嚴躍紅， 黃愛群， 李顯波， 荊小莉

(1廣州醫(yī)學院港灣醫(yī)院內一科，廣東廣州510700;2中山大學附屬第一醫(yī)院急診科，廣東廣州510080)

心肺復蘇(cardiopulmonary resuscitation，CPR)后病人經(jīng)常出現(xiàn)急性腎功能衰竭 (acute renal failure，ARF)，發(fā)生率在12% －28%之間，存活病人中也經(jīng)常見到一過性的腎損傷［1－3］。盡管CPR后嚴重的進展性腎功能衰竭并不是經(jīng)常發(fā)生，心臟驟停前腎功能正常的病人出現(xiàn)持續(xù)的腎功能衰竭也比較少見［3］，CPR后血肌酐水平的升高是可逆的，但腎功能的受損和預后不良密切相關。CPR后多器官損傷的機制有缺血缺氧性損傷、氧自由基損傷和炎癥反應［4－6］。最近的研究表明CPR后全身各主要臟器出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤，表明炎癥反應是CPR后多器官損傷的基礎［7］。目前還沒有專門的措施來保護CPR后腎損傷，預防ARF。研究復蘇后急性腎功能衰竭的發(fā)病機制，對提高心肺復蘇患者的存活率具有重要的臨床意義。

近年的研究表明烏司他丁(ulinastatin，UTI)可抑制中性粒細胞的聚集和活化，減少氧自由基的生成等對移植肺［8］、全身炎癥反應導致的多器官損傷［9］具有保護作用，但UTI對CPR后的腎臟損傷是否具有保護作用還未見相關報道，本研究通過觀察UTI對CPR后兔腎組織內炎癥細胞浸潤、腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)表達和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的影響來探討UTI對CPR后腎損傷的機制。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 24只雄性新西蘭成年大白兔，由中山大學實驗動物中心提供。動物購進后飼養(yǎng)1周，實驗前晚禁食不禁水。動物麻醉:用戊巴比妥鈉(Sigma)30 mg/kg，由耳緣靜脈注入，酌情給予1/4的首劑量維持。

1.2 手術操作 麻醉成功后，動物平臥，四肢固定于操作臺上。胸部備皮，用于誘導室顫和除顫。用3.0號氣管導管經(jīng)口氣管插管，插管成功后固定氣管導管，接小動物呼吸機(Rodent ventilator 683)，通氣頻率45次/min，潮氣量10 mL/kg，根據(jù)血氣分析結果調整呼吸機參數(shù)，PCO2控制在35－45 mmHg之間。皮下針常規(guī)Ⅱ導聯(lián)心電監(jiān)護;小號留置針(Becton Dickinson Medical Devices)穿刺右耳動脈，接高敏感換能器監(jiān)測動脈血壓，用5×103U/L肝素生理鹽水充滿管腔。心電圖和動脈血壓通過4道生理信號采集分析系統(tǒng)(Biopac Systems MAP150)連續(xù)記錄在臺式電腦上。留置導尿管，每4 h記錄1次尿量。耳緣靜脈采血1 mL/4 h檢測血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和肌酐(creatinine，Cr)水平。

1.3 室顫－CPR模型的建立 參照文獻［10］實驗數(shù)據(jù)按照Utstein模式記錄。采用經(jīng)胸體表交流電(6 V、50 Hz)誘發(fā)室顫，致顫電極放置后接交流電誘發(fā)室顫，誘發(fā)時間5－10 s。誘發(fā)室顫成功的標準為:動脈搏動消失，血壓迅速下降，接近0 mmHg，心電圖顯示室顫波形。室顫成功后斷開呼吸機，室顫動物根據(jù)隨機數(shù)字隨機分為對照組(control組)和UTI組。室顫持續(xù)5 min后開始CPR，按照室顫前的模式接呼吸機通氣，先給予2 min的心前區(qū)胸外按壓，按壓頻率200次/min，按壓深度為前后胸徑的1/3，同時在3 min內給予腎上腺素20 μg·kg－1。按壓2 min后給予25 J的能量除顫(SAN－ei cardiopace 3MII)。反復進行上述CPR周期，如15 min未恢復自主循環(huán)(return of spontaneous circulation，ROSC)，宣布復蘇失敗。ROSC后維持實驗動物平均動脈血壓大于60 mmHg，給予生理需要的能量補充，UTI組ROSC后除給予 UTI 2.5×104U/kg，靜脈注射1次(廣州天普生化醫(yī)藥股份有限公司)外，其余措施均與control組相同。

1.4 CPR后腎功能的監(jiān)測 ROSC后每4 h記錄1次尿量，每4h采血1次，用Abbott公司的AXSYM分析系統(tǒng)檢測血清BUN和Cr水平。

1.5 標本采集 ROSC后24h在過量麻醉下，分離左側頸外靜脈采血后剪開，經(jīng)右側頸總動脈灌注生理鹽水至血液變清，取一側腎臟髓質，用銳利刀片切成 0.5 cm ×0.5 cm ×0.5 cm 大小3塊，取其中1塊放入4%甲醛液中固定后石蠟包埋切片。另2塊腎臟組織用液氮冷藏，用于檢測MDA含量。

①腎髓質中MDA含量的測定 試劑盒購自于南京建成生物工程研究所，按照試劑盒操作說明書進行。

②腎髓質炎癥細胞浸潤和TNF－α表達的檢測 腎髓質炎癥細胞的浸潤用髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)陽性細胞表示，采用免疫組織化學鏈霉親和素生物素標記法進行染色。每組任意取6個不同高倍視野(×40)，用圖像處理軟件Image－Pro Plus 6.0進行半定量分析。Ⅰ抗兔多抗MPO和TNF－α購自武漢博士德公司。操作步驟如下:5 μm石蠟切片脫蠟至水;3%H2O2室溫孵育5－10 min;抗原修復:放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液(工作液)的容器中，并將此容器置于盛有一定數(shù)量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92－98℃起開始計時15 min，然后室溫冷卻30 min，蒸餾水沖洗，PBS沖洗;5% －10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加1∶100 TNF－α 或1∶200 VCAM －1，4 ℃過夜;PBS沖洗，5 min×3次。滴加第2代生物素標記Ⅱ抗工作液，37℃或室溫孵育10－30 min;PBS沖洗，5 min×3次;滴加適當1∶25稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素(PBS稀釋)，37℃孵育10－30 min;PBS沖洗，5 min×3次;顯色劑顯色(DAB或AEC);自來水充分沖洗、復染、封片。

2 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)錄入SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包，依據(jù)正態(tài)檢驗(Kolmogorov－Smirnov)結果分別用均數(shù)±標準差(±s)或四分位數(shù)法表示，依據(jù)正態(tài)檢驗結果用t檢驗或秩和檢驗(Mann－Whitney rank)。

結 果

1 ROSC后動物情況

每組12只動物，所有動物均能致顫成功。Control和UTI組各有9只動物獲得ROSC，6只存活到實驗結束，ROSC后所有動物均需機械維持通氣2－3 h，呼吸、循環(huán)穩(wěn)定后改為自主呼吸。2組動物的生理學參數(shù)(體重、心率、呼吸)和復蘇相關的指標(基礎生命支持時間、除顫次數(shù)、腎上腺素用量)之間沒有顯著差異。

2 ROSC后2組動物尿量、血清BUN及Cr的變化

ROSC后第1個時段2組動物的尿量分別為(11.00 ± 1.73)mL 和(11.05 ±1.72)mL，隨后逐漸下降，至第3或第4個時段時，尿量降至最低，分別為(7.73 ±0.60)mL 和(8.71 ±0.74)mL，隨后逐漸增加。UTI組動物的尿量從ROSC后的第3個時段開始，尿量明顯多于 control組，差異顯著，見表1。

表1 ROSC后各時段2組動物尿量的變化Table 1.Comparison of the urine output between the two groups during every observation stage(mL.±s.n=6)

表1 ROSC后各時段2組動物尿量的變化Table 1.Comparison of the urine output between the two groups during every observation stage(mL.±s.n=6)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group 0－4 h 4－8 h 8－12 h 12－16 h 16－20 h 20－24 h Control 11.00 ±1.73 9.11 ±1.22 7.86 ±0.69 7.73±0.60 8.43 ±0.45 10.57 ±0.62 UTI 11.05 ±1.72 9.88 ±1.00 8.71 ±0.74* 9.12 ±0.37＊＊ 9.75 ±0.38＊＊ 12.12 ±0.54＊＊

ROSC后2組動物血清BUN和Cr水平逐漸升高，至第5或第4時段達到最高水平，BUN為(12.00±0.68)mmol/L 和(10.20 ± 0.30)mmol/L，Cr為(12.00 ±0.68)μmol/L 和(10.20 ±0.30)μmol/L，隨后逐漸下降。UTI組動物從ROSC后第2觀察時段開始，血清BUN和Cr水平均明顯低于Control組，差異顯著，見表2、3。

表2ROSC后2組動物BUN變化Table 2.Comparison of the changes of BUN between the two groups during every observation stage(mmol/L.±s.n=6)

表2ROSC后2組動物BUN變化Table 2.Comparison of the changes of BUN between the two groups during every observation stage(mmol/L.±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h Control 4.81 ±0.94 6.81 ±0.55 8.09 ±1.05 10.47±0.79 12.00 ±0.68 9.78 ±0.44 UTI 4.62 ±0.79 5.40 ±0.80＊＊ 6.81 ±0.84* 9.02 ±0.95* 10.20 ±0.30＊＊ 8.48 ±0.49＊＊

表3 ROSC后2組動物血Cr變化Table 3.Comparison of the changes of serum Cr between the two groups during every observation stage(μmol/L.±s.n=6)

表3 ROSC后2組動物血Cr變化Table 3.Comparison of the changes of serum Cr between the two groups during every observation stage(μmol/L.±s.n=6)

＊P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group 4 h 8 h 12 h 16 h 20 h 24 h Control 39.44 ±4.60 50.59 ±4.51 52.88 ±4.38 59.93 ±2.55 60.45 ±1.85 52.48 ±2.20 UTI 37.16 ±5.15 43.43 ±2.48＊＊ 48.35 ±4.00* 55.23 ±3.98* 53.97 ±1.29＊＊ 47.55 ±2.39＊＊

3 腎髓質炎癥細胞浸潤和TNF－α表達變化

ROSC后24 h腎髓質內出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤，主要在腎小管區(qū)域內，腎小球內相對較少，control組MPO 陽性細胞數(shù)為(7.44 ±0.01)%，UTI組為(5.30 ±0.01)%，2 組之間差異顯著，P ＜0.05，見圖1。腎髓質 TNF－α表達，control組為(67.53±0.06)%，明顯高于 UTI組(59.30±0.06)%，P ＜0.05，見圖2。

4 腎髓質內MDA含量變化

ROSC后24 h腎髓質內含有大量的MDA，control組為(9.53 ±0.49)μmol/g，UTI組為(8.42 ± 0.55)μmol/g，2 組之間差異極顯著，P ＜0.01，見圖3。

Figure 1.Comparison of the MPO －positive cells in kidney medulla between the two groups(immunohistochemical staining，×40).Twenty－four hours after CPR，some MPO－positive cells appeared in kidney medulla，especially around tubule.The percentage of MPO －positive cells in control group was(7.44 ±0.01)%，and higher than that in UTI treatment group(5.30 ±0.01)%.±s.n=6.*P＜0.05 vs control.A:control;B:UTI group.圖1 2組動物腎髓質內MPO陽性細胞浸潤情況

Figure 2.Comparison of the expression of TNF－α in kidney medulla between the two groups(immunohistochemical staining，×40).Twenty－ four hours after CPR，there were overexpression of TNF － α in kidney medulla，(67.53 ±0.06)%in control group and(59.30±0.06)%in UTI group.±s.n=6.*P＜0.05 vs control.A:control;B:UTI group.圖2 2組動物腎髓質內TNF－α表達情況

Figure 3.Comparison of the concentration of MDA in kidney medulla between the two groups.Twenty － four hours after CPR，the concentration of MDA was(9.53 ± 0.49)μmol/g in control group and(8.42 ±0.55)μmol/g in UTI group.±s.n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖3 2組動物腎髓質內MDA含量

討 論

本研究結果表明新西蘭兔心室顫動5 min后進行CPR，ROSC后出現(xiàn)了明顯的腎功能受損，表現(xiàn)為尿量逐漸下降、血清BUN和Cr水平逐步升高。本研究中ROSC后第4或第5觀察時段動物尿量開始增加，同時血清BUN和Cr水平開始下降，表明CPR后這種腎功能損害可能是一過性的，與臨床研究中觀察到的情況相一致［1－3］。盡管CPR后嚴重的進展性腎功能衰竭并不是經(jīng)常發(fā)生、出現(xiàn)持續(xù)的腎功能衰竭也比較少見［3］，但是腎功能的受損還是和預后密切相關，從而表明腎功能受損是反映病情嚴重程度的一個重要指標。本研究結果表明兔室顫5 min，ROSC后給予標準劑量的UTI可減輕CPR后24 h腎髓質內炎癥細胞的浸潤程度、減少TNF－α的表達和降低MDA含量，對CPR后腎損傷具有保護作用。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)CPR后腎髓質內出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤，主要分布在腎小管周圍，與缺血性休克腎損傷中觀察到的景象相一致。心臟驟停其主要病理過程和失血性休克有相似之處:先是缺血缺氧性組織損傷，接著血流的恢復出現(xiàn)再灌注損傷，交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活進一步加重內臟器官如腎臟、腸道等的缺血和損傷［11］。再灌注損傷主要是由氧自由基和炎癥反應引起的［4－6］。自由基作用于腎臟內生物膜中多不飽和脂肪酸，引起鏈式反應(脂質過氧化反應)并產(chǎn)生大量的脂質過氧化物及其降解產(chǎn)物MDA等，這些物質可以造成腎臟組織細胞生物膜的破壞而進一步喪失功能，腎臟功能隨之受損［12］。NF－κB是調節(jié)炎癥反應的樞紐因子，可促進多種炎癥因子的轉錄，如 TNF－α、IL－1等，并且 NF－κB是氧化應激敏感型的轉錄因子［13］，在再灌注期間大量產(chǎn)生的氧自由基可激活NF－κB使TNF－α表達增加，導致組織損傷，最近的研究也進一步證實炎癥反應在復蘇后組織損傷中的重要作用［7］。以上分析表明，再灌注期間氧自由基和炎癥反應損傷兩者相互依賴相互促進。正如本研究中我們觀察到的一樣:CPR后實驗動物腎臟出現(xiàn)了明顯的炎癥細胞浸潤和氧化應激產(chǎn)物MDA的大量增加，這提示減輕CPR后的炎癥反應和氧自由基釋放可能減輕腎臟損傷。

UTI是從人尿中提取的分子量為67 000的糖蛋白，是一種高效廣譜的蛋白酶抑制劑。不僅能抑制胰蛋白酶、α－糜蛋白酶，對彈力蛋白酶和透明質酸酶等也有抑制作用。它可通過結合到酶底物結合部位的競爭性抑制(如透明質酸酶、纖溶酶)以及和底物結合無關的非競爭性抑制(胰蛋白酶)等方式與有多種酶的位點結合，能同時獨立抑制多種酶的活性［13］，因而對全身炎癥反應、多臟器功能衰竭等引起的組織或器官損傷具有保護作用［9］。本研究中UTI組動物ROSC后給予標準劑量UTI 2.5×104U/kg后腎損傷明顯減輕，尿量高于對照組，血Cr、BUN水平低于對照組，腎組織內炎癥細胞數(shù)、TNF－α表達水平和MDA水平均低于對照組，證明UTI通過減輕CPR后腎臟炎癥細胞浸潤、炎癥反應和氧自由基損傷來發(fā)揮腎臟保護作用。以往的研究也證實UTI可抑制中性粒細胞的聚集和活化，減少氧自由基的生成，對移植肺具有保護作用，且呈劑量效應關系［8］，但本研究僅設計了標準劑量1組，CPR后大劑量UTI是否更具有保護作用還需要進一步研究來證實。

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