孟祥艷， 宋立新， 羅玉玉， 董化江， 郭 敏， 梁彥軍， 張文成

(武警醫(yī)學院生理與病理生理學教研室，天津300162)

大鼠源性鋅指蛋白580(zinc finger protein 580，ZFP580)是本組克隆的一種C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子［1－3］。檢索基因表達數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)中有關(guān)ZFP580的相關(guān)信息顯示，ZFP580受多條信號通路的調(diào)控，并通過調(diào)節(jié)靶基因的開關(guān)或轉(zhuǎn)錄水平，參與細胞增殖、分化與凋亡等過程。前期實驗研究中證實ZFP580參與大鼠心肌缺血性損傷的形成［4］，與缺血性心血管疾病的發(fā)生存在密切聯(lián)系。心肌缺血再灌注(ischemia－reperfusion injury，I－R)損傷較可逆性缺血損傷更為嚴重，甚至使其轉(zhuǎn)化為不可逆性損傷。本實驗旨在大鼠心肌I－R損傷模型上觀察ZFP580表達的變化，進一步探討其可能的作用機制，為臨床防治心肌I－R損傷提供新的思路。

材料和方法

1 材料

清潔級雄性Sprague－Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量230－250 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK11－00－000090。ZFP580兔多抗購自北京AVIVA生物工程有限公司，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)兔多抗購自武漢博士德生物工程有限公司。Trizol購自北京鼎國生物工程公司，dNTP、RNasin、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Oligo dT和Taq酶均為大連寶生物工程公司產(chǎn)品。ZFP580上游引物5'－ATA CTCGAG AGGAC CTGGC TCTCC CGG －3'，下游引物5'－CTA CTCGAG TTAGT GCAGG CGCAC GTG －3'，擴增長度為289 bp;內(nèi)參照β－actin上游引物5'－GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA －3'，下游引物5'－CTT CCT TAA TGT CAC GCA CGAT TTC－3'，擴增長度為540 bp，均由北京賽百盛公司合成。腫瘤壞死因子－α(tumor necrosis factor－α，TNF－α)放免試劑盒購于北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司(批號為20090628)，免疫組化試劑盒(SP法)和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉生物有限公司。

2 方法

2.1 動物模型制備及分組 按文獻方法復制I－R模型［5］:SD大鼠經(jīng)烏拉坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉，背位固定于動物手術(shù)臺上。胸部去毛、消毒后，沿胸骨左側(cè)4、5肋間隙開胸，借助心臟跳動之勢，將心臟擠出胸腔，輕撥開左心耳，以5/0滅菌絲線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，30 min后松開結(jié)扎線實現(xiàn)再灌注。從開胸到關(guān)胸時間控制在1 min之內(nèi)，待大鼠恢復自主呼吸，連接皮下肢體導聯(lián)，記錄大鼠心電圖，Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段弓背抬高0.2 mV以上者納入后續(xù)實驗。實驗分為4組:(1)假手術(shù)組(sham組):冠狀動脈下只穿線不結(jié)扎;(2)心肌缺血－再灌注組(I－R組):結(jié)扎冠脈30 min后剪開結(jié)扎線，恢復血供;(3)L－精氨酸(L－Arg)預(yù)處理+心肌缺血－再灌注組(L+I－R組):于缺血前20 min和10 min分2次舌下靜脈給予L－Arg 300 mg/kg，然后重復I－R組操作;(4)左旋精氨酸預(yù)處理+sham組(L+sham組):于手術(shù)前給予L－Arg，方法同上。(2)、(3)組動物分別于I－R后1 h、4 h取材。

2.2 大鼠心肌組織形態(tài)學觀察及中性粒細胞計數(shù) 取大鼠左室游離壁中段心肌組織(去除心尖和心底)，厚約3－5 mm，經(jīng)4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋，制成5 μm厚石蠟切片，進行蘇木精－伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織病變情況。每只動物選取2張切片，在高倍鏡(×400)視野下觀察左室壁缺血區(qū)連續(xù)5個視野，計數(shù)中性粒細胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)數(shù)目，取平均值。

2.3 大鼠血清中TNF－α含量及CK、LDH活性測定 各組動物開胸后自右心室取血，將8－10 mL靜脈血注入試管中，待血液凝固后，4℃ 3 000 r/min離心10 min，吸取上清。采用放免法檢測血清中TNF－α含量，采用全自動生化儀(日立)檢測CK、LDH活性。

2.4 半定量RT－PCR檢測ZFP580 mRNA表達

取大鼠左室游離壁缺血區(qū)心肌組織，用Trizol試劑提取總RNA。取定量總RNA(400 ng)10 μL體系逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。取定量cDNA模板(10 μL)加入靶基因ZFP580上、下游引物，50 μL體系行PCR反應(yīng)。擴增條件為:94℃預(yù)變性2 min;94℃ 45 s，54℃ 45 s，72℃ 50 s;35個循環(huán)后再72℃ 5 min。以β－actin為內(nèi)參照。ZFP580 PCR產(chǎn)物與β－actin的熒光吸光度比作為ZFP580基因的相對表達量。

2.5 心肌免疫組織化學染色 大鼠心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，檸檬酸鹽緩沖液進行抗原熱修復20 min，3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化酶，經(jīng)0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液洗滌后分別加入ZFP580或eNOSⅠ抗(按1∶100稀釋)，后續(xù)步驟按鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶(SP)法染色試劑盒操作說明進行，DAB顯色。eNOS目的切片免疫組織化學染色后經(jīng)蘇木素復染1min，ZFP580目的切片染色后不經(jīng)復染，脫水、透明后中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察大鼠心肌組織中細胞著色情況。每只動物選取2張ZFP580或eNOS免疫組化染色切片，在高倍鏡(×400)視野下選取缺血區(qū)內(nèi)10個無重疊視野，利用Image－Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行目標物質(zhì)的累積吸光度值測定，同時測定左心室游離壁面積，計算出平均吸光度(mean optical density，MOD)，MOD=累積吸光度/左心室壁游離壁面積，從而對目標蛋白表達含量進行半定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 大鼠心肌組織形態(tài)學改變

HE染色結(jié)果顯示假手術(shù)組心肌纖維排列整齊，細胞邊界完整，心肌橫紋清晰。再灌注后1 h，心肌細胞腫脹，橫紋消失，部分心肌細胞嗜伊紅性增強，心肌細胞周圍有PMN積聚，主要位于心內(nèi)膜和肌層。再灌注后4 h，PMN數(shù)目明顯增加，且在心外膜可見明顯的PMN浸潤(如箭頭所示)。L－Arg預(yù)處理能減輕以PMN為主的炎細胞的積聚，心肌細胞損傷程度減輕，見圖1、表1。

2 大鼠血清中TNF－α含量及CK、LDH活性的變化

大鼠心肌再灌注后，血清TNF－α含量及CK、LDH活性明顯升高，且隨再灌注時間的延長而進一步升高。應(yīng)用L－Arg預(yù)處理后，血清TNF－α含量及CK、LDH活性較相應(yīng)時點的I－R組明顯降低，見表1，但對假手術(shù)組無明顯影響。

Figure 1.The morphological changes of cardiac tissues(×200).The ischemic regions of the left ventricle were isolated and the heart slices were stained by hematoxylin－eosin(HE).Arrows indicate the polymorphonuclear neutrophil(PMN)accumulation in the epicardium and blood vessel.A:sham group;B:L+sham group;C:I－R 1 h group;D:L+I－R 1 h group;E:I－R 4 h group;F:L+I－R 4 h group.I－R:ischemiareperfusion;L:L－arginine.圖1 心肌組織形態(tài)學改變

表1 各組大鼠血清中TNF－α含量、CK和LDH活性及心肌組織中中性粒細胞計數(shù)結(jié)果Table 1.The concentration of TNF－α and the activity of CK and LDH in the serum and PMN count in cardiac tissue of rats in different groups(±s.n=8)

表1 各組大鼠血清中TNF－α含量、CK和LDH活性及心肌組織中中性粒細胞計數(shù)結(jié)果Table 1.The concentration of TNF－α and the activity of CK and LDH in the serum and PMN count in cardiac tissue of rats in different groups(±s.n=8)

*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs I－R group.I－R:ischemia－reperfusion;L:L－arginine.

Sham 1.19±0.09 850.00±184.26 360.00±56.78 12.33 ±2.16 L+sham 1.17 ±0.14 670.00±157.49 283.00 ±53.26 15.33 ±2.34 I－R 1 h 1.51±0.05* 2 165.00±233.15* 1 134.00±103.79 35.83±2.79*L+I－R 1 h 1.23±0.10△ 1 430.00±209.68△ 897.00±75.96 23.55±2.43△I－R 4 h 1.64±0.14* 2 930.00±211.53* 1 569.00±112.58 57.52±4.23*L+I－R 4 h 1.29±0.12△ 2 467.00±212.74△ 1 129.00±98.67 43.33±3.08△

3 大鼠心肌組織中ZFP580 mRNA表達

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于289 bp和540 bp處分別可見清晰的ZFP580及內(nèi)參照β－actin的擴增條帶。各組內(nèi)參照β－actin的條帶濃淡大致相仿，ZFP580在I－R后1 h、4 h表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。L－Arg預(yù)處理后，較相應(yīng)時點的 I－R組ZFP580 mRNA表達有所回升，L－Arg對假手術(shù)組大鼠心肌中ZFP580 mRNA表達無明顯影響，見圖2。

Figure 2.The level of ZFP580 mRNA expression in the heart was analyzed by semi－quantitative RT－PCR.The SD rats were subjected to left coronary artery occlusion for 30 min and followed by 1 h or 4 h reperfusion with or without L－argine preconditioning.In every group，the ischemic regions of the left ventricle were isolated and totle RNA was extracted and analyzed by RT－PCR.±s.n=8.*P＜0.05 vs sham group;△P＜0.05 vs I－R group.I－R:ischemia－reperfusion;L:L－arginine.圖2 各組大鼠心肌組織中ZFP580 mRNA的表達水平

4 大鼠心肌組織中ZFP580及eNOS蛋白的表達

大鼠心肌組織切片經(jīng)免疫組化染色后，ZFP580表達陽性細胞在心肌細胞核內(nèi)可見黃色或棕黃色顆粒，eNOS在心肌細胞內(nèi)成片表達，呈棕褐色。I－R后心肌組織中ZFP580、eNOS蛋白的表達明顯下調(diào)，并且隨著再灌注時間的延長表達進一步降低，應(yīng)用L－Arg預(yù)處理后可以明顯增強ZFP580及eNOS蛋白的表達。L－Arg對假手術(shù)大鼠心肌中ZFP580表達無明顯影響，但明顯增強eNOS蛋白的表達，見圖3。

Figure 3.Immunohistochemical analyses of ZFP580 and eNOS protein expression in cardiac tissues of rats in different groups(×200).Photomicrographs showed immunohistochemical staining of the ischemic regions of the left ventricle and sham－operation ventricle.*P ＜0.05 vs sham group;△P ＜0.05 vs I－ R group.A:sham group;B:L+sham group;C:I－ R 1 h group;D:L+I－R 1 h group;E:I－R 4 h group;F:L+I－R 4 h group.I－R:ischemia－reperfusion;L:L－arginine;MOD:mean optical density.圖3 心肌組織中ZFP580和eNOS的免疫組織化學染色結(jié)果

討 論

隨著溶栓、冠脈搭橋術(shù)和心臟移植術(shù)等治療方法的開展，心肌I－R損傷及其發(fā)生機制備受關(guān)注，目前認為大量中性粒細胞的聚集、活化后的炎癥效應(yīng)和氧自由基大量生成是造成心肌細胞損害的重要機制之一［6，7］。TNF－ α 是引起心肌 I－R 損傷的主要炎性介質(zhì)之一，可直接造成心肌的收縮功能下降，降低血壓以及誘導心肌細胞的凋亡或壞死等，而減少或抑制TNF－α的生成后能明顯減少心肌梗死面積，對心肌具有保護作用［8］。

本組在先前的工作中獲得了一個人類心血管疾病相關(guān)新基因 ZNF580(GenBank注冊號:AF184939)，并隨后獲得了鼠源性同源基因ZFP580的開放閱讀框全長cDNA序列及其表達的蛋白，經(jīng)BLAST方式與人ZNF580進行同源性比較分析，二者同源性達92%［3］。在前期對于ZFP580/ZNF580基因功能研究的實驗中發(fā)現(xiàn)，其羧基端3個C2H2型鋅指主構(gòu)域94－172位氨基酸區(qū)間含有核定位信號，編碼一種具有調(diào)控作用的C2H2型鋅指核轉(zhuǎn)錄因子，可能對細胞增殖、分化及相關(guān)基因的表達起著十分重要的調(diào)控作用［9］。檢索GEO中相關(guān)信息得知:炎癥因子TNF－α可使人ZNF580表達下調(diào)［10］，提示二者間可能存在某種聯(lián)系。本實驗中發(fā)現(xiàn)，I－R后以中性粒細胞為主的大量炎細胞在心肌組織中積聚，血清CK、LDH活性及TNF－α水平明顯升高，且二者變化均以再灌注后4h更為明顯。在大鼠心肌I－R損傷后，ZFP580無論在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平均表達降低，推測ZFP580的表達下調(diào)可能參與了心肌I－R損傷的形成。ZFP580的表達下調(diào)在再灌注4 h后較為明顯，與血清TNF－α含量及CK、LDH活性升高在時間上吻合，可見ZFP580與TNF－α表達及心肌細胞損傷程度間可能存在某種聯(lián)系，推測在TNF－α介導的心肌細胞損傷過程中，ZFP580可能作為其中的一個環(huán)節(jié)發(fā)揮了某種作用，例如影響了某些心肌細胞保護性蛋白的表達等。

L－精氨酸(L－arginine，L－Arg)是細胞內(nèi)合成一氧化氮(nitric oxide，NO)的前體物質(zhì)，大量實驗證實，L－Arg通過促進NO的產(chǎn)生和釋放，改善微循環(huán)，減輕細胞膜脂質(zhì)過氧化損傷，阻止中性粒細胞的大量聚集，從而對缺血后再灌注心肌發(fā)揮細胞保護作用［11］。eNOS是心肌細胞中產(chǎn)生NO的關(guān)鍵酶，在心肌細胞缺血損傷初期，eNOS可被磷脂酰肌醇－3激酶(PI3K)和有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族酶激活，并通過增加第二信使NO的產(chǎn)生介導一系列心肌細胞內(nèi)源性保護作用［12，13］。本實驗中發(fā)現(xiàn):L－Arg預(yù)處理能明顯降低血清CK、LDH活性及TNF－α水平，減少中性粒細胞在心肌組織的積聚，減輕心肌I－R損傷，同時伴隨鋅指核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580及eNOS的表達明顯上調(diào)?？梢奪FP580及eNOS的表達上調(diào)可能是L－Arg預(yù)處理誘發(fā)的心肌細胞內(nèi)源性保護機制之一，然而核轉(zhuǎn)錄因子ZFP580是否受到eNOS/NO信號途徑的調(diào)節(jié)仍值得探討，其表達上調(diào)后如何發(fā)揮細胞保護作用即其參與細胞內(nèi)源性保護的具體機制仍需進一步研究。

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