楊理婷， 吳秉毅△， 蘇嘉霖， 郭坤元

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院1血液科，2內(nèi)分泌科，廣東 廣州510282)

細胞死亡分為凋亡、自體吞噬、壞死、有絲分裂失敗和脹亡［1］，以凋亡和壞死較為常見。最近的研究表明:凋亡又可根據(jù)凋亡細胞表面能否表達引起機體免疫攻擊的蛋白分子分為生理性死亡和免疫原性死亡［2］。

化療是抗腫瘤的常規(guī)治療方法之一，以往認為其主要作用機制是通過誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡達到清除腫瘤的目的。最近有研究［3－5］發(fā)現(xiàn)，蒽環(huán)類化療藥物在誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡的同時，通過促進凋亡中的腫瘤細胞表面發(fā)生標志物的暴露、釋放物質(zhì)到胞外、介導(dǎo)微環(huán)境等改變等多種機制增強凋亡中腫瘤細胞的免疫原性。如促進細胞膜上鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)、熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)、MHC I類分子等表達，促進其釋放免疫刺激物［如分泌高遷移率族蛋白B1(high mobility group box protein 1，HMGB－1)、核酸及其代謝產(chǎn)物等］以及改變腫瘤微環(huán)境等［6，7］。這些凋亡細胞能被機體免疫細胞，特別是被樹突狀細胞(dentritic cells，DCs)所攝取，誘發(fā)機體免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊［8］。腫瘤細胞的這類能被免疫系統(tǒng)識別并攻擊的凋亡稱為腫瘤細胞免疫原性死亡(immunogentic cell death)［9，10］。這些免疫效應(yīng)可能對化療療效有其獨特的作用，通過研究化療中腫瘤細胞的免疫原性死亡機制可進一步探索腫瘤傳統(tǒng)化療有機結(jié)合免疫治療的策略，還可能指導(dǎo)化療療效的預(yù)后評估。

目前，化療藥物誘導(dǎo)血液腫瘤細胞發(fā)生免疫原性死亡的研究甚少，尤其是建立小鼠模型方面尚無相關(guān)報道。我們在前期工作中已成功將小鼠紅白血病(mouse erythroleukemia，MEL)細胞成功種植于具有正常免疫功能的昆明(Kunming，KM)小鼠體內(nèi)，構(gòu)建了適合本實驗研究的小鼠紅白血病模型。在此基礎(chǔ)上，選取了蒽環(huán)類化療藥物阿霉素(adriamycin，ADM)作用于MEL細胞，參考Obeid等［11］實驗方法，進行小鼠體內(nèi)實驗，觀察小鼠荷瘤情況的變化，探討ADM是否可能誘導(dǎo)MEL細胞發(fā)生免疫原性死亡從而降低活性MEL細胞在KM小鼠體內(nèi)的成瘤性。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購于Hyclone;青－鏈霉素雙抗購于吉諾生物技術(shù)有限公司;鹽酸多柔比星注射液購于深圳萬樂藥業(yè)有限公司，規(guī)格為10 mg/支，批號為0903E1;Hoechst染色試劑盒購于碧云天公司;細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物公司;甲醛、瑞氏染料購于廣州化學(xué)試劑公司。

1.2 細胞和動物 清潔級雄性KM小鼠，4－6周齡，18－20 g，30只(購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物合格證號為0067799。飼養(yǎng)于中山大學(xué)實驗動物中心層流室，符合SPF要求，所用的水、飼料及墊料均經(jīng)高壓消毒處理，每隔2－3 d換1次墊料。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學(xué)標準。小鼠MEL購自北京協(xié)和細胞資源中心。

2 方法

2.1 MEL細胞的體外培養(yǎng) MEL細胞采用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg鏈霉素的RPMI－1640完全培養(yǎng)液，在37℃含5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2－3 d全量換液，挑選對數(shù)生長期細胞進行實驗。

2.2 ADM目標濃度的確定 取對數(shù)生長期的MEL細胞接種于6孔板(1×106/well)，990 μL/well細胞懸液。ADM 10 mg，使用滅菌注射用水配成母液，濃度為3 200 mg/L，－20℃避光保存。實驗需要時取出ADM母液，使用滅菌注射用水倍比稀釋成4個濃度梯度的工作液(100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L和800 mg/L)，各取 10 μL 加入每孔 990 μL 細胞懸液中，使 ADM 終濃度為 1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L和8 mg/L。每個濃度重復(fù)6孔。共孵育24 h后收集每孔細胞于1.5 mL EP管中行下列2項操作。

①Hoechst 33258染色檢測MEL細胞的凋亡 離心收集1.5mL EP管中的1×106個細胞，PBS洗滌2次，加入1 mL Hoechst染色固定液，4℃固定細胞10 min。離心去除固定液，用PBS洗滌2次，離心后留50 μL PBS重懸細胞并制備細胞涂片，自然晾干。滴加100 μL Hoechst 33258染色液，室溫避光染色10 min，水沖洗晾干，滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上玻片。避光條件下以350 nm波長激發(fā)，熒光顯微鏡下觀察。實驗重復(fù)3次。通過此法可以估計不同濃度的ADM使MEL細胞發(fā)生凋亡的粗略比例。

②流式細胞術(shù)檢測MEL細胞的凋亡 離心收集1.5 mL EP管中的1 ×106個細胞，PBS洗滌2次，然后重懸細胞于200 μL結(jié)合緩沖液，再加入5 μL Annexin V－FITC和5 μL DAPI，混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。PBS洗滌2次，去除多余熒光染料，流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測MEL細胞的凋亡(激發(fā)波長488 nm)。根據(jù) Obeid等［11，12］報道，確定 DAPI－/Annexin V+與 DAPI+/Annexin V+比例之和為70%左右的ADM目標濃度。實驗重復(fù)3次，每次均設(shè)陰性對照。

2.3 紅白血病小鼠模型的建立 收集對數(shù)生長期MEL細胞于離心管，1 000 r/min離心5 min，去上清，加PBS洗3次，PBS重懸調(diào)整細胞密度為5×109/L。雄性KM小鼠經(jīng)固定器固定后，絡(luò)和碘、乙醇常規(guī)消毒尾部皮膚，經(jīng)尾靜脈接種1×106個(0.2 mL)MEL細胞，絡(luò)和碘消毒針口，壓迫止血，云南白藥覆蓋創(chuàng)面。(1)外周血(peripheral blood，PB)觀察:小鼠瀕死或80 d時斷尾取外周血，1∶50倍稀釋于1%冰醋酸溶液，計算白細胞數(shù)目，留取外周血涂片行瑞氏－吉姆薩染色，在光鏡下觀察細胞形態(tài)并計數(shù)有核細胞百分率。(2)骨髓(bone marrow，BM)片觀察:瀕死小鼠頸椎脫臼法處死后立即進行骨髓原始細胞百分率的檢測。骨髓涂片制作方法:去掉小鼠大腿皮膚和肌肉，暴露其股骨及兩端關(guān)節(jié)，從股骨兩端關(guān)節(jié)頭處取下股骨，剪斷股骨兩端，用抽滿空氣的1 mL注射器插入骨髓腔，擠壓空氣沖出骨髓液滴于潔凈的玻片中間，迅速涂片使其均勻鋪開，晾干固定，行瑞氏－吉姆薩染色。于光學(xué)顯微鏡下計數(shù)500個有核細胞，對細胞進行分類計數(shù)。(3)組織病理學(xué)檢查:待小鼠瀕死時，頸椎脫臼法將其處死，立即取小鼠的肝、脾、骨髓，經(jīng)4%甲醛固定脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟切片，HE染色后在光鏡下觀察，確定小鼠的死亡原因。

2.4 實驗分組 30只雄性KM小鼠隨機分為小鼠紅白血病模型組(模型組)、ADM治療組(ADM組)、空白對照組(對照組)，10只/組。模型組:尾靜脈注射無菌PBS，200 μL/只。8 d后收集對數(shù)生長期的MEL細胞，無菌 PBS洗滌3次，1 000 r/min離心5 min，PBS重懸，調(diào)整細胞密度至5×1012/L，行尾靜脈注射MEL細胞1×106/只(200 μL)。ADM 組:目標濃度的ADM(通過流式細胞術(shù)確定為4 mg/L)與MEL細胞于培養(yǎng)瓶中共孵育24 h，離心收集，調(diào)整細胞密度至9×106/只(200 μL)，行尾靜脈注射。8 d后與A組處理相同。對照組:不做任何人為干預(yù)。每隔1－2 d觀察小鼠，小鼠瀕死時或存活至第80 d時檢測小鼠外周血白細胞(white blood cell，WBC)數(shù)目及體重，記錄小鼠患病情況和生存時間。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0軟件分析，計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示，生存時間采用Kaplan－Meier法進行生存分析，其余多組均數(shù)的比較采用 Oneway ANOVA檢驗。

Figure 1.Morphological nucleus changes of MEL cells after ADM treatment.A:MEL cells(phase－contrast microscope，×100);B:MEL cells treated with 4 mg/L ADM for 24 h(phase－contrast microscope，×100);C:MEL cells(Hoechst 33258 staining，×400);D:MEL cells treated with 4 mg/L ADM for 24 h(Hoechst 33258 staining，×400).圖1 4 mg/L ADM作用24 h后MEL細胞和細胞核的形態(tài)改變

結(jié) 果

1 ADM可在體外誘導(dǎo)MEL細胞發(fā)生凋亡

1.1 ADM對MEL細胞形態(tài)的影響 光學(xué)倒置顯微鏡下觀察:MEL細胞呈圓形，大小較均一，折光性好，透亮，邊緣清楚，見圖1A。用4 mg/L ADM處理24 h后，MEL細胞生長狀態(tài)變差，部分細胞出現(xiàn)皺縮，胞體變小，細胞碎片增多，折光性減弱，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡，見圖1B。Hoechst 33258染色后熒光顯微鏡下顯示:MEL細胞核呈圓形，大小比較一致，熒光強度比較均一，見圖1C。與之相比，經(jīng)4 mg/L ADM處理24 h后的MEL細胞有部分出現(xiàn)細胞核濃縮，可見凋亡小體，見圖1D。

1.2 ADM目標濃度的確定 細胞凋亡結(jié)果為DAPI－/Annexin V+與 DAPI+/Annexin V+比例之和為70%左右時的ADM濃度為4 mg/L。其中1次流式細胞儀檢測結(jié)果見圖2。

2 通過尾靜脈輸注MEL細胞給KM小鼠可導(dǎo)致小鼠紅白血病

結(jié)合白細胞數(shù)目、細胞形態(tài)學(xué)和病理組織學(xué)等綜合評定模型建立是否成功。小鼠瀕死時外周血白細胞計數(shù)明顯升高。瀕死小鼠外周血涂片幼稚紅細胞占3% －6%，以中、晚幼紅細胞為主，可見原始和早幼紅細胞。骨髓涂片示有核細胞增生明顯活躍，紅系及粒系增生明顯;幼紅細胞≥50%，以原始和早幼紅細胞為主，可見雙核。骨髓非紅系有核細胞(non－erythroid cells，NEC)中原始細胞≥30%，原始粒細胞呈圓形，染色質(zhì)細致，核仁明顯，胞質(zhì)少。符合急性紅白血病的診斷標準［13，14］。發(fā)病小鼠外觀及外周血、骨髓涂片見圖3。KM小鼠接種MEL細胞后100%發(fā)病，發(fā)病小鼠肝、脾明顯腫大。取發(fā)病小鼠肝、脾、骨髓行病理學(xué)檢查，鏡下見肝、脾正常組織結(jié)構(gòu)破壞，有彌漫性白血病細胞浸潤;高劑量組在心臟、腎臟組織中都能發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞浸潤;血管內(nèi)有瘤細胞淤滯。組織中腫瘤細胞形態(tài)(圖4)較培養(yǎng)瓶中的MEL細胞(圖3A)有所改變。骨髓中白血病細胞浸潤，原始及幼稚紅細胞、粒細胞比例明顯增加。肝、脾、骨髓病理結(jié)果見圖4。

Figure 2.FCM result of MEL cells treated with ADM for 24 h.圖24 mg/L ADM作用于MEL細胞24 h后流式細胞術(shù)結(jié)果

3 用ADM誘導(dǎo)的具有70%凋亡率的MEL細胞預(yù)先處理KM小鼠，可降低活性MEL細胞在KM小鼠體內(nèi)的成瘤性，延長紅白血病KM小鼠的生存期

觀察至80 d時，模型組小鼠全部病死，瀕死小鼠出現(xiàn)納差、懶動、消瘦、蜷縮等現(xiàn)象;ADM組仍有1只小鼠存活;對照組小鼠全都存活。模型組和ADM組小鼠瀕死或第80 d時外周血WBC數(shù)目、體重和生存時間較對照組分別升高、降低和縮短。但是，ADM組小鼠較模型組小鼠外周血WBC數(shù)目降低(P＜0.01)，體重增加(P ＜0.01)，生存時間延長(P ＜0.01)，見表1、圖5。

Figure 3.Leukemia cells in peripheral blood(PB)and bone marrow(BM)of mice on the brink of death(Wright－Giemsa staining).A:the smears of MEL cells from culture bottle(×1 000);B:the smears of erythroid progenitor cells from PB(×1 000);C:the smears of leukemia cells from BM(×400);D:normal KM mice(general camera);E:KM mice on the brink of death(general camera).圖3 瀕死小鼠外周血、骨髓涂片中白血病細胞

討 論

根據(jù)文獻［15－18］報道的MEL細胞遺傳學(xué)背景及生物特性，我們建立了MEL細胞輸注KM小鼠的紅白血病模型。本研究表明，通過尾靜脈途徑給予KM小鼠輸注1×106個MEL細胞后，其瀕死時外周血白細胞升高，外周血及骨髓涂片中幼稚紅細胞、幼稚粒細胞比例增加，肝、脾、骨髓病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞彌漫浸潤，全身呈惡病質(zhì)狀態(tài)，與人紅白血病的病理生理相似。

Figure 4.The histopathological examination of organs in erythroleukemic mice(HE staining，×100).Tumor cell invasion was oberved in the liver，spleen and bone marrow of mice in model group(indicated by red arrows)圖4 小鼠組織病理檢查結(jié)果

表1 各組KM小鼠外周血白細胞數(shù)目、體重和生存時間Table 1.The WBC count in PB，weight and survival time of the experimental KM mice(±s.n=10)

表1 各組KM小鼠外周血白細胞數(shù)目、體重和生存時間Table 1.The WBC count in PB，weight and survival time of the experimental KM mice(±s.n=10)

＊＊P ＜0.01 vs ADM group.

Group WBC count in PB on the brink of death(×109/L)Weight on the brink of death(g)Survival time(d)MEL model 16.06±3.38＊＊ 28.42±4.33＊＊ 28.00±8.43＊＊ADM 11.02±2.69 40.24±3.22 56.00±12.68 Control 5.81±0.88＊＊ 45.91±2.14＊＊ 80.00±0.00＊＊

Figure 5.The survival curves of MEL model group，ADM group and control group in Kaplan －Meier analysis.圖5 不同處理組的生存曲線

實驗觀察到4 mg/L ADM作用于MEL細胞24 h后，流式細胞術(shù)檢測DAPI－/Annexin V+與DAPI+/Annexin V+比例之和約為70%，說明其誘導(dǎo)MEL細胞發(fā)生早期和晚期凋亡的比例大約為70%。根據(jù)Obeid等［11］報道，處于此凋亡比例范圍中的瀕死腫瘤細胞(dying cells)可以發(fā)生免疫原性死亡，而且剩下約30%未發(fā)生凋亡的腫瘤細胞也不會致瘤，可能與這部分沒有凋亡的細胞已經(jīng)程序化定位有關(guān)，它們不久后即將死亡。小鼠體內(nèi)瘤負荷的減少被認為是瀕死腫瘤細胞(dying cells)誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的一個重要指標［11］。然而評估小鼠瘤負荷狀態(tài)，在實體瘤方面可以很直觀地通過觀察小鼠皮下瘤的直徑大小、重量、消長的變化來衡量;在惡性血液系統(tǒng)疾病方面則可以通過小鼠外周血白細胞數(shù)目、體重、生存時間的變化來評估。

本實驗研究中，與小鼠紅白血病模型組相比較，阿霉素誘導(dǎo)治療組小鼠在外周血白細胞水平、體重、生存時間3個指標上均反映其體內(nèi)瘤負荷水平明顯降低;可以說明通過4 mg/L ADM處理24 h后的瀕死MEL細胞發(fā)生了免疫原性死亡，誘導(dǎo)了抗腫瘤免疫應(yīng)答。但是，與空白對照組相比較，說明其仍處于疾病狀態(tài)，體內(nèi)仍存在一定的瘤負荷水平，可能難以達到臨床意義上的完全緩解。

瀕死腫瘤細胞發(fā)生免疫原性死亡的機制主要與其細胞膜上CRT的外翻有關(guān)［11］。以往研究認為，細胞凋亡早期出現(xiàn)細胞膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)外翻到細胞膜外側(cè)，促進吞噬細胞(主要是巨噬細胞)，而非DCs對其識別和吞噬，同時巨噬細胞釋放炎癥抑制因子抑制免疫反應(yīng)，這時的凋亡是非免疫原性的。近期有研究［11，12］報道，腫瘤細胞在蒽環(huán)類化療藥物的作用下，其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣網(wǎng)蛋白(endo－calreticulin，endo－CRT)被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移至細胞外膜上(凋亡幾分鐘至數(shù)小時之間)，早于PS外翻(凋亡12 h后)。細胞外膜上的CRT通過相應(yīng)受體介導(dǎo)DCs成熟，對其識別和吞噬，并將腫瘤抗原遞呈給CD4+、CD8+T細胞，從而發(fā)揮抗腫瘤免疫，此時的凋亡具有免疫原性。CRT轉(zhuǎn)移至細胞膜外的機制目前尚未完全明確，可能與腫瘤細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中真核細胞起始因子(eukaryotic initiation factor－2a，eIF－2a)磷酸化及caspase的激活有一定關(guān)系。

Obeid 等［12，19］應(yīng)用蒽環(huán)類化療藥物(阿霉素、去甲柔紅霉素、米托蒽醌)及 γ－放療處理 CT26、MCA205瘤細胞，使瘤細胞達到70%凋亡率，發(fā)生免疫原性死亡，細胞膜高表達CRT。用中和抗體阻斷CRT，或siRNA技術(shù)下調(diào)CRT的表達，都能顯著抑制蒽環(huán)類藥物處理的腫瘤細胞被DCs識別，而重組CRT蛋白能夠逆轉(zhuǎn)此作用。用DNA損傷類化療藥物如依托泊苷和絲裂霉素C誘導(dǎo)的凋亡腫瘤細胞不能有效誘導(dǎo)腫瘤免疫原性死亡。張峻嶺等［20］使用米托蒽醌提高黑色素瘤B16細胞膜上CRT的表達，且提高黑色素瘤組織中DCs和T細胞數(shù)量，從而抑制黑色素瘤生長。

蒽環(huán)類化療藥物阿霉素誘導(dǎo)小鼠MEL細胞發(fā)生免疫原性死亡，為臨床白血病化療方案的選擇提供了新的理論依據(jù)和策略?？梢园褌鹘y(tǒng)化療與免疫生物治療更有機地結(jié)合在一起;為微小殘留白血病的治療提供了新的思路。這些都將有待于對其主要機制CRT的進一步研究，CRT有望成為一個新的化療預(yù)后評估指標。本次實驗初步探索了蒽環(huán)類化療藥物是否可以誘導(dǎo)惡性血液系統(tǒng)腫瘤細胞發(fā)生免疫原性死亡，了解到經(jīng)過4 mg/L ADM處理24 h后的MEL細胞可能發(fā)生免疫原性死亡，從而誘導(dǎo)KM小鼠產(chǎn)生抗MEL細胞免疫應(yīng)答，降低活性MEL細胞在KM小鼠體內(nèi)的成瘤性，降低體內(nèi)瘤負荷水平。

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