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        Akt抑制劑perifosine抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究*

        2011-01-30 03:58:00費(fèi)洪榮陳洪蕾辛?xí)悦?/span>趙雪梅王鳳澤
        中國(guó)病理生理雜志 2011年6期
        關(guān)鍵詞:胃癌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

        費(fèi)洪榮, 陳洪蕾, 辛?xí)悦鳎?趙雪梅, 王鳳澤△

        (泰山醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院,2生物科學(xué)學(xué)院,山東泰安271016)

        胃癌是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率居各類腫瘤的首位,其預(yù)防和治療目前仍不樂觀。與大多數(shù)癌癥一樣,胃癌的發(fā)生也非常復(fù)雜,受細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路的精密調(diào)控,與基因突變和外界環(huán)境密切相關(guān)[1,2]。磷脂酰肌醇 3 - 激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等過程,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[3,4]。蛋白激酶 B(protein kinase B,PKB/Akt)是PI3K的主要下游效應(yīng)分子之一,可通過調(diào)節(jié)包括核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子參與多種生命活動(dòng)。有研究表明PI3K/Akt途徑的活化參與多種腫瘤的發(fā)生,抑制該通路可誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡和抑制腫瘤的生長(zhǎng)[5]。因此,PI3K/Akt已成為一個(gè)很有希望的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。

        目前,已有多種PI3K/Akt抑制劑用于腫瘤的抑制實(shí)驗(yàn)研究中,如以 p110催化亞基為靶點(diǎn)的LY294002和wortmannin[6]。雖然細(xì)胞毒性的存在和交叉反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用,但是LY294002和wortmannin證明了PI3K/Akt信號(hào)通路的臨床治療價(jià)值。基于抑制mTOR存在著反饋激活A(yù)kt的現(xiàn)象,直接選擇抑制Akt或許更有效果。Perifosine是一雜環(huán)的烷基磷酸膽堿,可作用于Akt的PH同源結(jié)構(gòu)域來抑制Akt的活性,表現(xiàn)出良好的抑制乳腺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤活性[7,8]。本研究以胃癌細(xì)胞 SGC -7901為實(shí)驗(yàn)材料,探討新型Akt抑制劑perifosine的體外抗腫瘤活性,為胃癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)理論指導(dǎo)。

        材料和方法

        1 材料

        1.1 主要試劑 Perifosine購(gòu)自 Selleck Chemicals;RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco;胎牛血清購(gòu)自Hy-Clone;MTT購(gòu)自Genview;propidium iodine(PI)購(gòu)自Sigma;Annexin V-FITC購(gòu)自南京凱基生物有限公司;ECL試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific Pierce。Akt抗體、p-Akt抗體、caspase-3抗體、caspase-9抗體和多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)poly merase,PARP]抗體購(gòu)自 Cell Signaling Technology;β-actin抗體購(gòu)自Sigma;Bcl-2抗體購(gòu)自Bioworld,Bax抗體、cyclin B1抗體、cyclin D1抗體購(gòu)自Santa Cruz;p21抗體購(gòu)自NeoMarkers;Ⅱ抗均購(gòu)自北京中杉金橋。

        1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株SGC-7901購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。SGC-7901細(xì)胞于37℃和5%CO2條件下用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng),含有10%胎牛血清、1 ×105U·L-1青霉素和 1 ×105μg·L-1硫酸鏈霉素。

        2 方法

        2.1 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 胰酶消化SGC-7901細(xì)胞后接種于96孔板中,加入不同劑量的perifosine繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)照組加入PBS;終止培養(yǎng)前4 h加20 μL(5 g·L-1)的MTT于各個(gè)孔中,然后吸去培養(yǎng)液,加入150 μL DMSO后室溫振蕩10 min;490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的A值,以同樣的方法測(cè)6個(gè)平行孔,對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期與凋亡 細(xì)胞用perifosine處理后,胰酶消化并制備細(xì)胞懸液;加入75%的冷無水乙醇4℃固定18 h后用PBS洗2次,加入終濃度為 50 mg·L-1RNase A,37 ℃ 30 min,加入終濃度為50 mg·L-1PI,4℃閉光染色30 min后上機(jī)檢測(cè)。用Cell Quest軟件分析各組細(xì)胞的周期分布,分析G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞所占比例。同時(shí)按照試劑盒說明進(jìn)行AnnexinⅤ-FITC/PI法測(cè)定細(xì)胞凋亡,根據(jù)AnnexinⅤ和PI的熒光強(qiáng)度計(jì)算凋亡百分率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        2.3 免疫印跡分析 預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次后加入細(xì)胞裂解液[10 mmol·L-1Tris- HCl(pH 8.0),1 mmol·L-1EDTA,150 mmol·L-1NaCl,1%NP -40,1 mmol·L-1PMSF,0.5%SDS,1∶100 protease inhibitor cocktails],冰上放置 20 min,4 ℃ 13 000 ×g離心20 min,收集上清定量分析。取40 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE實(shí)驗(yàn),電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜,加入Ⅰ抗;室溫孵育3 h后加入Ⅱ抗室溫孵育1 h,PBST洗膜,ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

        3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié) 果

        1 Perifosine抑制SGC-7901細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化

        圖1所示,perifosine抑制Akt的磷酸化水平,且抑制作用呈劑量依賴性,對(duì)總Akt的表達(dá)量無明顯抑制作用。

        2 Perifosine抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞增殖

        用perifosine處理SGC-7901細(xì)胞72 h,MTT法每隔24 h檢測(cè)細(xì)胞活力,結(jié)果見圖2,perifosine具有抑制胃癌細(xì)胞增殖的活性,且抑制活性呈時(shí)間和劑量依賴性。表1和圖3所示,SGC-7901細(xì)胞經(jīng)perifosine處理后,導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于G2/M期。

        Figure 1.Western blotting analysis of p-Akt and total Akt levels in SGC-7901 cells treated with increasing concentrations of perifosine for 24 h.β-actin served as loading control.±s.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖1 免疫印跡檢測(cè)perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞中p-Akt表達(dá)水平的影響

        Figure 2.Perifosine inhibited cell growth in human gastric cell line SGC-7901.The cells were incubated with vehicle,1.0 μmol/L,2.5 μmol/L or 5.0 μmol/L of perifosine for 72 h and the cell growth was determined by the MTT assay every 24 h.±s.n=6.*P<0.05,**P <0.01 vs control.圖2 MTT法檢測(cè)perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制作用

        免疫印跡的結(jié)果表明,perifosine可上調(diào)胃癌細(xì)胞中p21的表達(dá),見圖4。Perifosine抑制細(xì)胞周期與cyclin B1相關(guān),對(duì)cyclin D1的表達(dá)無顯著影響。

        3 Perifosine誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡

        Perifosine可明顯誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡,且誘導(dǎo)作用呈劑量依賴性,見圖5。

        免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,perifosine作用胃癌細(xì)胞后,促使細(xì)胞內(nèi)pro-caspase-9和pro-caspase-3剪切成活性形式,最終將PARP切割成85 kD的產(chǎn)物,見圖6。同時(shí),perifosine抑制了SGC-7901細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平,而增加促凋亡蛋白Bax的表達(dá)量,見圖6。

        討 論

        PI3K/Akt信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、凋亡和代謝等生命過程密切相關(guān),該途徑中多個(gè)基因在腫瘤中發(fā)生突變,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。本研究中,我們首先采用免疫印跡法檢測(cè)perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞中Akt磷酸化水平的影響,發(fā)現(xiàn)perifosine具有抑制Akt磷酸化的活性(圖1);同時(shí)抑制了胃癌細(xì)胞的增殖,且抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性(圖2)。

        表1 Perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響Table 1.Effect of perifosine on cell cycle in SGC-7901 cells(%.±s.n=3)

        表1 Perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響Table 1.Effect of perifosine on cell cycle in SGC-7901 cells(%.±s.n=3)

        *P <0.05,**P <0.01 vs control group.

        Group Perifosine(μmol/L) G0/G1 G2/M S Control 53.16 ±1.73 19.77 ±1.86 27.91 ±1.55 Perifosine 1.0 50.90 ±1.66 21.25 ±1.27 28.01 ±0.91 2.5 47.86 ±2.38* 36.19 ±2.92** 16.35 ±1.21**5.0 48.13 ±3.66 33.73 ±3.02** 18.59 ±1.96*

        Figure 3.Perifosine induces G2phase arrest in SGC -7901 cells.For the cell cycle analysis,cells were seeded at 3×105per well in six - well plates in triplicates and incubated with perifosine(0 μmol/L,1.0 μmol/L,2.5 μmol/L or 5.0 μmol/L).After treated with perifosine for 24 h,cells were fixed,permeabilized,stained with PI and analyzed by flow cytometry.圖3 流式細(xì)胞術(shù)分析perfosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響

        Figure 4.Perifosine down-regulated cyclin B1 level and up-regulates p21 expression in gastric cancer cells.Cells were cultured for 24 h in the presence of increasing doses of perifosine.±s.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖4 免疫印跡檢測(cè)SGC-7901細(xì)胞中p21、cyclin B1和cyclin D1的表達(dá)水平

        Figure 5.Perifosine induced dose-dependent apoptosis in SGC-7901 human gastric cancer cells.Annexin V-FITC/PI staining was used to analyze the apoptosis of SGC-7901 cells treated with perifosine.±s.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖5 Perifosine誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生凋亡

        Figure 6.Western blotting analysis of expression of caspase and Bcl-2 family members in SGC -7901 cells treated with perifosine.β-actin served as loading control.±s.n=3.*P<0.05,**P<0.01 vs perifosine 0 μmol/L.圖6 免疫印跡檢測(cè)perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

        為了進(jìn)一步闡明perifosine抑制胃癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制,流式細(xì)胞術(shù)分析了perifosine對(duì)細(xì)胞周期的影響,發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞經(jīng)perifosine處理后,細(xì)胞阻滯于G2期(圖3)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明perifosine誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯與上調(diào)p21的蛋白水平和抑制cyclinB1的表達(dá)密切相關(guān)(圖4)。

        接著,磷脂酰絲氨酸外翻分析法檢測(cè)perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響,發(fā)現(xiàn)perifosine可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生明顯的凋亡現(xiàn)象(圖5)。細(xì)胞凋亡的線粒體途徑和死亡受體途徑均可導(dǎo)致caspase的活化。Caspase是一類半胱氨酸蛋白酶,在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞經(jīng)凋亡誘導(dǎo)后,釋放到細(xì)胞液中的細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)聚合成多聚復(fù)合物,并促使pro-caspase-9與該復(fù)合物結(jié)合形成凋亡小體而激活procaspase-9,活化的caspase-9又可激活 caspase-3,發(fā)生誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。因此,我們采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了perifosine對(duì)SGC-7901細(xì)胞內(nèi)caspase-3和-9表達(dá)的影響,結(jié)果顯示perifosine的凋亡誘導(dǎo)活性與胱天蛋白酶家族成員中caspase-3和-9的活化密切相關(guān);與此同時(shí),活化的caspase-3也將PARP切割成小片段(圖6)。Bcl-2家族成員在線粒體凋亡途徑中發(fā)揮重要的作用[10]。Bcl-2家族是目前研究最廣泛的一類細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白因子,Bax是該家族中凋亡蛋白代表,過表達(dá)可使多種細(xì)胞發(fā)生自發(fā)凋亡,Bcl-2則作為抗凋亡蛋白與Bax結(jié)合成異構(gòu)二聚體存在于細(xì)胞中,與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[9]。免疫印跡結(jié)果表明,perifosine作用于SGC-7901細(xì)胞后,Bax蛋白的表達(dá)水平明顯升高,而凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)則受到抑制(圖6),提示perifosine誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡可能與調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白因子的平衡密切相關(guān)。

        總之,perifosine能夠抑制胃癌細(xì)胞中Akt的磷酸化水平,既可抑制SGC-7901胃癌細(xì)胞的增殖,又可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡,其機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)水平和激活胱天蛋白酶家族關(guān)鍵成員的活性有關(guān)。我們的研究結(jié)果為perifosine的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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