武 鈞， 李建芳， 瞿 穎， 陳雪華， 湯耀卿△

(1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院SICU，2上海市消化外科研究所，上海200025)

自 Asahara等［1］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)以來(lái)，EPCs成為新生血管生成研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)，其在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)方面有廣闊的應(yīng)用前景。分離和體外穩(wěn)定培養(yǎng)EPCs，了解其分化的生物學(xué)特性是進(jìn)行相關(guān)機(jī)制和應(yīng)用研究的基礎(chǔ)［2］。已有較多人源EPCs培養(yǎng)和分化特征的研究，而小鼠EPCs體外培養(yǎng)及分化特性的研究較少，本研究旨在探索小鼠骨髓來(lái)源EPCs的培養(yǎng)方法，詳細(xì)觀察其體外分化特征，為相關(guān)深入研究奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康雄性BALB/c小鼠(8－12周，16－25g)購(gòu)自上海BK實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 主要試劑 vWF單克隆抗體和FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG購(gòu)自Abcam;CD31和VE－cadherin單克隆抗體購(gòu)自BD Biosciences;EGM－2培養(yǎng)液和EGM SingleQuot購(gòu)自Clonetics;流式細(xì)胞技術(shù)所需熒光標(biāo)記的單克隆抗體及同型對(duì)照均購(gòu)自eBioscience;特級(jí)胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自Hyclone;DiI標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?DiI－acLDL)購(gòu)自Molecular Probes;內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)多克隆抗體、大鼠IgG和兔IgG購(gòu)自Santa Cruz;生長(zhǎng)因子及其它實(shí)驗(yàn)中所需試劑均購(gòu)自Sigma。

2 方法

2.1 小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠，嚴(yán)格無(wú)菌狀態(tài)下分離股骨和脛骨，用含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)液反復(fù)輕柔沖洗骨髓腔，收集單細(xì)胞懸液，用Histopaque－1083并采用梯度離心法收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞，用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力鑒定。將細(xì)胞以2×106cells/well接種于預(yù)先包被纖維結(jié)合蛋白的6孔板內(nèi)，加入EGM －2 完全培養(yǎng)液，于37°C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后棄貼壁細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，4 d后棄懸浮細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，以后每2 d更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%呈融合狀態(tài)時(shí)，每孔加入1 mL 0.25%胰酶，于37°C下消化并收集細(xì)胞，1∶2比例接種于培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 分別于培養(yǎng)前、培養(yǎng)4 d、7 d、10 d、14 d用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞表面或胞漿抗原進(jìn)行檢測(cè)，主要檢測(cè)CD133、CD117、干細(xì)胞抗原－1(stem cell antigen 1，SCA －1)、CD31、vWF、eNOS、VE－cadherin、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體－2(vascular endothelial growth factor receptor－2，VEGFR －2)以及CD45。

2.3 免疫熒光檢測(cè) 培養(yǎng)7 d時(shí)，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞 CD133、CD117、SCA － 1、CD31、vWF、eNOS、VE－cadherin和VEGFR－2的表達(dá)狀況。

2.4 吞噬acLDL和結(jié)合荊豆凝集素(Ulex europaeus agglutinin I，UEA－I)能力檢測(cè)

①免疫熒光檢測(cè) 在培養(yǎng)液中以2.5 mg/L加入DiI－acLDL，培養(yǎng) 4 h后沖洗去除未吞噬的 DiI－acLDL，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后以1∶20加入FITCUEA－I，室溫下孵育1 h，洗滌后DAPI復(fù)染細(xì)胞核。DiI－acLDL被吞噬后使胞漿呈紅色，F(xiàn)ITC－UEA－I結(jié)合到細(xì)胞使胞膜呈綠色，雙陽(yáng)性細(xì)胞為2種顏色的重疊，在熒光纖維鏡下呈橙黃色。

②流式細(xì)胞檢測(cè) 在培養(yǎng)液中以2.5 mg/L加入DiI－acLDL，培養(yǎng)4 h后PBS洗滌以去除未吞噬的DiI－acLDL，胰酶消化并收集細(xì)胞，PBS洗滌后以1∶20加入FITC－UEA－I，室溫孵育1 h，PBS洗滌后2%多聚甲醛固定細(xì)胞并上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

2.5 EPCs增殖和遷移能力檢測(cè) 培養(yǎng)7 d后，分別采用MTT和Transwell方法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞在不同濃度VEGF下的增殖和遷移能力進(jìn)行檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 骨髓來(lái)源EPCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)和生長(zhǎng)狀況

細(xì)胞培養(yǎng)2 d后細(xì)胞開始變大和不規(guī)則，細(xì)胞核分裂相增多，并開始貼壁生長(zhǎng)。3 d后可見快速分裂的細(xì)胞形成小的集落(圖1A)，中間為圓形細(xì)胞，邊緣少量細(xì)胞伸展呈梭形，此時(shí)的克隆樣生長(zhǎng)還不太明顯，細(xì)胞體積小，伸展不是很完全，貼壁細(xì)胞多為梭形或橢圓形，部分呈線樣生長(zhǎng)(圖1B)，其間混有少量紡錘形細(xì)胞，這類細(xì)胞增殖能力低，培養(yǎng)過(guò)程中其數(shù)量基本保持不變。第7 d，貼壁細(xì)胞形成的集落明顯增多(圖1C)，集落多由幾十個(gè)或上百個(gè)細(xì)胞組成，集落內(nèi)細(xì)胞開始向外放射狀生長(zhǎng)，形成典型的放射狀集落(圖1D)。10 d左右細(xì)胞基本融合，呈片狀生長(zhǎng)(圖1E)，部分細(xì)胞首尾相連形成內(nèi)皮細(xì)胞特異性索條狀結(jié)構(gòu)(圖1F)。14 d左右，細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板底部，單層細(xì)胞呈多角形融合成片狀，形成典型的鋪路石樣外觀(圖1G)。將7 d形成克隆的細(xì)胞重新接種，7 d后形成具有快速增殖潛能的放射狀集落(圖1H)，這些細(xì)胞形成的集落明顯大于早期形成的集落，常由上千個(gè)細(xì)胞組成，其增殖速度明顯快于早期集落形成細(xì)胞。

2 培養(yǎng)分化中的EPCs表型特征的變化

培養(yǎng)7 d后，免疫熒光染色顯示細(xì)胞膜CD133、SCA －1、CD117、VEGFR －2、CD31、VE － cadherin 及胞漿eNOS、vWF均為陽(yáng)性，見圖2。

Figure 1.Morphology of bone marrow mononuclear cells cultured in EGM －2 medium.After 4 d，mononuclear cells formed small colonies(A，×100)and grew in line(B，×100).After 7 d，cultur cells formed typical colonies(C，×40)，the colonies consist of a central cluster of round cells surrounded by radiating，thin and flat cells(D，×100).Cultured cells had high proliferation capacity(E，×40)and formed cord－like structure(F，×100).Cultured cells displayed endothelial cobblestone appearance at day 14(G，×100).Colony cells were re－plated at day 7.Adherent cells formed colonies with high proliferation capacity after 7 d(H，×100).圖1 骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)形態(tài)學(xué)變化

Figure 2.Immunofluorescence identification of EPCs markers after 7 d of culture.圖2 免疫熒光檢測(cè)分化中EPCs表面及胞漿抗原表達(dá)情況

流式分析顯示(圖3)，新分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD133、SCA－1、CD117的表達(dá)率分別為0.16%、2.94%、1.26%，而4 d后貼壁細(xì)胞的表達(dá)分別達(dá)到11.05%、29.32%及16.45%，此后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)三者的表達(dá)率逐漸下降，至14 d其分別下降至2.29%、7.82%和3.92%;而細(xì)胞表面VEGFR－2、CD31、VE－cadherin及胞漿 eNOS、vWF在新分離細(xì)胞中的表達(dá)率分別為 0.24%、0.13%、1.55%、0.05%和0.61%，4 d后其表達(dá)明顯增加，分別達(dá)到12.21%、8.43%、18.27%、7.11%和 32.61%，此后其表達(dá)逐步增加，至14 d其表達(dá)率分別達(dá)到62.13%、32.96%、67.73%、27.89%和82.16%。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，白細(xì)胞通用抗原CD45的表達(dá)不斷下降，培養(yǎng)前其表達(dá)率為54.19%，而培養(yǎng)14 d后其表達(dá)率僅為8.15%。

3 EPCs吞噬acLDL和結(jié)合UEA－I能力的變化

免疫熒光顯示培養(yǎng)7 d后細(xì)胞可吞噬低密度脂蛋白及結(jié)合植物凝集素(圖4A)，培養(yǎng)4 d后雙陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到57.18%，而14 d后為86.70%(圖4B)，此后雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定。

Figure 3.Time course of the expression of CD133，SCA －1，CD117，VEGFR －2，CD31，VE －cadherin，eNOS，vWF and CD45 by FACS analysis in bone marrow mononuclear cells.圖3 培養(yǎng)細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)狀況的動(dòng)態(tài)變化

Figure 4.The ability of uptaking acLDL and binding UEA－I in EPCs.A:immunofluorescence identification showed EPCs uptaking DiI－acLDL and binding FITC－UEA－I after 7 d of culture(×200);B:time course of EPCs uptaking DiI－acLDL and binding FITC－UEA－I analyzed by FACS.圖4 培養(yǎng)細(xì)胞吞噬DiI－acLDL及結(jié)合FITC－UEA－I能力的變化

4 EPCs增殖和遷移能力的變化

通過(guò)在培養(yǎng)液中加入不同濃度VEGF，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 μg/L的 VEGF即可明顯促進(jìn) EPCs的增殖(圖5A)，隨著VEGF的濃度增加，其增殖能力不同程度提高，80 μg/L VEGF可提高其增殖率約58%。隨著VEGF濃度增加，其對(duì)EPCs的遷移和趨化作用明顯增強(qiáng)(圖5B)。

Figure 5.Effects of VEGF on EPCs proliferation and migration capacities.A:effects of VEGF on EPCs proliferation rate.*P ＜0.05 vs 0 μg/L and 5 μg/L group;△P ＜0.05 vs other groups.B:effects of VEGF on EPCs migration capacity.*P ＜0.05 vs 0 μg/L group;△P ＜0.05 vs 0 μg/L，5 μg/L and 10 μg/L group;#P ＜0.05 vs other groups.圖6 VEGF對(duì)EPCs增殖及遷移能力的影響

討 論

骨髓單個(gè)核細(xì)胞是多種細(xì)胞的混合群，EPCs本身缺乏特異性表面標(biāo)志物［3］，所以到目前為止，沒(méi)有一種簡(jiǎn)單、明確的EPCs分離方法，目前報(bào)道的EPCs分離方法主要有免疫磁珠法和差時(shí)貼壁法。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)條件摸索過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)免疫磁珠分離的小鼠骨髓CD117+細(xì)胞生長(zhǎng)并不令人滿意，培養(yǎng)2周所得細(xì)胞數(shù)量有限，這可能與分離過(guò)程中磁性微粒對(duì)細(xì)胞代謝功能產(chǎn)生的影響有關(guān)。Asahara在EPCs體外培養(yǎng)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)MNCCD34+(CD34+的單個(gè)核細(xì)胞)與MNCCD34－(CD34－的單個(gè)核細(xì)胞)混合培養(yǎng)可以比MNCCD34+單獨(dú)培養(yǎng)獲得更多的EPCs［1］，這表明不同細(xì)胞系間相互作用或產(chǎn)生的可溶性因子對(duì)于EPCs的增殖分化起著重要作用，作為滋養(yǎng)細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等在體外培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)EPCs分化起輔助作用。本研究中利用EPCs貼壁緩慢的特點(diǎn)，采用差時(shí)貼壁法去除貼壁能力強(qiáng)的基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及不貼壁的造血細(xì)胞，結(jié)合纖維連接蛋白的促黏附作用，可獲得較多數(shù)量和較高純度的EPCs，培養(yǎng)7－14 d所得細(xì)胞數(shù)可達(dá)到進(jìn)一步研究的需要。

EPCs培養(yǎng)需要特殊的培養(yǎng)基，目前研究多采用內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如DMEM、MEM、M199等，添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，如VEGF、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子－1(insulin－like growth factor 1，IGF－1)等。目前尚未有一種標(biāo)準(zhǔn)成熟的EPCs培養(yǎng)方法，生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)基中的濃度也各不相同［4］。對(duì)于小鼠骨髓來(lái)源EPCs的培養(yǎng)目前報(bào)道的方法較少，我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中采用EGM－2培養(yǎng)基，同時(shí)加入包含各種生長(zhǎng)因子(EGF、VEGF、bFGF 和 IGF －1)的 SingleQuot，但是發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)效果并不滿意。經(jīng)過(guò)嘗試，我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液臨用前適當(dāng)加入 VEGF、EGF、bFGF(均為10 μg/L)可獲得滿意的培養(yǎng)效果，同時(shí)選擇優(yōu)質(zhì)FBS對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)也非常重要。這說(shuō)明小鼠骨髓來(lái)源EPCs培養(yǎng)條件要求比較高，采用EGM－2培養(yǎng)基并加入適當(dāng)濃度、活性正常的生長(zhǎng)因子可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)小鼠EPCs。

自培養(yǎng)的第4 d開始，細(xì)胞開始呈現(xiàn)集落生長(zhǎng)，這與文獻(xiàn)報(bào)道的胚胎時(shí)期“血島”樣簇狀生長(zhǎng)相類似［5］。隨后細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞相互之間逐漸交聯(lián)，有些細(xì)胞首尾相連呈線狀生長(zhǎng)，提示EPCs可排列成管狀，最終形成血管。培養(yǎng)至10－14 d，貼壁細(xì)胞基本融合，細(xì)胞呈現(xiàn)典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)－鵝卵石狀。第4 d，在棄去懸浮細(xì)胞后，貼壁細(xì)胞SCA－1、CD117及CD133的表達(dá)明顯增加，這與差時(shí)貼壁及纖維連接蛋白對(duì)EPCs的篩選效應(yīng)有關(guān)，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)率逐漸下降，同時(shí)白細(xì)胞通用抗原CD45的表達(dá)逐步降低，而內(nèi)皮特異性抗原標(biāo)志VEGFR －2、CD31、VE －cadherin、vWF 及 eNOS表達(dá)逐漸增加，這表明體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的EPCs在逐步失去干細(xì)胞特性并向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。

小鼠SCA－1屬于Ly－6多基因家族，其主要表達(dá)于造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞［6］。CD117又稱 c－Kit，是具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)分子，是干細(xì)胞因子的受體，在早期分化的造血干/祖細(xì)胞表面均有表達(dá)，轉(zhuǎn)導(dǎo)了造血干/祖細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的所需信號(hào)，CD117+細(xì)胞為一群包括了不同分化階段干/祖細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞［7］，結(jié)合SCA－1可將細(xì)胞進(jìn)一步分為兩個(gè)亞類:CD117+/SCA－1+和 CD117－/SCA－1+細(xì)胞。前者在多種造血生長(zhǎng)因子聯(lián)合刺激后，表現(xiàn)出極強(qiáng)的增殖能力，為相對(duì)早期的造血干細(xì)胞，不含定向祖細(xì)胞，c－Kit+/SCA－1+細(xì)胞在VEGF等內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用下，可以分化成內(nèi)皮細(xì)胞，說(shuō)明EPCs來(lái)源于 CD117+/SCA －1+細(xì)胞［8］。CD133 是早期造血干/祖細(xì)胞的標(biāo)志［9］，目前對(duì)其功能還不十分了解，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為人CD34+/CD133+/VEGFR－2+細(xì)胞為早期的EPCs，隨著EPCs逐步分化CD133很快消失，而對(duì)于小鼠CD117+/SCA－1+/CD133+/VEGFR－2+細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是早期的EPCs。

研究中無(wú)論是從形態(tài)學(xué)還是表型特征變化都展示了EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的特征，但是到目前為止仍無(wú)法知道EPCs何時(shí)完全失去祖細(xì)胞特征而分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)細(xì)胞雖然干細(xì)胞表型表達(dá)在逐步減少，但EPCs的另一重要特性，吞噬acLDL及結(jié)合內(nèi)皮特異性凝集素UEA－I的能力，在培養(yǎng)過(guò)程卻無(wú)明顯丟失，傳代接種后仍然有很強(qiáng)的集落形成和快速增殖能力，這表明所培養(yǎng)細(xì)胞是介于干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間，具有高分化潛能且處于不同分化階段內(nèi)皮前體細(xì)胞群的混合體。

VEGF是新生血管生成的主要誘導(dǎo)因子［10］，也是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞系分化的重要誘導(dǎo)因子，可以動(dòng)員骨髓內(nèi)EPCs進(jìn)入循環(huán)，并趨化其到達(dá)內(nèi)皮損傷部位，促進(jìn)其分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，參與受損內(nèi)皮的修復(fù)［11］。實(shí)驗(yàn)中可以看到VEGF是小鼠EPCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)不可或缺的重要因子，其可對(duì)離體EPCs的增殖和遷移特性產(chǎn)生劑量依賴性的促進(jìn)作用，另外在體研究也表明VEGF對(duì)EPCs的動(dòng)員和趨化及新生血管形成產(chǎn)生劑量依賴性促進(jìn)作用［12］。

通過(guò)本研究表明，采用差時(shí)貼壁法及EGM－2內(nèi)皮培養(yǎng)基，加入適當(dāng)生長(zhǎng)因子，在體外可以穩(wěn)定培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源EPCs。體外培養(yǎng)的EPCs逐步向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化，其干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)逐步減少，而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)不斷增加。VEGF是EPCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的重要生長(zhǎng)因子，可對(duì)其產(chǎn)生明顯的促增殖和遷移效應(yīng)。

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