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        烏司他丁對心肺復蘇后兔腎損傷的影響*

        2011-01-30 03:58:10嚴躍紅黃愛群李顯波荊小莉
        中國病理生理雜志 2011年6期
        關鍵詞:研究

        嚴躍紅, 黃愛群, 李顯波, 荊小莉

        (1廣州醫(yī)學院港灣醫(yī)院內一科,廣東廣州510700;2中山大學附屬第一醫(yī)院急診科,廣東廣州510080)

        心肺復蘇(cardiopulmonary resuscitation,CPR)后病人經(jīng)常出現(xiàn)急性腎功能衰竭 (acute renal failure,ARF),發(fā)生率在12% -28%之間,存活病人中也經(jīng)常見到一過性的腎損傷[1-3]。盡管CPR后嚴重的進展性腎功能衰竭并不是經(jīng)常發(fā)生,心臟驟停前腎功能正常的病人出現(xiàn)持續(xù)的腎功能衰竭也比較少見[3],CPR后血肌酐水平的升高是可逆的,但腎功能的受損和預后不良密切相關。CPR后多器官損傷的機制有缺血缺氧性損傷、氧自由基損傷和炎癥反應[4-6]。最近的研究表明CPR后全身各主要臟器出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤,表明炎癥反應是CPR后多器官損傷的基礎[7]。目前還沒有專門的措施來保護CPR后腎損傷,預防ARF。研究復蘇后急性腎功能衰竭的發(fā)病機制,對提高心肺復蘇患者的存活率具有重要的臨床意義。

        近年的研究表明烏司他丁(ulinastatin,UTI)可抑制中性粒細胞的聚集和活化,減少氧自由基的生成等對移植肺[8]、全身炎癥反應導致的多器官損傷[9]具有保護作用,但UTI對CPR后的腎臟損傷是否具有保護作用還未見相關報道,本研究通過觀察UTI對CPR后兔腎組織內炎癥細胞浸潤、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表達和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響來探討UTI對CPR后腎損傷的機制。

        材料和方法

        1 材料

        1.1 動物 24只雄性新西蘭成年大白兔,由中山大學實驗動物中心提供。動物購進后飼養(yǎng)1周,實驗前晚禁食不禁水。動物麻醉:用戊巴比妥鈉(Sigma)30 mg/kg,由耳緣靜脈注入,酌情給予1/4的首劑量維持。

        1.2 手術操作 麻醉成功后,動物平臥,四肢固定于操作臺上。胸部備皮,用于誘導室顫和除顫。用3.0號氣管導管經(jīng)口氣管插管,插管成功后固定氣管導管,接小動物呼吸機(Rodent ventilator 683),通氣頻率45次/min,潮氣量10 mL/kg,根據(jù)血氣分析結果調整呼吸機參數(shù),PCO2控制在35-45 mmHg之間。皮下針常規(guī)Ⅱ導聯(lián)心電監(jiān)護;小號留置針(Becton Dickinson Medical Devices)穿刺右耳動脈,接高敏感換能器監(jiān)測動脈血壓,用5×103U/L肝素生理鹽水充滿管腔。心電圖和動脈血壓通過4道生理信號采集分析系統(tǒng)(Biopac Systems MAP150)連續(xù)記錄在臺式電腦上。留置導尿管,每4 h記錄1次尿量。耳緣靜脈采血1 mL/4 h檢測血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和肌酐(creatinine,Cr)水平。

        1.3 室顫-CPR模型的建立 參照文獻[10]實驗數(shù)據(jù)按照Utstein模式記錄。采用經(jīng)胸體表交流電(6 V、50 Hz)誘發(fā)室顫,致顫電極放置后接交流電誘發(fā)室顫,誘發(fā)時間5-10 s。誘發(fā)室顫成功的標準為:動脈搏動消失,血壓迅速下降,接近0 mmHg,心電圖顯示室顫波形。室顫成功后斷開呼吸機,室顫動物根據(jù)隨機數(shù)字隨機分為對照組(control組)和UTI組。室顫持續(xù)5 min后開始CPR,按照室顫前的模式接呼吸機通氣,先給予2 min的心前區(qū)胸外按壓,按壓頻率200次/min,按壓深度為前后胸徑的1/3,同時在3 min內給予腎上腺素20 μg·kg-1。按壓2 min后給予25 J的能量除顫(SAN-ei cardiopace 3MII)。反復進行上述CPR周期,如15 min未恢復自主循環(huán)(return of spontaneous circulation,ROSC),宣布復蘇失敗。ROSC后維持實驗動物平均動脈血壓大于60 mmHg,給予生理需要的能量補充,UTI組ROSC后除給予 UTI 2.5×104U/kg,靜脈注射1次(廣州天普生化醫(yī)藥股份有限公司)外,其余措施均與control組相同。

        1.4 CPR后腎功能的監(jiān)測 ROSC后每4 h記錄1次尿量,每4h采血1次,用Abbott公司的AXSYM分析系統(tǒng)檢測血清BUN和Cr水平。

        1.5 標本采集 ROSC后24h在過量麻醉下,分離左側頸外靜脈采血后剪開,經(jīng)右側頸總動脈灌注生理鹽水至血液變清,取一側腎臟髓質,用銳利刀片切成 0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm 大小3塊,取其中1塊放入4%甲醛液中固定后石蠟包埋切片。另2塊腎臟組織用液氮冷藏,用于檢測MDA含量。

        ①腎髓質中MDA含量的測定 試劑盒購自于南京建成生物工程研究所,按照試劑盒操作說明書進行。

        ②腎髓質炎癥細胞浸潤和TNF-α表達的檢測 腎髓質炎癥細胞的浸潤用髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)陽性細胞表示,采用免疫組織化學鏈霉親和素生物素標記法進行染色。每組任意取6個不同高倍視野(×40),用圖像處理軟件Image-Pro Plus 6.0進行半定量分析。Ⅰ抗兔多抗MPO和TNF-α購自武漢博士德公司。操作步驟如下:5 μm石蠟切片脫蠟至水;3%H2O2室溫孵育5-10 min;抗原修復:放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中,并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中,電爐上加熱煮沸,從小容器的溫度到達92-98℃起開始計時15 min,然后室溫冷卻30 min,蒸餾水沖洗,PBS沖洗;5% -10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉,室溫孵育10 min。傾去血清,勿洗,滴加1∶100 TNF-α 或1∶200 VCAM -1,4 ℃過夜;PBS沖洗,5 min×3次。滴加第2代生物素標記Ⅱ抗工作液,37℃或室溫孵育10-30 min;PBS沖洗,5 min×3次;滴加適當1∶25稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋),37℃孵育10-30 min;PBS沖洗,5 min×3次;顯色劑顯色(DAB或AEC);自來水充分沖洗、復染、封片。

        2 統(tǒng)計學處理

        數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包,依據(jù)正態(tài)檢驗(Kolmogorov-Smirnov)結果分別用均數(shù)±標準差(±s)或四分位數(shù)法表示,依據(jù)正態(tài)檢驗結果用t檢驗或秩和檢驗(Mann-Whitney rank)。

        結 果

        1 ROSC后動物情況

        每組12只動物,所有動物均能致顫成功。Control和UTI組各有9只動物獲得ROSC,6只存活到實驗結束,ROSC后所有動物均需機械維持通氣2-3 h,呼吸、循環(huán)穩(wěn)定后改為自主呼吸。2組動物的生理學參數(shù)(體重、心率、呼吸)和復蘇相關的指標(基礎生命支持時間、除顫次數(shù)、腎上腺素用量)之間沒有顯著差異。

        2 ROSC后2組動物尿量、血清BUN及Cr的變化

        ROSC后第1個時段2組動物的尿量分別為(11.00 ± 1.73)mL 和(11.05 ±1.72)mL,隨后逐漸下降,至第3或第4個時段時,尿量降至最低,分別為(7.73 ±0.60)mL 和(8.71 ±0.74)mL,隨后逐漸增加。UTI組動物的尿量從ROSC后的第3個時段開始,尿量明顯多于 control組,差異顯著,見表1。

        表1 ROSC后各時段2組動物尿量的變化Table 1.Comparison of the urine output between the two groups during every observation stage(mL.±s.n=6)

        表1 ROSC后各時段2組動物尿量的變化Table 1.Comparison of the urine output between the two groups during every observation stage(mL.±s.n=6)

        *P <0.05,**P <0.01 vs control group.

        Group 0-4 h 4-8 h 8-12 h 12-16 h 16-20 h 20-24 h Control 11.00 ±1.73 9.11 ±1.22 7.86 ±0.69 7.73±0.60 8.43 ±0.45 10.57 ±0.62 UTI 11.05 ±1.72 9.88 ±1.00 8.71 ±0.74* 9.12 ±0.37** 9.75 ±0.38** 12.12 ±0.54**

        ROSC后2組動物血清BUN和Cr水平逐漸升高,至第5或第4時段達到最高水平,BUN為(12.00±0.68)mmol/L 和(10.20 ± 0.30)mmol/L,Cr為(12.00 ±0.68)μmol/L 和(10.20 ±0.30)μmol/L,隨后逐漸下降。UTI組動物從ROSC后第2觀察時段開始,血清BUN和Cr水平均明顯低于Control組,差異顯著,見表2、3。

        表2ROSC后2組動物BUN變化Table 2.Comparison of the changes of BUN between the two groups during every observation stage(mmol/L.±s.n=6)

        表2ROSC后2組動物BUN變化Table 2.Comparison of the changes of BUN between the two groups during every observation stage(mmol/L.±s.n=6)

        *P <0.05,**P <0.01 vs control group.

        Group 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h Control 4.81 ±0.94 6.81 ±0.55 8.09 ±1.05 10.47±0.79 12.00 ±0.68 9.78 ±0.44 UTI 4.62 ±0.79 5.40 ±0.80** 6.81 ±0.84* 9.02 ±0.95* 10.20 ±0.30** 8.48 ±0.49**

        表3 ROSC后2組動物血Cr變化Table 3.Comparison of the changes of serum Cr between the two groups during every observation stage(μmol/L.±s.n=6)

        表3 ROSC后2組動物血Cr變化Table 3.Comparison of the changes of serum Cr between the two groups during every observation stage(μmol/L.±s.n=6)

        *P <0.05,**P <0.01 vs control group.

        Group 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h Control 39.44 ±4.60 50.59 ±4.51 52.88 ±4.38 59.93 ±2.55 60.45 ±1.85 52.48 ±2.20 UTI 37.16 ±5.15 43.43 ±2.48** 48.35 ±4.00* 55.23 ±3.98* 53.97 ±1.29** 47.55 ±2.39**

        3 腎髓質炎癥細胞浸潤和TNF-α表達變化

        ROSC后24 h腎髓質內出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤,主要在腎小管區(qū)域內,腎小球內相對較少,control組MPO 陽性細胞數(shù)為(7.44 ±0.01)%,UTI組為(5.30 ±0.01)%,2 組之間差異顯著,P <0.05,見圖1。腎髓質 TNF-α表達,control組為(67.53±0.06)%,明顯高于 UTI組(59.30±0.06)%,P <0.05,見圖2。

        4 腎髓質內MDA含量變化

        ROSC后24 h腎髓質內含有大量的MDA,control組為(9.53 ±0.49)μmol/g,UTI組為(8.42 ± 0.55)μmol/g,2 組之間差異極顯著,P <0.01,見圖3。

        Figure 1.Comparison of the MPO -positive cells in kidney medulla between the two groups(immunohistochemical staining,×40).Twenty-four hours after CPR,some MPO-positive cells appeared in kidney medulla,especially around tubule.The percentage of MPO -positive cells in control group was(7.44 ±0.01)%,and higher than that in UTI treatment group(5.30 ±0.01)%.±s.n=6.*P<0.05 vs control.A:control;B:UTI group.圖1 2組動物腎髓質內MPO陽性細胞浸潤情況

        Figure 2.Comparison of the expression of TNF-α in kidney medulla between the two groups(immunohistochemical staining,×40).Twenty- four hours after CPR,there were overexpression of TNF - α in kidney medulla,(67.53 ±0.06)%in control group and(59.30±0.06)%in UTI group.±s.n=6.*P<0.05 vs control.A:control;B:UTI group.圖2 2組動物腎髓質內TNF-α表達情況

        Figure 3.Comparison of the concentration of MDA in kidney medulla between the two groups.Twenty - four hours after CPR,the concentration of MDA was(9.53 ± 0.49)μmol/g in control group and(8.42 ±0.55)μmol/g in UTI group.±s.n=6.**P<0.01 vs control.圖3 2組動物腎髓質內MDA含量

        討 論

        本研究結果表明新西蘭兔心室顫動5 min后進行CPR,ROSC后出現(xiàn)了明顯的腎功能受損,表現(xiàn)為尿量逐漸下降、血清BUN和Cr水平逐步升高。本研究中ROSC后第4或第5觀察時段動物尿量開始增加,同時血清BUN和Cr水平開始下降,表明CPR后這種腎功能損害可能是一過性的,與臨床研究中觀察到的情況相一致[1-3]。盡管CPR后嚴重的進展性腎功能衰竭并不是經(jīng)常發(fā)生、出現(xiàn)持續(xù)的腎功能衰竭也比較少見[3],但是腎功能的受損還是和預后密切相關,從而表明腎功能受損是反映病情嚴重程度的一個重要指標。本研究結果表明兔室顫5 min,ROSC后給予標準劑量的UTI可減輕CPR后24 h腎髓質內炎癥細胞的浸潤程度、減少TNF-α的表達和降低MDA含量,對CPR后腎損傷具有保護作用。

        本研究中我們發(fā)現(xiàn)CPR后腎髓質內出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤,主要分布在腎小管周圍,與缺血性休克腎損傷中觀察到的景象相一致。心臟驟停其主要病理過程和失血性休克有相似之處:先是缺血缺氧性組織損傷,接著血流的恢復出現(xiàn)再灌注損傷,交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活進一步加重內臟器官如腎臟、腸道等的缺血和損傷[11]。再灌注損傷主要是由氧自由基和炎癥反應引起的[4-6]。自由基作用于腎臟內生物膜中多不飽和脂肪酸,引起鏈式反應(脂質過氧化反應)并產(chǎn)生大量的脂質過氧化物及其降解產(chǎn)物MDA等,這些物質可以造成腎臟組織細胞生物膜的破壞而進一步喪失功能,腎臟功能隨之受損[12]。NF-κB是調節(jié)炎癥反應的樞紐因子,可促進多種炎癥因子的轉錄,如 TNF-α、IL-1等,并且 NF-κB是氧化應激敏感型的轉錄因子[13],在再灌注期間大量產(chǎn)生的氧自由基可激活NF-κB使TNF-α表達增加,導致組織損傷,最近的研究也進一步證實炎癥反應在復蘇后組織損傷中的重要作用[7]。以上分析表明,再灌注期間氧自由基和炎癥反應損傷兩者相互依賴相互促進。正如本研究中我們觀察到的一樣:CPR后實驗動物腎臟出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤和氧化應激產(chǎn)物MDA的大量增加,這提示減輕CPR后的炎癥反應和氧自由基釋放可能減輕腎臟損傷。

        UTI是從人尿中提取的分子量為67 000的糖蛋白,是一種高效廣譜的蛋白酶抑制劑。不僅能抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶,對彈力蛋白酶和透明質酸酶等也有抑制作用。它可通過結合到酶底物結合部位的競爭性抑制(如透明質酸酶、纖溶酶)以及和底物結合無關的非競爭性抑制(胰蛋白酶)等方式與有多種酶的位點結合,能同時獨立抑制多種酶的活性[13],因而對全身炎癥反應、多臟器功能衰竭等引起的組織或器官損傷具有保護作用[9]。本研究中UTI組動物ROSC后給予標準劑量UTI 2.5×104U/kg后腎損傷明顯減輕,尿量高于對照組,血Cr、BUN水平低于對照組,腎組織內炎癥細胞數(shù)、TNF-α表達水平和MDA水平均低于對照組,證明UTI通過減輕CPR后腎臟炎癥細胞浸潤、炎癥反應和氧自由基損傷來發(fā)揮腎臟保護作用。以往的研究也證實UTI可抑制中性粒細胞的聚集和活化,減少氧自由基的生成,對移植肺具有保護作用,且呈劑量效應關系[8],但本研究僅設計了標準劑量1組,CPR后大劑量UTI是否更具有保護作用還需要進一步研究來證實。

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