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        小鼠骨髓來(lái)源內(nèi)皮祖細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)及分化特征*

        2011-01-30 03:58:08李建芳陳雪華湯耀卿
        中國(guó)病理生理雜志 2011年6期
        關(guān)鍵詞:祖細(xì)胞貼壁培養(yǎng)液

        武 鈞, 李建芳, 瞿 穎, 陳雪華, 湯耀卿△

        (1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院SICU,2上海市消化外科研究所,上海200025)

        自 Asahara等[1]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)以來(lái),EPCs成為新生血管生成研究領(lǐng)域的焦點(diǎn),其在血管內(nèi)皮損傷修復(fù)方面有廣闊的應(yīng)用前景。分離和體外穩(wěn)定培養(yǎng)EPCs,了解其分化的生物學(xué)特性是進(jìn)行相關(guān)機(jī)制和應(yīng)用研究的基礎(chǔ)[2]。已有較多人源EPCs培養(yǎng)和分化特征的研究,而小鼠EPCs體外培養(yǎng)及分化特性的研究較少,本研究旨在探索小鼠骨髓來(lái)源EPCs的培養(yǎng)方法,詳細(xì)觀察其體外分化特征,為相關(guān)深入研究奠定基礎(chǔ)。

        材料和方法

        1 材料

        1.1 動(dòng)物 健康雄性BALB/c小鼠(8-12周,16-25g)購(gòu)自上海BK實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

        1.2 主要試劑 vWF單克隆抗體和FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG購(gòu)自Abcam;CD31和VE-cadherin單克隆抗體購(gòu)自BD Biosciences;EGM-2培養(yǎng)液和EGM SingleQuot購(gòu)自Clonetics;流式細(xì)胞技術(shù)所需熒光標(biāo)記的單克隆抗體及同型對(duì)照均購(gòu)自eBioscience;特級(jí)胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)自Hyclone;DiI標(biāo)記的乙?;兔芏戎鞍?DiI-acLDL)購(gòu)自Molecular Probes;內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)多克隆抗體、大鼠IgG和兔IgG購(gòu)自Santa Cruz;生長(zhǎng)因子及其它實(shí)驗(yàn)中所需試劑均購(gòu)自Sigma。

        2 方法

        2.1 小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 頸椎脫臼法處死小鼠,嚴(yán)格無(wú)菌狀態(tài)下分離股骨和脛骨,用含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液反復(fù)輕柔沖洗骨髓腔,收集單細(xì)胞懸液,用Histopaque-1083并采用梯度離心法收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞,用0.2%臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力鑒定。將細(xì)胞以2×106cells/well接種于預(yù)先包被纖維結(jié)合蛋白的6孔板內(nèi),加入EGM -2 完全培養(yǎng)液,于37°C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24 h后棄貼壁細(xì)胞并繼續(xù)培養(yǎng)懸浮細(xì)胞,4 d后棄懸浮細(xì)胞,繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞,以后每2 d更換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%呈融合狀態(tài)時(shí),每孔加入1 mL 0.25%胰酶,于37°C下消化并收集細(xì)胞,1∶2比例接種于培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

        2.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 分別于培養(yǎng)前、培養(yǎng)4 d、7 d、10 d、14 d用流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)細(xì)胞表面或胞漿抗原進(jìn)行檢測(cè),主要檢測(cè)CD133、CD117、干細(xì)胞抗原-1(stem cell antigen 1,SCA -1)、CD31、vWF、eNOS、VE-cadherin、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2,VEGFR -2)以及CD45。

        2.3 免疫熒光檢測(cè) 培養(yǎng)7 d時(shí),通過(guò)免疫熒光檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞 CD133、CD117、SCA - 1、CD31、vWF、eNOS、VE-cadherin和VEGFR-2的表達(dá)狀況。

        2.4 吞噬acLDL和結(jié)合荊豆凝集素(Ulex europaeus agglutinin I,UEA-I)能力檢測(cè)

        ①免疫熒光檢測(cè) 在培養(yǎng)液中以2.5 mg/L加入DiI-acLDL,培養(yǎng) 4 h后沖洗去除未吞噬的 DiI-acLDL,4%多聚甲醛固定細(xì)胞后以1∶20加入FITCUEA-I,室溫下孵育1 h,洗滌后DAPI復(fù)染細(xì)胞核。DiI-acLDL被吞噬后使胞漿呈紅色,F(xiàn)ITC-UEA-I結(jié)合到細(xì)胞使胞膜呈綠色,雙陽(yáng)性細(xì)胞為2種顏色的重疊,在熒光纖維鏡下呈橙黃色。

        ②流式細(xì)胞檢測(cè) 在培養(yǎng)液中以2.5 mg/L加入DiI-acLDL,培養(yǎng)4 h后PBS洗滌以去除未吞噬的DiI-acLDL,胰酶消化并收集細(xì)胞,PBS洗滌后以1∶20加入FITC-UEA-I,室溫孵育1 h,PBS洗滌后2%多聚甲醛固定細(xì)胞并上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)。

        2.5 EPCs增殖和遷移能力檢測(cè) 培養(yǎng)7 d后,分別采用MTT和Transwell方法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞在不同濃度VEGF下的增殖和遷移能力進(jìn)行檢測(cè)。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié) 果

        1 骨髓來(lái)源EPCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)和生長(zhǎng)狀況

        細(xì)胞培養(yǎng)2 d后細(xì)胞開(kāi)始變大和不規(guī)則,細(xì)胞核分裂相增多,并開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)。3 d后可見(jiàn)快速分裂的細(xì)胞形成小的集落(圖1A),中間為圓形細(xì)胞,邊緣少量細(xì)胞伸展呈梭形,此時(shí)的克隆樣生長(zhǎng)還不太明顯,細(xì)胞體積小,伸展不是很完全,貼壁細(xì)胞多為梭形或橢圓形,部分呈線樣生長(zhǎng)(圖1B),其間混有少量紡錘形細(xì)胞,這類細(xì)胞增殖能力低,培養(yǎng)過(guò)程中其數(shù)量基本保持不變。第7 d,貼壁細(xì)胞形成的集落明顯增多(圖1C),集落多由幾十個(gè)或上百個(gè)細(xì)胞組成,集落內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始向外放射狀生長(zhǎng),形成典型的放射狀集落(圖1D)。10 d左右細(xì)胞基本融合,呈片狀生長(zhǎng)(圖1E),部分細(xì)胞首尾相連形成內(nèi)皮細(xì)胞特異性索條狀結(jié)構(gòu)(圖1F)。14 d左右,細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板底部,單層細(xì)胞呈多角形融合成片狀,形成典型的鋪路石樣外觀(圖1G)。將7 d形成克隆的細(xì)胞重新接種,7 d后形成具有快速增殖潛能的放射狀集落(圖1H),這些細(xì)胞形成的集落明顯大于早期形成的集落,常由上千個(gè)細(xì)胞組成,其增殖速度明顯快于早期集落形成細(xì)胞。

        2 培養(yǎng)分化中的EPCs表型特征的變化

        培養(yǎng)7 d后,免疫熒光染色顯示細(xì)胞膜CD133、SCA -1、CD117、VEGFR -2、CD31、VE - cadherin 及胞漿eNOS、vWF均為陽(yáng)性,見(jiàn)圖2。

        Figure 1.Morphology of bone marrow mononuclear cells cultured in EGM -2 medium.After 4 d,mononuclear cells formed small colonies(A,×100)and grew in line(B,×100).After 7 d,cultur cells formed typical colonies(C,×40),the colonies consist of a central cluster of round cells surrounded by radiating,thin and flat cells(D,×100).Cultured cells had high proliferation capacity(E,×40)and formed cord-like structure(F,×100).Cultured cells displayed endothelial cobblestone appearance at day 14(G,×100).Colony cells were re-plated at day 7.Adherent cells formed colonies with high proliferation capacity after 7 d(H,×100).圖1 骨髓來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)形態(tài)學(xué)變化

        Figure 2.Immunofluorescence identification of EPCs markers after 7 d of culture.圖2 免疫熒光檢測(cè)分化中EPCs表面及胞漿抗原表達(dá)情況

        流式分析顯示(圖3),新分離的骨髓單個(gè)核細(xì)胞CD133、SCA-1、CD117的表達(dá)率分別為0.16%、2.94%、1.26%,而4 d后貼壁細(xì)胞的表達(dá)分別達(dá)到11.05%、29.32%及16.45%,此后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)三者的表達(dá)率逐漸下降,至14 d其分別下降至2.29%、7.82%和3.92%;而細(xì)胞表面VEGFR-2、CD31、VE-cadherin及胞漿 eNOS、vWF在新分離細(xì)胞中的表達(dá)率分別為 0.24%、0.13%、1.55%、0.05%和0.61%,4 d后其表達(dá)明顯增加,分別達(dá)到12.21%、8.43%、18.27%、7.11%和 32.61%,此后其表達(dá)逐步增加,至14 d其表達(dá)率分別達(dá)到62.13%、32.96%、67.73%、27.89%和82.16%。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),白細(xì)胞通用抗原CD45的表達(dá)不斷下降,培養(yǎng)前其表達(dá)率為54.19%,而培養(yǎng)14 d后其表達(dá)率僅為8.15%。

        3 EPCs吞噬acLDL和結(jié)合UEA-I能力的變化

        免疫熒光顯示培養(yǎng)7 d后細(xì)胞可吞噬低密度脂蛋白及結(jié)合植物凝集素(圖4A),培養(yǎng)4 d后雙陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)到57.18%,而14 d后為86.70%(圖4B),此后雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量保持相對(duì)穩(wěn)定。

        Figure 3.Time course of the expression of CD133,SCA -1,CD117,VEGFR -2,CD31,VE -cadherin,eNOS,vWF and CD45 by FACS analysis in bone marrow mononuclear cells.圖3 培養(yǎng)細(xì)胞表型標(biāo)志物表達(dá)狀況的動(dòng)態(tài)變化

        Figure 4.The ability of uptaking acLDL and binding UEA-I in EPCs.A:immunofluorescence identification showed EPCs uptaking DiI-acLDL and binding FITC-UEA-I after 7 d of culture(×200);B:time course of EPCs uptaking DiI-acLDL and binding FITC-UEA-I analyzed by FACS.圖4 培養(yǎng)細(xì)胞吞噬DiI-acLDL及結(jié)合FITC-UEA-I能力的變化

        4 EPCs增殖和遷移能力的變化

        通過(guò)在培養(yǎng)液中加入不同濃度VEGF,結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 μg/L的 VEGF即可明顯促進(jìn) EPCs的增殖(圖5A),隨著VEGF的濃度增加,其增殖能力不同程度提高,80 μg/L VEGF可提高其增殖率約58%。隨著VEGF濃度增加,其對(duì)EPCs的遷移和趨化作用明顯增強(qiáng)(圖5B)。

        Figure 5.Effects of VEGF on EPCs proliferation and migration capacities.A:effects of VEGF on EPCs proliferation rate.*P <0.05 vs 0 μg/L and 5 μg/L group;△P <0.05 vs other groups.B:effects of VEGF on EPCs migration capacity.*P <0.05 vs 0 μg/L group;△P <0.05 vs 0 μg/L,5 μg/L and 10 μg/L group;#P <0.05 vs other groups.圖6 VEGF對(duì)EPCs增殖及遷移能力的影響

        討 論

        骨髓單個(gè)核細(xì)胞是多種細(xì)胞的混合群,EPCs本身缺乏特異性表面標(biāo)志物[3],所以到目前為止,沒(méi)有一種簡(jiǎn)單、明確的EPCs分離方法,目前報(bào)道的EPCs分離方法主要有免疫磁珠法和差時(shí)貼壁法。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)條件摸索過(guò)程中發(fā)現(xiàn),通過(guò)免疫磁珠分離的小鼠骨髓CD117+細(xì)胞生長(zhǎng)并不令人滿意,培養(yǎng)2周所得細(xì)胞數(shù)量有限,這可能與分離過(guò)程中磁性微粒對(duì)細(xì)胞代謝功能產(chǎn)生的影響有關(guān)。Asahara在EPCs體外培養(yǎng)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)MNCCD34+(CD34+的單個(gè)核細(xì)胞)與MNCCD34-(CD34-的單個(gè)核細(xì)胞)混合培養(yǎng)可以比MNCCD34+單獨(dú)培養(yǎng)獲得更多的EPCs[1],這表明不同細(xì)胞系間相互作用或產(chǎn)生的可溶性因子對(duì)于EPCs的增殖分化起著重要作用,作為滋養(yǎng)細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞等在體外培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)EPCs分化起輔助作用。本研究中利用EPCs貼壁緩慢的特點(diǎn),采用差時(shí)貼壁法去除貼壁能力強(qiáng)的基質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及不貼壁的造血細(xì)胞,結(jié)合纖維連接蛋白的促黏附作用,可獲得較多數(shù)量和較高純度的EPCs,培養(yǎng)7-14 d所得細(xì)胞數(shù)可達(dá)到進(jìn)一步研究的需要。

        EPCs培養(yǎng)需要特殊的培養(yǎng)基,目前研究多采用內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基,如DMEM、MEM、M199等,添加內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子,如VEGF、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)等。目前尚未有一種標(biāo)準(zhǔn)成熟的EPCs培養(yǎng)方法,生長(zhǎng)因子在培養(yǎng)基中的濃度也各不相同[4]。對(duì)于小鼠骨髓來(lái)源EPCs的培養(yǎng)目前報(bào)道的方法較少,我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中采用EGM-2培養(yǎng)基,同時(shí)加入包含各種生長(zhǎng)因子(EGF、VEGF、bFGF 和 IGF -1)的 SingleQuot,但是發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)效果并不滿意。經(jīng)過(guò)嘗試,我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液臨用前適當(dāng)加入 VEGF、EGF、bFGF(均為10 μg/L)可獲得滿意的培養(yǎng)效果,同時(shí)選擇優(yōu)質(zhì)FBS對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)也非常重要。這說(shuō)明小鼠骨髓來(lái)源EPCs培養(yǎng)條件要求比較高,采用EGM-2培養(yǎng)基并加入適當(dāng)濃度、活性正常的生長(zhǎng)因子可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)小鼠EPCs。

        自培養(yǎng)的第4 d開(kāi)始,細(xì)胞開(kāi)始呈現(xiàn)集落生長(zhǎng),這與文獻(xiàn)報(bào)道的胚胎時(shí)期“血島”樣簇狀生長(zhǎng)相類似[5]。隨后細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞相互之間逐漸交聯(lián),有些細(xì)胞首尾相連呈線狀生長(zhǎng),提示EPCs可排列成管狀,最終形成血管。培養(yǎng)至10-14 d,貼壁細(xì)胞基本融合,細(xì)胞呈現(xiàn)典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)-鵝卵石狀。第4 d,在棄去懸浮細(xì)胞后,貼壁細(xì)胞SCA-1、CD117及CD133的表達(dá)明顯增加,這與差時(shí)貼壁及纖維連接蛋白對(duì)EPCs的篩選效應(yīng)有關(guān),隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其表達(dá)率逐漸下降,同時(shí)白細(xì)胞通用抗原CD45的表達(dá)逐步降低,而內(nèi)皮特異性抗原標(biāo)志VEGFR -2、CD31、VE -cadherin、vWF 及 eNOS表達(dá)逐漸增加,這表明體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的EPCs在逐步失去干細(xì)胞特性并向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化。

        小鼠SCA-1屬于Ly-6多基因家族,其主要表達(dá)于造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞[6]。CD117又稱 c-Kit,是具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)分子,是干細(xì)胞因子的受體,在早期分化的造血干/祖細(xì)胞表面均有表達(dá),轉(zhuǎn)導(dǎo)了造血干/祖細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的所需信號(hào),CD117+細(xì)胞為一群包括了不同分化階段干/祖細(xì)胞的異質(zhì)性細(xì)胞[7],結(jié)合SCA-1可將細(xì)胞進(jìn)一步分為兩個(gè)亞類:CD117+/SCA-1+和 CD117-/SCA-1+細(xì)胞。前者在多種造血生長(zhǎng)因子聯(lián)合刺激后,表現(xiàn)出極強(qiáng)的增殖能力,為相對(duì)早期的造血干細(xì)胞,不含定向祖細(xì)胞,c-Kit+/SCA-1+細(xì)胞在VEGF等內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的作用下,可以分化成內(nèi)皮細(xì)胞,說(shuō)明EPCs來(lái)源于 CD117+/SCA -1+細(xì)胞[8]。CD133 是早期造血干/祖細(xì)胞的標(biāo)志[9],目前對(duì)其功能還不十分了解,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為人CD34+/CD133+/VEGFR-2+細(xì)胞為早期的EPCs,隨著EPCs逐步分化CD133很快消失,而對(duì)于小鼠CD117+/SCA-1+/CD133+/VEGFR-2+細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是早期的EPCs。

        研究中無(wú)論是從形態(tài)學(xué)還是表型特征變化都展示了EPCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的特征,但是到目前為止仍無(wú)法知道EPCs何時(shí)完全失去祖細(xì)胞特征而分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)細(xì)胞雖然干細(xì)胞表型表達(dá)在逐步減少,但EPCs的另一重要特性,吞噬acLDL及結(jié)合內(nèi)皮特異性凝集素UEA-I的能力,在培養(yǎng)過(guò)程卻無(wú)明顯丟失,傳代接種后仍然有很強(qiáng)的集落形成和快速增殖能力,這表明所培養(yǎng)細(xì)胞是介于干細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞之間,具有高分化潛能且處于不同分化階段內(nèi)皮前體細(xì)胞群的混合體。

        VEGF是新生血管生成的主要誘導(dǎo)因子[10],也是誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞系分化的重要誘導(dǎo)因子,可以動(dòng)員骨髓內(nèi)EPCs進(jìn)入循環(huán),并趨化其到達(dá)內(nèi)皮損傷部位,促進(jìn)其分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞,參與受損內(nèi)皮的修復(fù)[11]。實(shí)驗(yàn)中可以看到VEGF是小鼠EPCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)不可或缺的重要因子,其可對(duì)離體EPCs的增殖和遷移特性產(chǎn)生劑量依賴性的促進(jìn)作用,另外在體研究也表明VEGF對(duì)EPCs的動(dòng)員和趨化及新生血管形成產(chǎn)生劑量依賴性促進(jìn)作用[12]。

        通過(guò)本研究表明,采用差時(shí)貼壁法及EGM-2內(nèi)皮培養(yǎng)基,加入適當(dāng)生長(zhǎng)因子,在體外可以穩(wěn)定培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源EPCs。體外培養(yǎng)的EPCs逐步向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化,其干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)逐步減少,而內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)不斷增加。VEGF是EPCs體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的重要生長(zhǎng)因子,可對(duì)其產(chǎn)生明顯的促增殖和遷移效應(yīng)。

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