費(fèi)洪榮， 陳洪蕾， 辛?xí)悦鳎?趙雪梅， 王鳳澤△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院，2生物科學(xué)學(xué)院，山東泰安271016)

胃癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居各類腫瘤的首位，其預(yù)防和治療目前仍不樂觀。與大多數(shù)癌癥一樣，胃癌的發(fā)生也非常復(fù)雜，受細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的精密調(diào)控，與基因突變和外界環(huán)境密切相關(guān)［1，2］。磷脂酰肌醇 3 － 激酶(phosphatidylinositol－3－kinases，PI3K)信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［3，4］。蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)是PI3K的主要下游效應(yīng)分子之一，可通過調(diào)節(jié)包括核因子κB(nuclear factor kappa B，NF－κB)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子參與多種生命活動(dòng)。有研究表明PI3K/Akt途徑的活化參與多種腫瘤的發(fā)生，抑制該通路可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和抑制腫瘤的生長(zhǎng)［5］。因此，PI3K/Akt已成為一個(gè)很有希望的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。

目前，已有多種PI3K/Akt抑制劑用于腫瘤的抑制實(shí)驗(yàn)研究中，如以 p110催化亞基為靶點(diǎn)的LY294002和wortmannin［6］。雖然細(xì)胞毒性的存在和交叉反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用，但是LY294002和wortmannin證明了PI3K/Akt信號(hào)通路的臨床治療價(jià)值。基于抑制mTOR存在著反饋激活A(yù)kt的現(xiàn)象，直接選擇抑制Akt或許更有效果。Perifosine是一雜環(huán)的烷基磷酸膽堿，可作用于Akt的PH同源結(jié)構(gòu)域來抑制Akt的活性，表現(xiàn)出良好的抑制乳腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤活性［7，8］。本研究以胃癌細(xì)胞 SGC －7901為實(shí)驗(yàn)材料，探討新型Akt抑制劑perifosine的體外抗腫瘤活性，為胃癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)理論指導(dǎo)。

材料和方法

1 材料

1.1 主要試劑 Perifosine購(gòu)自 Selleck Chemicals;RPMI－1640培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco;胎牛血清購(gòu)自Hy-Clone;MTT購(gòu)自Genview;propidium iodine(PI)購(gòu)自Sigma;Annexin V－FITC購(gòu)自南京凱基生物有限公司;ECL試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific Pierce。Akt抗體、p－Akt抗體、caspase－3抗體、caspase－9抗體和多聚(ADP－核糖)聚合酶［poly(ADP－ribose)poly merase，PARP］抗體購(gòu)自 Cell Signaling Technology;β－actin抗體購(gòu)自Sigma;Bcl－2抗體購(gòu)自Bioworld，Bax抗體、cyclin B1抗體、cyclin D1抗體購(gòu)自Santa Cruz;p21抗體購(gòu)自NeoMarkers;Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋。

1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC－7901購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。SGC－7901細(xì)胞于37℃和5%CO2條件下用RPMI－1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，含有10%胎牛血清、1 ×105U·L－1青霉素和 1 ×105μg·L－1硫酸鏈霉素。

2 方法

2.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 胰酶消化SGC－7901細(xì)胞后接種于96孔板中，加入不同劑量的perifosine繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)照組加入PBS;終止培養(yǎng)前4 h加20 μL(5 g·L－1)的MTT于各個(gè)孔中，然后吸去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO后室溫振蕩10 min;490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的A值，以同樣的方法測(cè)6個(gè)平行孔，對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡 細(xì)胞用perifosine處理后，胰酶消化并制備細(xì)胞懸液;加入75%的冷無水乙醇4℃固定18 h后用PBS洗2次，加入終濃度為 50 mg·L－1RNase A，37 ℃ 30 min，加入終濃度為50 mg·L－1PI，4℃閉光染色30 min后上機(jī)檢測(cè)。用Cell Quest軟件分析各組細(xì)胞的周期分布，分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例。同時(shí)按照試劑盒說明進(jìn)行AnnexinⅤ－FITC/PI法測(cè)定細(xì)胞凋亡，根據(jù)AnnexinⅤ和PI的熒光強(qiáng)度計(jì)算凋亡百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 免疫印跡分析 預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次后加入細(xì)胞裂解液［10 mmol·L－1Tris－ HCl(pH 8.0)，1 mmol·L－1EDTA，150 mmol·L－1NaCl，1%NP －40，1 mmol·L－1PMSF，0.5%SDS，1∶100 protease inhibitor cocktails］，冰上放置 20 min，4 ℃ 13 000 ×g離心20 min，收集上清定量分析。取40 μg總蛋白進(jìn)行SDS－PAGE實(shí)驗(yàn)，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入Ⅰ抗;室溫孵育3 h后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h，PBST洗膜，ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 Perifosine抑制SGC－7901細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化

圖1所示，perifosine抑制Akt的磷酸化水平，且抑制作用呈劑量依賴性，對(duì)總Akt的表達(dá)量無明顯抑制作用。

2 Perifosine抑制SGC－7901胃癌細(xì)胞增殖

用perifosine處理SGC－7901細(xì)胞72 h，MTT法每隔24 h檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果見圖2，perifosine具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的活性，且抑制活性呈時(shí)間和劑量依賴性。表1和圖3所示，SGC－7901細(xì)胞經(jīng)perifosine處理后，導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G2/M期。

Figure 1.Western blotting analysis of p－Akt and total Akt levels in SGC－7901 cells treated with increasing concentrations of perifosine for 24 h.β－actin served as loading control.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖1 免疫印跡檢測(cè)perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞中p－Akt表達(dá)水平的影響

Figure 2.Perifosine inhibited cell growth in human gastric cell line SGC－7901.The cells were incubated with vehicle，1.0 μmol/L，2.5 μmol/L or 5.0 μmol/L of perifosine for 72 h and the cell growth was determined by the MTT assay every 24 h.±s.n=6.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.圖2 MTT法檢測(cè)perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞增殖的抑制作用

免疫印跡的結(jié)果表明，perifosine可上調(diào)胃癌細(xì)胞中p21的表達(dá)，見圖4。Perifosine抑制細(xì)胞周期與cyclin B1相關(guān)，對(duì)cyclin D1的表達(dá)無顯著影響。

3 Perifosine誘導(dǎo)SGC－7901胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡

Perifosine可明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡，且誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性，見圖5。

免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，perifosine作用胃癌細(xì)胞后，促使細(xì)胞內(nèi)pro－caspase－9和pro－caspase－3剪切成活性形式，最終將PARP切割成85 kD的產(chǎn)物，見圖6。同時(shí)，perifosine抑制了SGC－7901細(xì)胞中Bcl－2蛋白的表達(dá)水平，而增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量，見圖6。

討 論

PI3K/Akt信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、凋亡和代謝等生命過程密切相關(guān)，該途徑中多個(gè)基因在腫瘤中發(fā)生突變，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。本研究中，我們首先采用免疫印跡法檢測(cè)perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞中Akt磷酸化水平的影響，發(fā)現(xiàn)perifosine具有抑制Akt磷酸化的活性(圖1);同時(shí)抑制了胃癌細(xì)胞的增殖，且抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性(圖2)。

表1 Perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞周期的影響Table 1.Effect of perifosine on cell cycle in SGC－7901 cells(%.±s.n=3)

表1 Perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞周期的影響Table 1.Effect of perifosine on cell cycle in SGC－7901 cells(%.±s.n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Perifosine(μmol/L) G0/G1 G2/M S Control 53.16 ±1.73 19.77 ±1.86 27.91 ±1.55 Perifosine 1.0 50.90 ±1.66 21.25 ±1.27 28.01 ±0.91 2.5 47.86 ±2.38* 36.19 ±2.92＊＊ 16.35 ±1.21＊＊5.0 48.13 ±3.66 33.73 ±3.02＊＊ 18.59 ±1.96*

Figure 3.Perifosine induces G2phase arrest in SGC －7901 cells.For the cell cycle analysis，cells were seeded at 3×105per well in six － well plates in triplicates and incubated with perifosine(0 μmol/L，1.0 μmol/L，2.5 μmol/L or 5.0 μmol/L).After treated with perifosine for 24 h，cells were fixed，permeabilized，stained with PI and analyzed by flow cytometry.圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析perfosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞周期的影響

Figure 4.Perifosine down－regulated cyclin B1 level and up－regulates p21 expression in gastric cancer cells.Cells were cultured for 24 h in the presence of increasing doses of perifosine.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖4 免疫印跡檢測(cè)SGC－7901細(xì)胞中p21、cyclin B1和cyclin D1的表達(dá)水平

Figure 5.Perifosine induced dose－dependent apoptosis in SGC－7901 human gastric cancer cells.Annexin V－FITC/PI staining was used to analyze the apoptosis of SGC－7901 cells treated with perifosine.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖5 Perifosine誘導(dǎo)SGC－7901細(xì)胞發(fā)生凋亡

Figure 6.Western blotting analysis of expression of caspase and Bcl－2 family members in SGC －7901 cells treated with perifosine.β－actin served as loading control.±s.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖6 免疫印跡檢測(cè)perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

為了進(jìn)一步闡明perifosine抑制胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制，流式細(xì)胞術(shù)分析了perifosine對(duì)細(xì)胞周期的影響，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞經(jīng)perifosine處理后，細(xì)胞阻滯于G2期(圖3)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明perifosine誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯與上調(diào)p21的蛋白水平和抑制cyclinB1的表達(dá)密切相關(guān)(圖4)。

接著，磷脂酰絲氨酸外翻分析法檢測(cè)perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)perifosine可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象(圖5)。細(xì)胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑均可導(dǎo)致caspase的活化。Caspase是一類半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞經(jīng)凋亡誘導(dǎo)后，釋放到細(xì)胞液中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf－1)聚合成多聚復(fù)合物，并促使pro－caspase－9與該復(fù)合物結(jié)合形成凋亡小體而激活procaspase－9，活化的caspase－9又可激活 caspase－3，發(fā)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)［9］。因此，我們采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了perifosine對(duì)SGC－7901細(xì)胞內(nèi)caspase－3和－9表達(dá)的影響，結(jié)果顯示perifosine的凋亡誘導(dǎo)活性與胱天蛋白酶家族成員中caspase－3和－9的活化密切相關(guān);與此同時(shí)，活化的caspase－3也將PARP切割成小片段(圖6)。Bcl－2家族成員在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要的作用［10］。Bcl－2家族是目前研究最廣泛的一類細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白因子，Bax是該家族中凋亡蛋白代表，過表達(dá)可使多種細(xì)胞發(fā)生自發(fā)凋亡，Bcl－2則作為抗凋亡蛋白與Bax結(jié)合成異構(gòu)二聚體存在于細(xì)胞中，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［9］。免疫印跡結(jié)果表明，perifosine作用于SGC－7901細(xì)胞后，Bax蛋白的表達(dá)水平明顯升高，而凋亡抑制蛋白Bcl－2的表達(dá)則受到抑制(圖6)，提示perifosine誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡可能與調(diào)節(jié)Bcl－2家族蛋白因子的平衡密切相關(guān)。

總之，perifosine能夠抑制胃癌細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，既可抑制SGC－7901胃癌細(xì)胞的增殖，又可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和激活胱天蛋白酶家族關(guān)鍵成員的活性有關(guān)。我們的研究結(jié)果為perifosine的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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