尹雅玲， 李 鵬， 魏林郁， 白瑞櫻， 王亞莉

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院1基礎(chǔ)醫(yī)學版生理學與神經(jīng)生物學教研室，2藥學院，河南新鄉(xiāng)453003)

甾體類化合物在正常細胞生長代謝中扮演著重要的角色。孕酮(progesterone，P)是維持正常妊娠和女性器官發(fā)育的重要甾體激素之一，通過分布于性靶器官上的孕酮受體(progesterone receptor，PR)來發(fā)揮作用。但近年來發(fā)現(xiàn)孕酮對非靶器官腫瘤細胞的增殖、分化很可能也起著調(diào)節(jié)作用［1，2］。研究發(fā)現(xiàn)部分白血病病人的腫瘤細胞和許多白血病細胞系如:K562、U937等都表達PR，但孕酮對白血病細胞增殖、分化的作用少有報道。本研究采用人慢性粒細胞白血病急變細胞系－K562細胞株，觀察P和孕酮受體拮抗劑米非司酮(mifepristone，RU486)對K562細胞增殖、分化的影響，為探討白血病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞系 K562細胞為人慢性粒細胞白血病急變細胞系，購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。用含體積分數(shù)10% 熱滅活小牛血清的RPMI－1640培養(yǎng)基，置37℃、用含體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)，每2－3 d換1次液。

1.2 藥物和試劑 P(Sigma)用無水乙醇溶解并稀釋成10－2mol/L濃度，4℃ 保存。RU486(Sigma)用無水乙醇溶解并稀釋成10－2mol/L－10－4mol/L梯度濃度，4℃保存。2，3－雙(2－甲氧基－4－硝基－5－磺酸苯基)－5－［(苯胺)羰基］－2H－四唑氫氧化物{2，3－bis(2－methoxy－4－nitro－5－sulfophenyl)－5－［(phenylamino)carbony1］－2H －tetrazolium hydroxide，XTT}(Sigma)用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)配成 1 g/L濃度，避光4℃ 保存?zhèn)溆?。瑞氏染?.8 g和吉姆薩染料0.18 g加入甲醇600 mL配成瑞氏－吉姆薩混合染液。FITC標記的鼠抗人CD71單克隆抗體，購自深圳晶美生物公司。聯(lián)苯胺二鹽酸鹽(benzidine dihydrochloride)(Sigma)用0.5%乙酸配成濃度為2 g/L，避光4℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 實驗分組 實驗設(shè)P(終濃度10－5mol/L)聯(lián)合不同濃度 RU486(終濃度分別為 10－5mol/L、10－6mol/L和 10－7mol/L)為處理組，設(shè) P(終濃度10－5mol/L)組和RU486(終濃度10－5mol/L)組為陽性對照組，空白對照組加入與處理組等量的無水乙醇。

2.2 液體培養(yǎng)實驗 取指數(shù)生長期K562細胞以終濃度5×107cells/L接種于24孔板內(nèi)，每孔1 mL，每組平行種3復(fù)孔。置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，每天計數(shù)活細胞數(shù)目(臺盼藍拒染)，實驗重復(fù)3次。

2.3 XTT測定 取指數(shù)生長期K562細胞以終濃度5×107cells/L接種于96孔板，每孔80 μL，每組平行種3孔，置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。用PBS(pH 7.4)配制濃度為1 g/L的XTT和濃度為5 mmol/L的吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate，PMS)，將配制好的XTT與PMS混合，每個孔中加入20 μL上述混合溶液(使得XTT終濃度為0.2 g/L，PMS 終濃度為 25 μmol/L，37 ℃、體積分數(shù) 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，用ELX－800酶標儀(Bio－Tek)以雙波長450 nm和630 nm測各孔的吸光度值(A)，實驗重復(fù)3次。

2.4 集落形成抑制實驗 取指數(shù)生長期K562細胞以終濃度106cells/L加入到體外半固體培養(yǎng)體系中(含體積分數(shù)30% 小牛血清和0.9% 甲基纖維素)，每孔0.5 mL接種于24孔板，每組平行種3孔，置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d，置倒置顯微鏡下計數(shù)大于50個細胞的集落，實驗重復(fù)3次。

2.5 細胞形態(tài)學觀察 將處于對數(shù)生長期的K562細胞以終濃度5×107cells/L加入含體積分數(shù)10%小牛血清的RPMI－1640中，置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，收集各組細胞、涂片，Wright－Giemsa染色，油鏡下觀察細胞形態(tài)并顯微照相。

2.6 血紅蛋白聯(lián)苯胺染色 取指數(shù)生長期K562細胞以終濃度5×107cells/L接種于 24孔板內(nèi)，每孔1 mL，每組平行種3復(fù)孔。置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。收集各組3個平行孔細胞1 mL，調(diào)整細胞濃度為109cells/L，于4℃、1 000 r/min離心10 min，棄上清，加1 mL聯(lián)苯胺和10 μL體積分數(shù) 30% 過氧化氫混勻，置 96孔板，每孔200 μL，每組3 孔，EXL－800酶標儀(Bio－Tek)波長570 nm測定吸光度值(A)，實驗重復(fù)3次。

2.7 細胞膜CD71表面標記的檢測 將處于對數(shù)生長期的K562細胞以終濃度5×107cells/L加入含體積分數(shù)10% 小牛血清的RPMI－1640中，置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，分別收集各組細胞106個，PBS洗1次，先加入體積分數(shù)0.1%人血清白蛋白封閉非特異性抗體，再加入FITC標記的鼠抗人CD71單克隆抗體，4℃避光30 min，PBS洗1次，用FACScaliber流式細胞儀(Becton－Dickinson)檢測，CELLQuest軟件分析結(jié)果。

2.8 孕酮對K562細胞周期的影響 將處于對數(shù)生長期的K562細胞以終濃度5×107cells/L加入含體積分數(shù)10% 小牛血清的RPMI－1640中，置37℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，分別收集各組細胞106個，生理鹽水洗2遍，加入 體積分數(shù)75%的冷乙醇固定 24 h，PBS洗 2遍，體積分數(shù)1%RNase酶37℃ 消化30 min，50 mg/L碘化丙啶(propidine iodide，PI)染色，F(xiàn)CM標準程序進行細胞周期分析。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 P和RU486對K562細胞增殖的影響

聯(lián)合10－5mol/L P 與 10－5mol/L －10－7mol/L RU486共同培養(yǎng)5 d，K562細胞的的生長呈不同程度抑制，并隨RU486的濃度升高呈劑量依賴性，見圖1。單獨使用10－5mol/L P和10－5mol/L RU486連續(xù)培養(yǎng)5 d，K562細胞生長抑制率(GIR)分別為72.52%和 12.32%，而聯(lián)合 10－5mol/L P與 10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同培養(yǎng)5 d，K562細胞的生長抑制率(GIR)分別為63.59%、49.17%和32.24%。

Figure 1.The effect of progesterone(P)and progesterone receptor antagonist mifepristone(RU486)on the growth of K562 cells.±s.n=9.圖1 P和RU486對K562細胞生長的影響

XTT實驗顯示單獨使用10－5mol/L P可顯著抑制K562細胞增殖，A值與對照組比較(P＜0.01)，而聯(lián)合 10－5mol/L P 與 10－5mol/L － 10－7mol/L RU486共同培養(yǎng)K562細胞，A值與單獨使用10－5mol/L孕酮處理組比較顯著升高(P＜0.01)，并呈劑量依賴性，見圖2。集落形成抑制實驗同樣顯示10－5mol/L P與10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同培養(yǎng)，K562細胞的集落數(shù)與單獨使用10－5mol/L P處理組比較顯著升高(P＜0.01)，并呈劑量依賴性，見圖3。

Figure 2.The effect of P and RU486 on XTT assay in K562 cells.±s.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜ 0.01 vs P(10－5mol/L)group.圖2 P和RU486對K562細胞XTT測定的影響

Figure 3.The effect of P and RU486 on colony assay in K562 cells.±s.n=9.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs P(10－5mol/L)group.圖3 P和RU486對K562細胞集落產(chǎn)率的影響

2 P和RU486對K562細胞形態(tài)學的影響

K562細胞培養(yǎng)5 d后，Wright－Giemsa染色，光鏡下可見空白對照組和單獨使用10－5mol/L RU486組的K562細胞胞漿深藍色，核大，呈圓形或橢圓形，染色質(zhì)疏松細致，可見1－3個核仁，核漿比例大，見圖4A、C;經(jīng)10－5mol/L P處理后的細胞體積變大，核漿比例減少，有核切跡，核染色質(zhì)濃集變粗，部分細胞核仁比較明顯，胞質(zhì)增多，淺染，核周胞質(zhì)出現(xiàn)淡染區(qū)，表現(xiàn)一定程度的分化，見圖4B。經(jīng)10－5mol/L P分別聯(lián)合 10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同處理的K562細胞顯示出上述分化現(xiàn)象的細胞數(shù)量，同10－5mol/L P處理組比較數(shù)量減少，并隨著聯(lián)合應(yīng)用的RU486的濃度呈現(xiàn)一定劑量依賴性，見圖4D－F。

Figure 4.The effects of P and RU486 on morphology of K562 cells(Wright－Giemsa staining，×1 000).A:control group;B:P(10－5 mol/L)group;C:RU486(10 －5mol/L)group;D:P(10 －5mol/L)combined with RU486(10 －7mol/L)group;E:P(10 －5mol/L)combined with RU486(10 －6mol/L)group;F:10 －5mol/L P combined with RU486(10 －5mol/L)group.圖4 P和RU486對K562細胞形態(tài)的影響

3 P和RU486對K562細胞內(nèi)血紅蛋白聯(lián)苯胺染色的影響

10－5mol/L P作用5 d后，K562細胞聯(lián)苯胺染色A值明顯升高，與空白對照組比較(P＜0.01)。聯(lián)合10－5mol/L P與10－5mol/L－1－7mol/L RU486共同培養(yǎng)5 d，K562細胞的聯(lián)苯胺染色A值與單獨使用10－5mol/L P處理組比較顯著下降(P＜0.01)，并隨RU486的濃度升高呈劑量依賴性。單獨使用10－5mol/L RU486培養(yǎng)5 d，K562細胞的聯(lián)苯胺染色A值與空白對照組比較無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

4 P作用下K562細胞膜CD71表面標記的表達

流式細胞儀分析顯示，10－5mol/L P作用于K562細胞4 d后，85.72%的細胞膜上CD71表面標記表達陽性，說明孕酮可以誘導(dǎo)K562細胞向紅系分化，見圖6B。聯(lián)合10－5mol/L P 與10－5mol/L －1－7mol/L RU486共同培養(yǎng)，K562細胞CD71表達陽性率與單獨使用10－5mol/L P組比較顯著下降(P＜0.01)，并隨RU486的濃度升高呈劑量依賴性，見圖6D－F。單獨使用10－5mol/L RU486培養(yǎng)組，K562細胞CD71表達陽性率與空白對照組比較無顯著差異(P ＞0.05)，見圖6C。

Figure 5.The effect of P and RU486 on benzidine staining(A570 value)in K562 cells.±s.n=9.＊＊P＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs P(10－5mol/L)group.圖5 P和RU486對K562細胞聯(lián)苯胺染色的影響

5 P對K562細胞周期的影響

流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，分布于細胞周期G1期、S期和G2期的K562細胞數(shù)有明顯不同。單獨使用10－5mol/L P組分布于S期的細胞與對照組比較明顯增加(P＜0.01)，而分布在G1期和 G2期的細胞數(shù)與對照組比較明顯減少(P＜0.01)，可見孕酮對K562細胞的抑制作用很可能是由于將其細胞周期阻滯在S期所致，見表1。聯(lián)合10－5mol/L P與10－5mol/L－10－7mol/L RU486共同培養(yǎng)，分布于S期的K562細胞與單獨使用10－5mol/L P組比較有顯著差異(P＜0.01)，并隨RU486的濃度升高呈劑量依賴性。單獨使用10－5mol/L RU486組，分布于S期的K562細胞與空白對照組比較差異無顯著(P＞0.05)，見表1。

表1 P和RU486對K562細胞周期的影響Table 1.The effect of P and RU486 on the cell cycle in K562 cells(%.±s.n=3)

表1 P和RU486對K562細胞周期的影響Table 1.The effect of P and RU486 on the cell cycle in K562 cells(%.±s.n=3)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;##P ＜ 0.01 vs P(10 －5mol/L)group.

Group G1－phase S－phase G2－phase Control 35.61 ±2.07 52.69 ±2.58 11.74 ±1.97 P(10－5mol/L) 18.85 ±1.43＊＊ 76.16 ±1.35＊＊ 4.99 ±1.27＊＊RU486(10 －5mol/L) 33.04 ±1.11 56.22 ±1.43 11.68 ±1.79 P(10－5mol/L)+RU486(10－7mol/L) 19.33 ±1.21＊＊ 72.74 ±2.58＊＊ 7.21 ±1.43*P(10－5mol/L)+RU486(10－6mol/L) 21.33 ±0.78＊＊## 69.74 ±1.47＊＊## 9.33 ±1.97＊＊##P(10－5mol/L)+RU486(10－5mol/L) 23.04 ±1.45＊＊## 65.83 ±1.64＊＊## 11.17 ±1.39##

討 論

P是由卵巢的黃體顆粒細胞產(chǎn)生的一類甾體類激素。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，甾體類激素及其衍生物不僅在正常細胞生長代謝，紅細胞的氧化損傷，臟器的缺血再灌注修復(fù)和神經(jīng)損傷修復(fù)過程中扮演著重要的角色，而且對腫瘤細胞的增殖、分化也起著重要的調(diào)節(jié)作用［1，2］。白血病的發(fā)生發(fā)展與細胞增殖和分化之間的平衡失調(diào)有關(guān)，表現(xiàn)為增殖失控而分化受阻。以往的工作也證實甾體類化合物對某些白血病細胞系確實具有生物學活性［3，4］，具有較強的誘導(dǎo)白血病細胞分化、抑制增殖和促進細胞凋亡的作用。傳統(tǒng)認為，P是通過位于胞內(nèi)的孕酮核受體來發(fā)揮作用。白血病細胞的研究顯示，在 THP－1、U226、MOT、U937和K562等部分白血病細胞系中可檢測到P核受體的表達［5］。早先的研究也發(fā)現(xiàn)，在用長春新堿、強的松和黃體酮聯(lián)合化療的病人比單獨使用長春新堿和強的松表現(xiàn)出明顯的緩解，尤其是P受體表達陽性的白血病病人［6］。本研究從液體培養(yǎng)，XTT測定、集落形成抑制實驗和細胞周期觀察細胞的增殖能力，從細胞形態(tài)學、聯(lián)苯胺染色和分化抗原CD71表達觀察孕酮和孕酮受體拮抗劑對細胞的誘導(dǎo)分化能力。結(jié)果顯示10－5mol/L P在體外實驗中可顯著抑制K562細胞增殖并誘導(dǎo)其向紅系分化，而聯(lián)合P和不同濃度RU486處理K562細胞則可不同程度阻斷單獨使用P時對K562細胞的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用。在體外實驗中進一步證實了P對K562白血病細胞的作用，提示其作用發(fā)揮很可能是通過P核受體。但最近的研究發(fā)現(xiàn)孕酮對白血病等腫瘤細胞的效應(yīng)與P誘導(dǎo)的阻斷因子(progesterone－ induced blocking factor，PIBF)有關(guān)［7，8］。PIBF 在正常妊娠過程中可抑制自然殺傷細胞的活性，參與免疫逃避。在大多數(shù)白血病細胞中都檢測到其mRNA的表達。P及RU486可分別上調(diào)和下調(diào)PIBFmRNA及其蛋白的表達［9］。因此，RU486則有助于白血病的免疫治療。本研究也觀測了10－5mol/L RU486對K562細胞的作用，結(jié)果顯示10－5mol/L RU486在體外實驗中可一定程度地抑制K562增殖，但其抑制程度要比單獨使用P弱，同時在體外RU486對K562細胞并無誘導(dǎo)分化作用。這一結(jié)果與最近的研究并不矛盾。但是這一結(jié)果也提示我們P對白血病細胞很可能不完全通過 P核受體。在 JUKAT、HL60、HUT102等白血病細胞系中雖未檢測到孕酮受體表達［10］，但是P卻可促進HL60在脂多糖作用下釋放IL－1β。那么P對白血病細胞的增殖和分化的作用與P核受體是多大相關(guān)性?其作用的發(fā)揮是否還有其它因素參與?這將是我們下一步需要探討的。

［1］Chittaranjan S，McConechy M，Hou YC，et al.Steroid hormone control of cell death and cell survival:molecular insights using RNAi［J］.PLoS Genet，2009，5(2):e1000379.

［2］Le Ronancer M，Treilleux I，Bouchekioua － Bouzaghou K，et al.Methylation，a key step for nongenomic estrogen signaling in breast tumors［J］.Steroids，2010，75(8 － 9):560－ 564.

［3］He Q，Jiang D.A novel aminosteriod is active for proliferation inhibition and differentiation induction of human acute myeloid HL － 60 cells［J］.Leuk Res，1999，23(4):369－372.

［4］尹雅玲，何 群.氨基甾體H42648對K562白血病細胞系的抑制增殖和誘導(dǎo)分化作用觀察［J］.中南大學學報:醫(yī)學版，2006，31(6):853 －857.

［5］Srivastava MD，Anderson DJ.Progesterone receptor expression by human leukocyte cell lines:molecular mechanisms of cytokine suppression［J］.Clin Exp Obstet Gynecol，2007，34(1):14 －24.

［6］Fink M.Possible effect of medroxyprogesterone acetate(MPA)in lymphoid blast crisis of chronic myelogenous leukemia［J］.Ann Hematol，1994，68(2):89 －90.

［7］Check JH，Sansoucie L，Chern J，et al.Mifepristone treatment improves length and quality of survival of mice with spontaneous lung cancer［J］.Anticancer Res，2010，30(1):119－122.

［8］Check JH，Sansoucie L，Chern J，et al.Mifepristone treatment improves length and quality of survival of mice with spontaneous leukemia［J］.Anticancer Res，2009，29(8):2977－2980.

［9］Srivastava MD，Thomas A，Srivastava BI，et al.Expression and modulation of progesterone induced blocking factor(PIBF)and innateimmune factors in human leukemia cell lines by progesterone and mifepristone［J］.Leuk Lymphoma，2007，48(8):1610 －1617.

［10］Suzuki T，Murry BA，Darnel AD，et al.Progesterone metabolism in human leukemic monoblast U937 cells［J］.Endocr J，2002，49(5):539 －546.