊#△TWL(s) Control 11.4 ±2.3 11.9 ±7.4△ 11.8 ±2.3△ 11.5 ±2.1△ 11.8 ±3.1△DNP 12.0 ±3.0 7.4 ±2.2＊ 7.6 ±2.1＊ 7.5 ±1.6＊ 7.7 ±1.5＊DNP+Sol 12.0 ±3.3 7.5 ±2.1＊ 7.5 ±1.4＊ 7.3 ±1.9＊ 7.5 ±2.0＊DNP+Cur 12.1 ±3.1 7.7 ±2.2＊ 7.8 ±1.7＊ 8.8 ±2.2＊#△ 9.8 ±2.1＊#△

3 p－ERK1/2的免疫組化結(jié)果

與control組相比，DNP組大鼠在STZ誘導(dǎo)后14 d，脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)p－ERK1/2表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，Cur治療14 d后 p－ERK1/2在脊髓(圖1)及背根神經(jīng)節(jié)(圖2)表達(dá)較DNP組有所下降(P＜0.05)，DNP+Sol組脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)p－ERK1/2的表達(dá)與DNP組無(wú)顯著差異。

Figure 1.p－ERK1/2 expression in dosal horn detected by immunohistochemisty.A－C:p－ERK1/2 expression after 14 d treatment with curcumin(Cur);A:control;B:DNP;C:DNP+Cur.△P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs DNP group.圖1 免疫組化法檢測(cè)脊髓背角p－ERK1/2表達(dá)

Figure 2.p－ERK1/2 expression in dorsal root ganglion after treatment with curcumin.A －C:p－ERK1/2 expression after 14 d treatment;A:control;B:DNP;C:DNP+Cur.△P ＜0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs DNP group.圖2 給藥后背根神經(jīng)節(jié)p－ERK1/2表達(dá)

4 p－ERK1/2的Western blotting結(jié)果

與正常組比較，STZ誘導(dǎo)后14 d脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)p－ERK1/2表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)，可持續(xù)至STZ誘導(dǎo)后28 d(P＜0.05)。給予100 mg/kg Cur腹腔注射14 d后，與DNP組比較可明顯降低p－ERK1/2的表達(dá)(P ＜0.05)，見(jiàn)圖 3、4;DNP+Sol組脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)p－ERK1/2的表達(dá)與DNP組無(wú)顯著差異。

5 AP－1的EMSA結(jié)果

與control組比較，STZ誘導(dǎo)后28 d脊髓背角AP－1表達(dá)上調(diào)(P ＜0.05)，給予100mg/kg Cur腹腔注射14 d后，可明顯降低脊髓背角AP－1的表達(dá)(P＜0.05)，見(jiàn)圖5，但對(duì)背根神經(jīng)節(jié)無(wú)影響(P ＞0.05)，DNP+Sol組脊髓背角AP－1表達(dá)與DNP組無(wú)差異。

Figure 3.p－ERK1/2 expression in dorsal horn detected by Western blotting.A:p － ERK1/2 expression 14 d after treatment;B:p－ERK1/2 expression at different time points after treatment.△P ＜ 0.05 vs control group;#P ＜0.05 vs DNP group.圖3 Western blotting檢測(cè)脊髓背角p－ERK1/2表達(dá)

Figure 4.p－ERK1/2 expression in dorsal root ganglion detected by Western blotting.A:p － ERK1/2 expression 14 d after tratment;B:p－ERK1/2 expression at different time points after treatment.△P ＜0.05 vs control group;*P ＜0.05 vs DNP group.圖4 Western blotting檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)p－ERK1/2表達(dá)

Figure 5.Expression of AP－1 in dorsal horn after 14－day Cur treatment by EMSA.*P ＜0.05 vs 1 group;△P ＜0.05 vs 2 group.1:control;2:DNP;3:DNP+Cur;4:DNP+Sol.圖5 Cur治療14 d后脊髓背角AP－1的表達(dá)

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)Cur治療14 d后可改善糖尿病神經(jīng)痛大鼠痛覺(jué)過(guò)敏的行為學(xué)表現(xiàn)，與其抑制糖尿病誘導(dǎo)的p－ERK1/2及AP－1激活呈現(xiàn)一致性。

STZ誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型，由于其穩(wěn)定性及重復(fù)性好、方法簡(jiǎn)單、成功率高而被廣泛用于制備糖尿病動(dòng)物模型。臨床研究發(fā)現(xiàn)，DNP隨年齡增加和病程延長(zhǎng)而惡化，且與血糖控制水平密切相關(guān)［6］;但也發(fā)現(xiàn)一些血糖控制良好的患者其疼痛仍能持續(xù)數(shù)年，且部分患者其疼痛發(fā)作與血糖波動(dòng)無(wú)一致性［7］，認(rèn)為高糖血癥或代謝異常所致的高血糖是DNP神經(jīng)病變的一個(gè)觸發(fā)因素，是必要但不充分條件，其它下游分子機(jī)制如MAPK的激活可能參與了糖尿病神經(jīng)痛的形成［1，8］。在周?chē)窠?jīng)損傷的模型中可以觀察到脊髓ERK磷酸化而激活，并參與了痛覺(jué)過(guò)敏形成［9］。而 Purves等［10］研究發(fā)現(xiàn)在 STZ 誘導(dǎo)的糖尿病模型中腰段背根神經(jīng)節(jié)出現(xiàn)ERK的激活。MAPK抑制劑U0126逆轉(zhuǎn)了DNP動(dòng)物模型下接著所致的痛覺(jué)過(guò)敏則進(jìn)一步證實(shí)了MAPK在疼痛中的關(guān)鍵作用［5］。糖尿病導(dǎo)致元醇通路激活，促進(jìn)了 DRG中MAPKs的激活［11］，MAPK的激活促使轉(zhuǎn)錄因子如核因子 κB(nuclear factor－ κB，NF － κB)、AP －1、p53等活化轉(zhuǎn)移入核進(jìn)而改變某些蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，如一氧化氮(nitric oxide，NO)、環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX －2)、內(nèi)皮素1(endothelin 1 ，ET－1)、黏附分子等表達(dá)增加，加重了炎癥反應(yīng)，對(duì)DNP的形成和持續(xù)至關(guān)重要。而ERK的激活還能通過(guò)非轉(zhuǎn)錄途徑如磷酸化相關(guān)蛋白、關(guān)鍵受體、離子通道來(lái)提高神經(jīng)元興奮性，產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏［12，13］。本研究結(jié)果表明，正常大鼠脊髓背角和背根神經(jīng)節(jié)中神經(jīng)元細(xì)胞核p－ERK1/2和AP－1表達(dá)極少，STZ誘導(dǎo)后14 d大鼠背根神經(jīng)節(jié)和脊髓背角p－ERK1/2表達(dá)開(kāi)始上調(diào)，21 d脊髓p－ERK1/2高表達(dá)，28 d脊髓AP－1表達(dá)升高，此時(shí)大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏，痛覺(jué)異常表現(xiàn)最為顯著，提示p－ERK1/2及AP－1的激活與痛覺(jué)過(guò)敏呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，提示激活的p－ERK1/2和AP－1可能參與了DNP的發(fā)生、發(fā)展與持續(xù)化的過(guò)程。

Cur具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、改善缺血再灌注損傷等藥理作用［14，15］。Cur能通過(guò)抑制 TNF－α、NO的表達(dá)而緩解糖尿病大鼠熱痛覺(jué)過(guò)敏［16］。Cur能下調(diào)TGF－β1來(lái)抑制大鼠系膜細(xì)胞AP－1的活化［17］。Bierhaus等［18］證實(shí) Cur能直接抑制 AP －1與其相應(yīng)的DNA序列結(jié)合而發(fā)揮抑制作用。

Cur治療14 d后可明顯下調(diào)糖尿病神經(jīng)痛大鼠脊髓背角及背根神經(jīng)節(jié)中p－ERK1/2和脊髓AP－1的表達(dá)。其潛在機(jī)制可能是Cur在DNP發(fā)生的早期抑制了ERK1/2磷酸化，在DNP的后期則抑制AP－1的激活及其下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如各種炎癥因子的表達(dá)。

本研究結(jié)果提示Cur可對(duì)抗糖尿病神經(jīng)病理性疼痛，抑制了ERK與AP－1的激活，但由于缺乏特異性的ERK拮抗劑，因此我們不能確定Cur對(duì)AP－1的抑制作用是通過(guò)ERK通路亦或是直接作用于AP－1。同時(shí)在應(yīng)用Cur后，糖尿病大鼠神經(jīng)痛的行為學(xué)改善早于生化指標(biāo)p－ERK1/2及AP－1表達(dá)的改變，提示Cur抗糖尿病大鼠神經(jīng)痛還可能存在其它途徑。

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