郭正輝， 黃 海， 杜 濤， 許可慰， 曹 億， 陳杰青，董 文， 姚友生， 林天歆， 謝文練， 江 春， 韓金利， 黃 健△

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1泌尿外科，2產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510120)

前列腺特異性膜抗原(prostate－specific membrane antigen，PSMA)是存在于前列腺細(xì)胞膜的一種Ⅱ型跨膜蛋白。1987年Horoszewicz等［1］報(bào)道在前列腺細(xì)胞上的PSMA具有很高的組織特異性，且在激素難治和發(fā)生轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者中不像前列腺特異性抗原(prostate－specific antigen，PSA)表達(dá)減弱，反而會(huì)增加。而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)PSMA不僅是前列腺癌高特異性的瘤標(biāo)，而且有著受體、營(yíng)養(yǎng)攝取、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞遷移等多方面功能［2］。絲裂原活化蛋白激酶/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen－activated protein kinases/extracellular signal－regulated protein kinases，MAPK/ERK)途徑是 MAPK信號(hào)系統(tǒng)中最重要一條通路，它通過(guò)Ras/Raf/MEK/ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)從胞外受體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)控基因表達(dá)［3］。近年來(lái)的研究顯示ERK途徑的激活與前列腺癌惡化、進(jìn)展密切相關(guān)。PD98059能和ERK上游信號(hào)MEK選擇性結(jié)合，直接阻斷ERK蛋白的磷酸化過(guò)程，是可逆的、胞膜通透的抑制劑。在本研究中，我們利用前期實(shí)驗(yàn)［4］通過(guò)RNAi技術(shù)獲得的沉默PSMA表達(dá)的LNCaP細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在一般外環(huán)境及ERK磷酸化受抑制的情況下，探討PSMA與LNCaP細(xì)胞內(nèi)ERK蛋白的活性及細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的關(guān)系。

材料和方法

1 材料

PSMA基因被沉默的前列腺癌LNCaP細(xì)胞株(實(shí)驗(yàn)組)、轉(zhuǎn)染對(duì)任何基因無(wú)干擾作用siRNA的LNCaP細(xì)胞株(空轉(zhuǎn)組)、未經(jīng)處理的LNCaP細(xì)胞株(對(duì)照組)，由本課題組培養(yǎng)并提供［8］;RPMI－1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone);0.25%胰酶(吉瑪公司);MTT試劑盒(碧云天公司);Transwell板(Corning);蛋白提取試劑盒(含RIPA、PSMF，碧云天);兔抗人磷酸化ERK1/2多克隆抗體(北京博奧森);兔抗人PSMA單克隆抗體(Abcam，ab76104);3－磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde－3－phosphate hydoxygenase，GADPH)內(nèi)參照抗體(Santa Gruz);辣根過(guò)氧化物酶(peroxidase horseradish，HRP)標(biāo)記羊抗兔抗體(ICL);PD98059(Merck);BCA法蛋白定量試劑盒(上海申能博采);柯達(dá)黑白膠片;增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(Thermo)、超敏ECL試劑盒(Millipore);免疫組化染色試劑盒、濃縮型DAB試劑盒(中杉金橋);其它試劑均為進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)儀器均由中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與鏡下觀察 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組、空轉(zhuǎn)組細(xì)胞于含100 mL/L FBS，100 g/L青霉素，1×105U/L鏈霉素的RPMI－1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37℃、50%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞每3－4 d換液，80%融合后1∶4傳代，每天觀察記錄。PD98059溶于甲醇中(0.7 g/L)，分裝備用。

2.2 3組細(xì)胞MAPK通路ERK蛋白活性檢測(cè)

①Western blotting 對(duì)照組、空轉(zhuǎn)組、實(shí)驗(yàn)組3組細(xì)胞按3×106個(gè)細(xì)胞種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后予無(wú)血清RPMI－1640培養(yǎng)基換液。24 h后，一部分細(xì)胞予同樣無(wú)血清培養(yǎng)基換液，另一部分細(xì)胞予含25 μmol/L PD98059的無(wú)血清培養(yǎng)基更換，全部細(xì)胞再于培養(yǎng)箱中孵育30 min，即用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞總蛋白:吸除培養(yǎng)基，冰上RIPA按70 μL/well，PMSF按RIPA的1/100加入，冰上裂解30 min。刮取裂解細(xì)胞于4℃、14 000 r/min離心30min，取上清為細(xì)胞總蛋白。BCA法蛋白定量，分別按50 μg/well和30 μg/well于12%SDS－PAGE行3組細(xì)胞PSMA和磷酸化ERK蛋白分離，轉(zhuǎn)于PVDF膜上，剪取目的條帶，5%脫脂奶封閉3h，孵PSMA(1∶1 000)Ⅰ抗、p－ ERK(1∶300)Ⅰ抗和 GAPDH(1∶10 000)過(guò)夜，第 2 d孵HRP標(biāo)記Ⅱ抗(1∶1 000)1 h，暗室中加入發(fā)光液，其中PSMA使用超敏ECL發(fā)光液;p－ERK使用ECL發(fā)光液。黑白膠片曝光。

②細(xì)胞免疫化學(xué) 3組細(xì)胞于24孔板中種板，約5×104/well，貼壁后予無(wú)血清RPMI－1640培養(yǎng)基換液。24 h后，一般培養(yǎng)基及抑制磷酸化ERK蛋白的外環(huán)境處理同Western blotting，全部細(xì)胞孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定30 min，每孔加1滴0.3%Triton，破裂細(xì)胞膜，室溫下孵育15 min，每孔加1滴過(guò)氧化物酶阻斷液，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，室溫孵育10 min。而后每孔加1滴p－ERK多克隆抗體(1∶200)，設(shè)立空白對(duì)照復(fù)孔滴加PBS，4℃過(guò)夜。第2 d 37℃復(fù)溫45 min，每孔加1滴生物素化Ⅱ抗，室溫孵育15 min。每孔滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液50 μL，37℃孵育15 min，滴加2滴新鮮配制DAB溶液，并在鏡下觀察確定顯色時(shí)間。自來(lái)水沖洗，蘇木素染核，自來(lái)水沖洗泛藍(lán)，吸除上清液，鏡下觀察。每孔隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(10×20)。確定細(xì)胞陽(yáng)/陰性染色較為主觀，因此選取1個(gè)較為淺染的細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，濃于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞為陽(yáng)性細(xì)胞，淺于標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞為陰性細(xì)胞，并對(duì)3組細(xì)胞p－ERK的表達(dá)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3 3組細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移能力檢測(cè)

①M(fèi)TT檢測(cè)3組細(xì)胞的增殖能力 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞用0.25%胰酶1 mL消化60 s，后用含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)基終止消化，吸管輕輕吹打20次，移入無(wú)菌離心管，1 000 r/min離心5 min，分別用含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)基和加入PD98059 25 μmol/L的上述培養(yǎng)基重懸離心后細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)，以2 000/well接種于96孔板，每孔體積200 μL，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，種板后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每4 d予相應(yīng)的培養(yǎng)基換液1次。到檢測(cè)時(shí)點(diǎn)取出需檢測(cè)的培養(yǎng)板，往每個(gè)培養(yǎng)孔中加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后取出，吸凈培養(yǎng)孔中液體，每孔加入150 μL的DMSO，置于搖床上勻速搖5 min，在分光光度計(jì)上測(cè)各組細(xì)胞的A492值，每12 h測(cè)定1 塊 96 孔板，分別于 12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h 8 個(gè)時(shí)點(diǎn)檢測(cè)，復(fù)孔檢測(cè)結(jié)果取均值并繪制生長(zhǎng)曲線。

②Transwell遷移實(shí)驗(yàn) 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)前予無(wú)血清RPMI－1640培養(yǎng)基處理，24 h后吸去培養(yǎng)液，每瓶細(xì)胞加入0.25%胰酶1 mL消化60 s，后用含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)基1.5 mL終止消化，吸管輕輕吹打20次，移人無(wú)菌離心管，1 000 r/min離心5 min，棄掉離心后培養(yǎng)基，分別用含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)基和加入PD98059 25 μmol/L的上述培養(yǎng)基重懸，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)板人工計(jì)數(shù)，以100 μL培養(yǎng)基中含1×105個(gè)細(xì)胞接種于Transwell孔板上室，下室加入500 μL含40%FBS的 RPMI－1640培養(yǎng)基，種板后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，取出上室，棄掉其中培養(yǎng)基，用棉簽拭凈上室內(nèi)表面細(xì)胞，浸泡于40 mL/L新鮮配置的多聚甲醛溶液中固定15 min，自然晾干后，浸泡于結(jié)晶紫中染色20 min，棉簽蘸去上室細(xì)胞，在倒置顯微鏡下放大200倍計(jì)數(shù)取景框中移至微孔膜下層的細(xì)胞。平均每個(gè)小室計(jì)數(shù)10個(gè)視野。取平均值分析細(xì)胞的穿透能力。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 MAPK通路ERK蛋白活性檢測(cè)

1.1 Western blotting結(jié)果 由圖1A看出一般培養(yǎng)基中，對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組細(xì)胞PSMA都有較強(qiáng)的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組因?yàn)镻SMA基因受干擾表達(dá)下降;實(shí)驗(yàn)組p－ERK1/2的表達(dá)明顯低于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組。含PD98059培養(yǎng)基中3組細(xì)胞p－ERK蛋白均處于低水平。圖1B為Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)軟件Adobe Photoshop CS進(jìn)行灰度分析、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后繪制的條圖。一般培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組PSMA和p－ERK1/2表達(dá)低于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組，均有顯著差異(P＜0.05);一般培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)組與含PD98059培養(yǎng)基的3組細(xì)胞p－ERK1/2表達(dá)相似。

Figure 1.The expression of PSMA and phospho－ERK1/2 were evaluated by Western blotting.A:expression of PSMA in LNCaP cells from experimental group was attenuated because of its gene silienced by RNAi and expression of phospho－ERK1/2 also declined compared to blank control and negative control.In LNCaP cells treated with PD98059，an inhibitor of ERK phosphorylation，phospho－ERK1/2 were decreased in the three groups and expression of PSMA seemed no change.B:the bar charts showed the expression of PSMA and phospho－ERK1/2.±s.n=3.*P＜0.05 vs blank and negative controls.圖1 3組細(xì)胞及磷酸化ERK抑制狀態(tài)下Western blotting檢測(cè)結(jié)果

1.2 細(xì)胞免疫化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 圖2為標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞以及各組中p－ERK1/2免疫化學(xué)和PBS陰性對(duì)照結(jié)果。一般培養(yǎng)基中，對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組染色較明顯，實(shí)驗(yàn)組染色較弱。3組細(xì)胞陽(yáng)性率的比較見(jiàn)表1，對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組相比無(wú)顯著差異;實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組、空轉(zhuǎn)組之間均有顯著學(xué)異(P＜0.01)。含PD98059培養(yǎng)基中，3組細(xì)胞染色均較淺，陽(yáng)性細(xì)胞較少，組間無(wú)顯著差異，且陽(yáng)性率與一般培養(yǎng)基中的實(shí)驗(yàn)組相似。

Figure 2.The phospho－ERK1/2 protein was tested by immuocytochemical method(×200).The images showed that without PD98059，the level of phospho－ERK1/2 in experimental group was lower than that in blank and negative controls.Treated with PD98059，the cells in all three groups expressed phospho－ERK1/2 protein at a low level and there was no obvious diffenrence among them.The cells noted as“positive”when their staining was darker than that of standard cells，and the others noted as“negative”.圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)3組細(xì)胞及PD98059抑制效應(yīng)下磷酸化ERK1/2表達(dá)

表1 3組細(xì)胞及PD98059抑制后磷酸化ERK1/2蛋白陽(yáng)性率的比較Table 1.The counting of phospho－ERK1/2 positive cells in the three groups with or without PD98059 after immunochemical staining

表2 各組細(xì)胞及PD98059處理后Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示穿透細(xì)胞數(shù)Table 2.The quantities of migrated cells in the three groups with or without PD98059(±s.n=30)

表2 各組細(xì)胞及PD98059處理后Transwell遷移實(shí)驗(yàn)顯示穿透細(xì)胞數(shù)Table 2.The quantities of migrated cells in the three groups with or without PD98059(±s.n=30)

*P ＜0.05 vs blank control and negative control.

PD98059(－)PD98059(+)Blank control Negative control Experimental 15.37 ±4.58 13.56 ±5.63 10.98 ±7.35 Blank control Negative control Experimental Cell number 40.68 ±6.39 34.33 ±5.82 12.39 ±6.52*

2 生長(zhǎng)、遷移能力檢測(cè)

2.1 MTT檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果見(jiàn)圖3。一般培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增殖能力明顯下降，種板后96 h未出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)，而對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組分別在種板后48 h出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。48 h后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組相比A492均有顯著差異(P＜0.05)。含PD98059培養(yǎng)基中，3組細(xì)胞生長(zhǎng)速度普遍較低，48 h后對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組A492分別與一般培養(yǎng)基A492相比有顯著差異。

2.2 Transwell結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組的穿透細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組明顯減少。含PD98059培養(yǎng)基中，3組細(xì)胞穿透細(xì)胞數(shù)都較少，見(jiàn)圖4A。在一般培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的侵襲能力較對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組有下降，差異顯著(P＜0.05)。含PD98059培養(yǎng)基的3組細(xì)胞與一般培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組穿透細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異，見(jiàn)圖 4、表 2。

Figure 3.The growth curves of LNCaP cells in the three groups were evaluated by MTT(A492)with or without PD 98059.The blank and negative controls without PD 98059 got into log phase of growth in 48 h，while the cells in the experimental group was still at a low level of growth.±s.n=5.*P ＜ 0.05 vs blank or negative control.圖3 MTT檢測(cè)3組細(xì)胞及在PD 98059環(huán)境中生長(zhǎng)曲線結(jié)果

Figure 4.The Transwell assay showed the migration ability of LNCaP cells of the three groups(×200).A:in normal medium，the quantity of migrated cells in experimental group was much less than those in blank and negative control groups.Treated with PD98059，the number of migrated cells in three groups was significantly decreased.B:the bar chart showed the counting result of Transwell assay.±s.n=3.*P＜0.05 vs blank contrd or negetive control.圖4 3組細(xì)胞及PD98059處理后的Transwell遷移結(jié)果

討 論

本研究對(duì)上述3組細(xì)胞在一般培養(yǎng)基及PD98059抑制效應(yīng)下進(jìn)行磷酸化ERK蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)及生長(zhǎng)、遷移能力的初步評(píng)估。在一般培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組磷酸化ERK蛋白水平相應(yīng)地低于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組，并有顯著差異;實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)遷移能力也顯著低于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組。在含有PD98059對(duì)ERK激活有抑制效應(yīng)的培養(yǎng)基中，磷酸化ERK蛋白水平均較低，生長(zhǎng)遷移能力都較弱，且與一般培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)組所表現(xiàn)出來(lái)的效應(yīng)幾乎一致。綜上所述，一般培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)組可能由于PSMA基因被沉默，細(xì)胞磷酸化ERK表達(dá)、生長(zhǎng)遷移能力低于對(duì)照組和空轉(zhuǎn)組，而用PD98059選擇性抑制ERK蛋白磷酸化后，3組細(xì)胞磷酸化ERK表達(dá)、生長(zhǎng)遷移能力都處于低水平，近似于一般培養(yǎng)基中實(shí)驗(yàn)組的效果。MAPK/ERK途徑是哺乳動(dòng)物中研究得最早、最深入的一條信號(hào)通路，是MAPK最重要的一條途徑。MAPK參與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，包括基因的轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞分化及增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、維持細(xì)胞生存以及細(xì)胞惡性化等。目前許多研究［5－8］支持 MAPK/ERK途徑的激活與前列腺癌生物學(xué)行為，惡化呈正相關(guān)。因此，我們推測(cè)PSMA可能是通過(guò)上調(diào)MAPK/ERK途徑的活性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移的正性調(diào)節(jié);抑制該通路磷酸化過(guò)程，PSMA的上調(diào)效應(yīng)隨之減弱或消失。

PSMA是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，由前列腺上皮細(xì)胞分泌，其氨基端位于細(xì)胞膜內(nèi)，分子量約為100 kD，共含750個(gè)氨基酸，其中胞外段707個(gè)，跨膜段24個(gè)，胞內(nèi)段19個(gè)。人PSMA基因全長(zhǎng)62 035 bp，定位于染色體11p11－p12，包括19個(gè)外顯子和18個(gè)內(nèi)含子，其cDNA全長(zhǎng)2 650 kb。PSMA在正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌組織中均有表達(dá)，其中在前列腺癌組織中表達(dá)水平明顯升高，并且與Gleason評(píng)分存在相關(guān)性，在轉(zhuǎn)移性癌及非激素依賴型前列腺癌組織中表達(dá)水平更高［9］。PSMA在多種非前列腺惡性腫瘤脈管系統(tǒng)中也有一定表達(dá)，這些惡性腫瘤主要包括腎細(xì)胞癌、膀胱移行細(xì)胞癌、睪丸胚胎瘤、結(jié)腸腺癌、非小細(xì)胞肺癌等［10，11］，而在前列腺外的其它正常組織，如膀胱、腎臟近端小管、肝臟、食管、近端小腸等，則處于較低水平的表達(dá)，其濃度相比在前列腺組織平均要低2－3個(gè)數(shù)量級(jí)［12，13］。

PSMA不僅具有多種蛋白酶活性，參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取，而且參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞的內(nèi)化作用，故推斷其可能是一多功能蛋白［14］。其蛋白酶活性主要為谷氨酸羧肽酶Ⅱ的活性。其它不同領(lǐng)域?qū)SMA的研究導(dǎo)致其命名有所不同:在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與腦神經(jīng)遞質(zhì)N－乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)的代謝，被命名為N－乙?；粒B接酸性二肽酶(NAALADase)［15］;在近端小腸，能從多聚 γ 谷氨酸葉酸鹽水解下末端谷氨酸，被命名為葉酸水解酶(FOLH)［16］。然而我們認(rèn)識(shí)到PSMA的酶活性在2種底物中是相同的，都是水解末端谷氨酸，而谷氨酸的釋放可能對(duì)激活細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起作用。由于PSMA的水解作用，游離出來(lái)的谷氨酸可以激活細(xì)胞膜上的谷氨酸受體［17］，調(diào)節(jié) K+、Ca2+通道改變靜息電位，進(jìn)一步導(dǎo)致Ca2+的持續(xù)內(nèi)流［18］。內(nèi)流Ca2+可能通過(guò)多種途徑激活 Ras蛋白［19］，隨之級(jí)聯(lián)激活Ras/Raf－1/MEK/ERK細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即 MAPK/ERK途徑。由此，我們認(rèn)為磷酸化ERK的激活可能是由于PSMA的水解活性，通過(guò)谷氨酸及Ca2+介導(dǎo)，激活ERK蛋白，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。本研究在一般培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組的LNCaP細(xì)胞PSMA被沉默而表達(dá)下調(diào)，隨之ERK蛋白活性降低，導(dǎo)致了生長(zhǎng)、遷移能力的下降;受PD98059對(duì)ERK活化的抑制作用后，對(duì)照組、空轉(zhuǎn)組的生長(zhǎng)、遷移行為也在較低水平。

PSMA與前列腺癌的惡性程度存在一定相關(guān)性，說(shuō)明研究PSMA在前列腺癌的生長(zhǎng)遷移及前列腺癌發(fā)生機(jī)制中的作用具有重要意義。既往國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)PSMA的研究主要集中于其高特異性瘤標(biāo)的臨床應(yīng)用上，對(duì)其潛在功能沒(méi)有明確系統(tǒng)的研究，本研究顯示PSMA可能有促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移能力的作用，并推測(cè)與MAPK/ERK途徑被激活有關(guān)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于PSMA對(duì)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的作用存在分歧［20－23］，然而 Yao 等［24］指出存在差異的原因可能與細(xì)胞培養(yǎng)外環(huán)境的葉酸水平有關(guān)，低于或正常生理量葉酸情況下PSMA可能是由于其酶學(xué)活性導(dǎo)致對(duì)前列腺癌細(xì)胞的正性調(diào)節(jié);遠(yuǎn)高于生理量的葉酸環(huán)境掩蓋了其酶學(xué)活性可能會(huì)導(dǎo)致PSMA對(duì)前列腺癌負(fù)性調(diào)節(jié)的發(fā)生。雖然本研究使用的RPMI－1640培養(yǎng)基高于生理量，但可能由于實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞的饑餓處理和換液間隔較長(zhǎng)，使得葉酸水平下降，因此結(jié)果提示PSMA在LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移呈正性調(diào)節(jié)作用，并指出可能與MAPK/ERK途徑的活化有關(guān)。PSMA在前列腺癌中的作用及其調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明，本研究為更深入研究這一機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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