劉嘉偉， 張劍威， 楊廣鑫， 陳淑英， 方樂堃， 梁 廣， 肖 健， 楊惠玲△

(1中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510080;2溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江溫州325000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)在中國珠江三角洲一帶發(fā)病率居世界第1位，是一種惡性程度較高、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤。目前對鼻咽癌的治療主要以放療為主，輔以化療。盡管放療技術(shù)幾經(jīng)改良，但NPC患者5年生存率仍僅有50%－60%，輻射抗拒導(dǎo)致常規(guī)放療后局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移是制約NPC患者5年生存率提高的關(guān)鍵。因此，尋找對放療后殘存輻射抗拒鼻咽癌細胞有效的藥物及治療方法成為了臨床治療鼻咽癌的重點。鼻咽癌細胞系CNE－2R是本室對鼻咽癌細胞系CNE－2采用爬坡式間歇性大劑量X線誘導(dǎo)構(gòu)建的與CNE－2具有相同遺傳背景、不同輻射抗拒的鼻咽癌輻射抗拒細胞模型［1］，由于它與臨床長期放療后的殘存輻射抗拒細胞具有相似性，故可通過此細胞來篩選對輻射抗拒鼻咽癌有效的治療方法。

近來研究表明姜黃素(curcumin)可有效地抑制多種腫瘤細胞的增殖與促使凋亡的發(fā)生，且能使某些腫瘤細胞的細胞周期停滯于G2/M期［2，3］，推測其具有放療增敏作用。由于人體對姜黃素的吸收及生物利用度低［2］，且其分子結(jié)構(gòu)簡單，以增強其生物活性為目的的衍生物變構(gòu)研究吸引了國內(nèi)外藥物研發(fā)機構(gòu)的關(guān)注。B50是梁廣等［4］改構(gòu)的姜黃素衍生物之一，它可能具有類似姜黃素的作用特點及機制，初篩表明B50具有廣譜抗腫瘤效應(yīng)，然而B50是否具有逆轉(zhuǎn)輻射抗拒作用尚未見報道。本文擬通過比較B50對同源不同輻射抗拒鼻咽癌細胞增殖、凋亡及線粒體膜電位作用的差異，以探討其在逆轉(zhuǎn)輻射抗拒鼻咽癌臨床治療中潛在價值。

材料和方法

1 材料

CNE－2由中山大學(xué)腫瘤防治中心提供，CNE－2R為本室自行構(gòu)建細胞株，培養(yǎng)時接種于含胎牛血清10%的雙抗RPMI－1640培養(yǎng)基(分別含100 kU/L的青霉素與鏈霉素)中，置37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以25 g/L的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗;B50由溫州醫(yī)學(xué)院提供，純度93.4%，溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma)配成藥物母液，常溫下避光保存，用時以無血清培養(yǎng)基配成所需濃度的工作液，藥物工作液中DMSO體積分?jǐn)?shù)小于0.1%;胎牛血清(fetal calf serum，杭州四季青生物工程材料有限公司);RPMI－1640培養(yǎng)基(Gibco);3－(4，5－二甲基噻唑－2)－2，5－二苯基四氮唑溴鹽［3－(4，5－dimethylthiazol－2－yl)－2，5－diphenyltetrazolium bromide，MTT］和胰酶(華美生物工程公司);Rh123(Sigma);全自動酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃MultiskanMK3酶標(biāo)儀);ELITE流式細胞儀為Beckman產(chǎn)品。

2 MTT法檢測細胞活力

收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為3×107cells/L，每孔加入 100 μL。5%CO2，37 ℃ 孵育24 h待細胞貼壁，吸去板內(nèi)培養(yǎng)基殘液，于各藥物濃度組加入相應(yīng)濃度 B50(20、10、5、2.5、1.25 μmol/L)，實驗對照組及空白組加入無血清培養(yǎng)基，以上液體均為每孔加入200 μL，各組重復(fù)6孔，實驗重復(fù)3次。分別孵育 24、48、72 h，此后加入 20 μL/well的MTT溶液(MTT按5 g/L濃度溶于 0.01 mol/L，pH7.2的 PBS，避光 4℃ 保存)，繼續(xù)在 5%CO2、37℃下孵育4 h。輕輕甩出板內(nèi)液體，每孔加入150 μL DMSO，此后96孔板避光置搖床上低速振蕩10 min并用排槍輕輕吹打均勻，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀波長570 nm處測量各孔的吸光值。腫瘤活力抑制率=(實驗對照組A值－處理組A值)/(實驗對照組A值－空白組A值)×100%。

3 集落形成實驗檢測細胞增殖能力

收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度為3×105cells/L，每孔滴加1 mL懸液接種于6孔板，24 h后吸去孔內(nèi)殘留培養(yǎng)基，按藥物濃度(5、2.5、1.25、0.625、0.3125 μmol/L)分別加入 B50 于相應(yīng)孔內(nèi)，藥物組每孔加入藥液2 mL，對照組每孔加入2 mL無血清培養(yǎng)基，每組重復(fù)3孔。藥物作用48 h后吸去孔內(nèi)殘液，加入10%胎牛血清培養(yǎng)基3 mL/well繼續(xù)培養(yǎng)直至對照組出現(xiàn)肉眼可見集落為止。吸去孔內(nèi)殘液后以0.01 mol/L、pH 7.2的PBS沖洗各孔2次，甲醇溶液固定15 min，吉姆薩染色15 min，自來水沖洗3至5次，顯微鏡下觀察細胞集落長成情況，細胞數(shù)≥50的為一集落。腫瘤增殖抑制率=(實驗對照組集落數(shù)均值－處理組集落數(shù)均值)/實驗對照組集落數(shù)均值×100%。

4 流式細胞儀測細胞周期分布

調(diào)整B50作用終濃度為2.5 μmol/L，對細胞作用48 h后胰酶消化收集細胞，各待檢標(biāo)本保證細胞總數(shù)不少于106個，離心棄上清以75%乙醇固定4℃過夜，第2 d離心棄上清，PBS洗2遍后以含碘化丙啶(propidium iodide/PI)100 mg/L和RNase酶100 mg/L的染色液0.5 mL在4℃下避光染色30 min，染色結(jié)束后以ELITE(Beckman)流式細胞儀檢測細胞周期。

5 Annexin V/PI雙標(biāo)法測細胞凋亡

調(diào)整B50作用終濃度為10 μmol/L，對細胞作用24 h后胰酶消化收集細胞，各待檢標(biāo)本保證細胞總數(shù)不少于106個，離心棄上清以PBS洗2遍，將細胞重懸于 binding buffer中，加入 10 μL Annexin VFITC，輕輕混勻，室溫避光情況下反應(yīng)15 min染色，再加入5 μL PI，結(jié)束后以 ELITE(Beckman)流式細胞儀檢測細胞凋亡，其中將Annexin V染色陽性、PI染色陰性的細胞群歸為早期凋亡細胞，而將Annexin V染色陽性、PI染色陽性的細胞群歸為晚期凋亡與壞死細胞。

6 Rh123標(biāo)記測細胞線粒體膜電位

調(diào)整B50作用終濃度為10 μmol/L，對細胞作用24 h后胰酶消化收集細胞，各待檢標(biāo)本保證細胞總數(shù)不少于106個，離心棄上清以PBS洗2遍，將細胞重懸于Rh123終濃度為100 μg/L的2 mL染液中，37℃下避光染色45 min，結(jié)束后以 ELITE(Beckman)流式細胞儀檢測細胞線粒體膜電位。

7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，連續(xù)型數(shù)據(jù)的組間比較采用方差分析，離散型數(shù)據(jù)的組間比較采用χ2檢驗。

結(jié) 果

1 B50抑制CNE－2與CNE－2R細胞活力的比較

B50作用24、48、72 h后，CNE －2及 CNE －2R細胞活力的抑制率呈濃度時間依賴性，見圖1。采用Bliss算法軟件統(tǒng)計得到B50作用于CNE－2及CNE－2R 細胞24 h、48 h、72 h 的 IC50，見表 1，其中 B50作用于CNE－2細胞72 h的IC50低于CNE－2R，兩者相比差異顯著(n=18，P＜0.01)。

Figure 1.The inhibitory effect of B50 at various concentrations on cell viability of CNE－2 cell line(A)and CNE－2R cell line(B)after 24 h，48 h and 72 h treatment.±s.n=18.圖1 不同濃度B50作用24、48、72 h后對CNE－2及CNE－2R的細胞活力抑制率

表1 B50作用于CNE－2及CNE－2R細胞24 h、48 h、72 h后細胞活力的IC50比較Table 1.The IC50of B50 on cell viability of CNE－2 and CNE－2R cell lines after 24 h，48 h and 72 h treatment(MTT assay)(μmol/L.±s.n=18)

表1 B50作用于CNE－2及CNE－2R細胞24 h、48 h、72 h后細胞活力的IC50比較Table 1.The IC50of B50 on cell viability of CNE－2 and CNE－2R cell lines after 24 h，48 h and 72 h treatment(MTT assay)(μmol/L.±s.n=18)

＊＊P ＜0.01 vs CNE －2.

Cell line 24 h 48 h 72 h CNE －2 8.18 ±0.12 3.00 ±0.04 1.75 ±0.01 CNE －2R 8.06 ±0.14 2.49 ±0.02＊＊ 1.42 ±0.02＊＊

2 B50抑制CNE－2與CNE－2R細胞增殖能力的比較

B50作用24、48、72 h后，CNE －2與 CNE －2R細胞增殖能力的抑制率呈濃度依賴性，見表2。采用Bliss算法軟件統(tǒng)計得到B50對CNE－2作用48 h后細胞增殖的 IC50為(0.82±0.01)μmol/L，而其對CNE－2R作用48 h后細胞增殖的IC50為(0.55±0.01)μmol/L，兩者相比差異顯著(n=3，P ＜0.01)。

表2 B50作用于CNE－2及CNE－2R細胞48h后細胞增殖的IC50比較Table 2.The IC50of B50 on cell growth of CNE－2 and CNE－2R cell lines after 48 h treatment(colony－forming experiment)(±s.n=3)

表2 B50作用于CNE－2及CNE－2R細胞48h后細胞增殖的IC50比較Table 2.The IC50of B50 on cell growth of CNE－2 and CNE－2R cell lines after 48 h treatment(colony－forming experiment)(±s.n=3)

Concentration of B50(μmol/L)Inhibitory rate of cell growth(%)CNE－2 CNE－2R 5 96.92 ±1.12 99.09 ±0.59 2.5 96.83 ±0.85 98.84 ±0.67 1.25 79.48 ±2.10 95.99 ±1.75 0.625 40.76 ±3.93 64.94 ±2.75 0.3125 －4.20 ±2.60 10.74 ±2.16

3 B50影響CNE－2與CNE－2R細胞周期分布的比較

2.5 μmol/L濃度B50作用48 h后，細胞周期分布呈現(xiàn)明顯的G2/M期阻滯，見圖2，各期細胞統(tǒng)計見表3，其中B50作用后CNE－2細胞周期中G2/M期比例由12.4%升高至35.7%，CNE－2R細胞由7.1%升高至34.9%，兩者相比差異顯著(n=3，P＜0.01)。

4 B50誘導(dǎo)CNE－2與CNE－2R細胞凋亡的比較

10 μmol/L濃度B50作用24 h后，早期凋亡細胞(右下象限)及晚期凋亡/壞死細胞(右上象限)均有所升高，見圖3和表4，其中B50作用后CNE－2細胞早期凋亡率由4.4%升高至14.8%，CNE－2R細胞由3.7%升高至19.5%，兩者相比有顯著差異(n=3，P ＜0.01)。

Figure 2.The cell cycle distribution of CNE －2 cell line(A，B)and CNE －2R cell line(C，D)in control group(A，C)and B50 treatment group(B，D).圖2 CNE－2及CNE－2R細胞對照組與B50作用組的細胞周期分布

表3 B50作用后CNE－2及CNE－2R細胞的細胞周期改變Table 3.The changes of cell cycle after B50 treatment of CNE－2 and CNE－2R cell lines(%.±s.n=3).

表3 B50作用后CNE－2及CNE－2R細胞的細胞周期改變Table 3.The changes of cell cycle after B50 treatment of CNE－2 and CNE－2R cell lines(%.±s.n=3).

＊＊P ＜ 0.01 vs control.

B50 G1 S G2/M G1 S G2/M CNE －2 32.90 ±1.56 54.67 ±1.26 12.43 ±0.64 35.13 ±2.73 29.53 ±2.43 35.70 ±2.95 Cell line Control＊＊CNE －2R 44.50 ±1.47 48.37 ±1.64 7.13 ±0.38 27.31 ±2.49 38.32 ±2.16 34.90 ±3.72＊＊

Figure 3.The apoptotic distribution of CNE－2 cell line(A，B)and CNE －2R cell line(C，D)in control group(A，C)and B50 treatment group(B，D).圖3 CNE－2及CNE－2R細胞對照組與B50作用組的細胞凋亡分布

表4 B50作用后CNE－2及CNE－2R細胞的凋亡改變Table 4.The changes of apoptosis after B50 treatment of CNE－2 and CNE－2R cell lines(%.±s.n=3).

表4 B50作用后CNE－2及CNE－2R細胞的凋亡改變Table 4.The changes of apoptosis after B50 treatment of CNE－2 and CNE－2R cell lines(%.±s.n=3).

＊＊P ＜ 0.01 vs control.

Control Late apoptotic rate and necrotic rate CNE －2 4.40 ±2.31 6.80 ±2.16 14.80 ±2.14＊＊ 13.90 ±2.76 Cell line B50 Early apoptotic rate Late apoptotic rate and necrotic rate Early apoptotic rate＊＊CNE －2R 3.70 ±2.34 6.50 ±2.52 19.50 ±2.92＊＊ 17.80 ±2.12＊＊

5 B50影響CNE－2與CNE－2R細胞線粒體膜電位的比較

相比對照組，10 μmol/L濃度B50作用24 h后，羅丹明吸收峰下降及左移，見圖4，提示線粒體膜電位降低，其中B50作用后CNE－2及CNE－2R細胞線粒體膜電位分別下降了(35.06±1.07)%及(43.17±3.11)%，兩者相比差異顯著(n=3，P＜0.01)。

Figure 4.The mitochondrial membrane potential(MMP)distribution of CNE －2 cell line(A，B)and CNE －2R cell line(C，D)in control group(A，C)and B50 treatment group(B，D).圖4 CNE－2及CNE－2R細胞對照組與B50作用組的線粒體膜電位分布

討 論

姜黃素是一種天然酚類色素，廣泛存在于姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中。B50為姜黃素衍生物的一種，結(jié)構(gòu)式為2'－CH3－5'－CH3，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的修飾主要是以電中性的H取代苯環(huán)4'位上的羥基以降低4'羥基的強供電性，并于苯環(huán)2'，5'位代以甲基，梁廣等［4］初篩研究表明，B50具有廣譜抗腫瘤效應(yīng)，尤其對人前列腺癌細胞(PC3)和人子宮頸癌細胞(HeLa)具有更強的生物活性作用。從構(gòu)效關(guān)系上看，B50有望超越姜黃素成為毒性較低，能逆轉(zhuǎn)細胞輻射耐受性及促使腫瘤細胞凋亡的廣譜抗腫瘤藥。

我們的研究結(jié)果顯示，B50對鼻咽癌細胞系CNE－2與CNE－2R均具有抑制細胞活力與抑制細胞增殖能力的效應(yīng)。相比CNE－2，對放療輻射抗拒的CNE－2R對B50的作用顯得更為敏感，提示B50可能通過某些機制調(diào)控輻射抗拒鼻咽癌細胞的生物學(xué)特性。同時，B50對鼻咽癌細胞系CNE－2具有誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，且對輻射抗拒細胞系CNE－2R同樣具有誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，推測放療作用并不影響B(tài)50對鼻咽癌細胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)。楊甫文等［5］發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)鼻咽癌細胞NCE凋亡，Wong等［6］發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過抑制核因子κB及激活E－cadherin而起到抑制鼻咽癌細胞的遷移。B50可能同樣通過此類通路誘導(dǎo)凋亡，但具體通路可能與姜黃素存在差異。近年來陸續(xù)有報道［7］說明線粒體跨膜電位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰絲氨酸暴露于細胞表面。而一旦線粒體跨膜電位耗散，細胞就會進入不可逆的凋亡過程。本研究中B50可使兩細胞線粒體膜電位降低，且CNE－2R中線粒體膜電位降低更為明顯，提示B50可能通過線粒體凋亡調(diào)控途徑促進輻射抗拒鼻咽癌細胞的凋亡。

Pawlik等［8］研究表明，處于G2/M期的細胞對射線最敏感，而G1/S期的細胞相對不敏感，S期末的細胞對射線最不敏感。細胞周期檢測顯示，B50可有效地將CNE－2細胞停滯在G2/M期，而G2/M調(diào)停點被認為是腫瘤細胞對輻射和化療的敏感期［9］，B50對輻射抗拒的細胞系CNE－2R仍具有G2/M期調(diào)停作用，這提示B50可能具有逆轉(zhuǎn)鼻咽癌細胞放療作用后產(chǎn)生輻射抗拒的作用。

目前國內(nèi)外對鼻咽癌細胞系CNE－2R的相關(guān)研究甚少，王旭丹等［1］報道了CNE－2R與CNE－2對X射線輻射抗拒的關(guān)系曲線，表明CNE－2R對X射線存在更大的耐受作用，同時該研究還發(fā)現(xiàn)CNE－2R與CNE－2間存在微小RNA表達的差異，表現(xiàn)為降低腫瘤輻射抗拒性或化療耐受性的miRNA表達減少，增加腫瘤輻射抗拒性或化療耐受性的miRNA表達增多，以及既可增加腫瘤輻射抗拒性或化療耐受性又可降低腫瘤輻射抗拒性或化療耐受性的miRNA表達異常，miRNA參與鼻咽癌細胞輻射抗拒及化療耐受的分子機制可能涉及EGFR－PI3KAkt、Ras－MAPK和ARF－p53等通路及其相關(guān)蛋白(如 EGFR、Ras、MAP2K4、P38、E2F1、E2F7、E2F8 和HIF1等)。Feng等［10］研究發(fā)現(xiàn)相比 CNE－2細胞，輻射抗拒 CNE－2R細胞中的14－3－3 sigma及Maspin表達下調(diào)，同時GRP78與Mn－SOD表達上調(diào)。近幾年的國內(nèi)外研究均提及鼻咽癌在放療作用后產(chǎn)生多藥耐藥特性，隋曉梅等［11］發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞系CNE－1在接受X線照射后多藥耐藥基因mdr1的mRNA表達顯著升高，其產(chǎn)物P糖蛋白也顯著升高，而后者為起到多藥耐藥的關(guān)鍵蛋白。這提示B50可能通過上述通路及相關(guān)微小RNA的表達調(diào)控影響鼻咽癌細胞的生物學(xué)特性，從而更有效地抑制輻射抗拒鼻咽癌細胞的活力及增殖能力，誘導(dǎo)其凋亡及逆轉(zhuǎn)其輻射抗拒特性。

綜上所述，B50可有效地抑制鼻咽癌細胞活力與增殖能力，其中對CNE－2R的作用具有更為顯著的效應(yīng);B50也可誘導(dǎo)鼻咽癌細胞的凋亡，且可能與線粒體凋亡途徑相關(guān);B50能使鼻咽癌細胞周期停滯于G2/M期，從而增強其對放療的敏感性。因此B50可能對放療后殘存的鼻咽癌細胞具有有效的殺傷作用，減少臨床上鼻咽癌放療根治后的復(fù)發(fā)及遠處轉(zhuǎn)移，并逆轉(zhuǎn)放療后鼻咽癌細胞的輻射抗拒特性，這對于鼻咽癌的臨床治療，尤其是放療后的輔助治療具有可觀的應(yīng)用前景。盡管B50顯示出了對鼻咽癌細胞良好的治療價值，但同時還存在很多值得我們進一步研究的問題，如B50對輻射抗拒CNE－2R細胞具有更為顯著殺傷抑制效應(yīng)的機理，其對細胞G2/M期阻滯的機制，其誘導(dǎo)兩細胞凋亡通路間的異同，以及其通過相關(guān)微小RNA對鼻咽癌細胞放療及化療敏感性的調(diào)控機制等，這些將有待我們?nèi)蘸筮M一步研究。

［1］王旭丹，楊惠玲，郭禹標(biāo)，等.不同輻射抗拒鼻咽癌細胞微小RNA差異表達的研究［J］.中國病理生理雜志，2007，23(6):1045 －1048.

［2］Tang H，Murphy CJ，Zhang B，et al.Curcumin polymers as anticancer conjugates［J］.Biomaterials，2010，31(27):7139－7149.

［3］曹 璋，崔 敏，孫 寧.姜黃素對人鼻咽癌CNE－2Z細胞的放射增敏作用及其作用機制［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15(9):1232 －1234.

［4］梁 廣，田吉來，邵麗麗，等.姜黃素的構(gòu)效關(guān)系及以其為先導(dǎo)物的抗腫瘤化合物研究進展［J］.化學(xué)通報，2008，71(2):110 －117.

［5］楊甫文，黃金中，林曉嵐，等.姜黃素誘導(dǎo)鼻咽癌NCE細胞凋亡機制的研究［J］.中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志，2006，41(8):612 －616.

［6］Wong TS，Chan WS，Li CH，et al.Curcumin alters the migratory phenotype of nasopharyngeal carcinoma cells through up－regulation of E －cadherin［J］.Anticancer Res，2010，30(7):2851 －2856.

［7］Grandemange S，Herzig S，Martinou JC.Mitochondrial dynamics and cancer［J］.Semin Cancer Biol，2009，19(1):50－56.

［8］Pawlik TM，Keyomarsi K.Role of cell cycle in mediating sensitivity to radiotherapy［J］.Int J Radiat Oncol Biol Phys，2004，59(4):928 －942.

［9］Ree AH，Stokke T，Bratland A，et al.DNA damage responses in cell cycle G2phase and mitosis－tracking and targeting［J］.Anticancer Res，2006，26(3A):1909 －1916.

［10］Feng XP，Yi H，Li MY，et al.Identification of biomarkers for predicting nasopharyngeal carcinoma response to radiotherapy by proteomics［J］.Cancer Res，2010，70(9):3450－3462.

［11］隋曉梅，王若雨，朱勤偉，等.X射線照射對人鼻咽癌細胞株MDR1及P－gp表達影響的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2008，15(8):569 －571，586.