蔣淑君, 張 楠, 李俊發(fā)
(1濱州醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,山東煙臺264003;2首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系,北京100069)
腦中風(fēng)等缺血性腦血管疾病已經(jīng)和冠心病、惡性腫瘤等一并列為當(dāng)今世界上嚴重威脅人類健康的三大殺手,尤其在我國,急性腦血管疾病的發(fā)病率及死亡率明顯高于冠心病。據(jù)統(tǒng)計,2007年我國有600萬人罹患中風(fēng),其中45%為腦缺血所致[1]。腦低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxic preconditioning,HPC)是一種內(nèi)源性保護機制,即短暫、亞致死性的重復(fù)性低氧刺激可引起組織或器官對繼發(fā)嚴重缺氧/缺血的耐受。其形成機制的研究,尤其是對參與HPC形成的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究,可為臨床治療腦缺血/低氧損傷開辟新思路。我們以往研究發(fā)現(xiàn),常規(guī)型蛋白激酶Cγ(conventional protein kinase,Cγ,cPKCγ)的激活參與了腦HPC的發(fā)生發(fā)展過程[2]。同時我們也發(fā)現(xiàn),HPC可能通過增加大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)小鼠皮層組織內(nèi)cPKCγ等的膜轉(zhuǎn)位水平,對缺血損傷起抑制作用[3]。然而究竟哪些蛋白可能與cPKCγ相互作用并參與該過程,至今仍不清楚。本研究擬利用小鼠整體HPC模型及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進一步鑒定HPC小鼠腦皮層組織內(nèi)與cPKCγ相互作用的蛋白,并探討與cPKCγ相互作用的熱休克蛋白60(heat-shock protein 60,HSP60)表達水平在HPC及腦缺血過程中的變化。
免疫沉淀試劑盒(Sigma-Aldrich),蛋白酶抑制劑(亮肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A、糜蛋白酶抑制素)、磷酸酶抑制劑(KF、岡田酸、Na2P2O7、原礬酸鈉)、脂氧膽酸鈉、DTT、NP -40、EDTA、EGTA 等試劑(Sigma Aldrich);兔源性cPKCγ多克隆抗體(Santa Cruz),兔源性熱休克蛋白(HSP)60抗體(Cell Signalling Technology),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體、山羊抗小鼠抗體和ECL反應(yīng)底物(Chemicon);Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad);BCA蛋白定量試劑盒(Pierce);11cm IPG預(yù)制干膠條(pH 3-10,線性,GE Healthcare);銀染試劑盒(Amersham);Kodak BioMaxMR X-光膠片(Kodak)。
2.1 動物及模型制備 健康BALB/c小鼠(雄性,體質(zhì)量18-22 g,8-10周,SPF級,醫(yī)學(xué)實驗動物質(zhì)量合格證書,許可證編號SCXK-(軍)2009-004,首都醫(yī)科大學(xué)動物部。按文獻方法[4],首先制備常氧(normoxia,Norm)和HPC組小鼠。低氧暴露結(jié)束后,室溫恢復(fù)1 h,再進行MCAO缺血(ischemia,I)模型制備[5],實驗動物分為Norm組、HPC組、常氧假手術(shù)組(Norm+sham)、常氧缺血組(Norm+I)、HPC假手術(shù)組(HPC+sham)和HPC缺血組(HPC+I),每組 n=6。
2.2 胞漿和膜相關(guān)蛋白的提取 參照文獻[6]進行,將凍存Norm組和HPC組小鼠皮層組織按10 mL/g的比例加入裂解液A[mmol/L:Tris-HCl 50(pH 7.5),EGTA 2,EDTA 2,DTT 2,Na4P2O75,KF 50,岡田酸5×10-5,高肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素 A、糜蛋白酶抑制素各 5 mg/L],勻漿、超聲破碎,4℃、30 000×g離心30 min,取上清液作為胞漿成分(cytosolic)保存;沉淀物再加入相同體積的裂解液B(勻漿液A+0.5%NP-40),并進一步超聲破碎,在4℃、30 000×g離心30 min,取上清液作為膜相關(guān)蛋白成分(particulate)。
2.3 免疫沉淀 取相應(yīng)的蛋白質(zhì)組分1 mg,加入2 μgⅠ抗,室溫下置于搖床數(shù)小時,再加入protein GSepharose 4℃過夜。12 000×g離心1 min,棄去上清,沉淀用緩沖液洗數(shù)次,最后加入thiourea buffer(用于雙向電泳)處理沉淀5 min,離心棄去沉淀,所得上清即為免疫沉淀產(chǎn)物。
2.4 雙向電泳、銀染及凝膠圖像分析 第一向等電聚焦電泳(isoelectric focusing,IEF)采用固相化11cm IPG預(yù)制干膠條(pH 3-10,線性),再水化同時上樣。聚焦程序如下:30 V 12 h,step;200 V 1 h,step;500 V 1 h,step;1 000 V 1 h,step;8 000 V 1 h,gradient;8 000 V 3 h,step。IEF后IPG膠條從電泳槽中取出,分別在平衡液A和平衡液B中平衡15 min后轉(zhuǎn)入預(yù)先灌制好的SDS-PAGE膠上進行第二向電泳,每面膠電流為15 mA,待溴酚藍前沿至陽極約5 mm時停止電泳。固定電泳后的凝膠,按敏化、銀染、顯色和終止步驟依次進行凝膠的銀染顯色。應(yīng)用Image Master 2D Platinum軟件對凝膠進行分析。
2.5 膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定 按文獻[7]進行蛋白點的膠內(nèi)酶解及 MALDI-TOF-MS(prOTOF 2000,PerkinElmer)檢測,獲得數(shù)據(jù)應(yīng)用NCBInr和Swissprot數(shù)據(jù)庫進行蛋白鑒定。
2.6 蛋白樣品制備、SDS-PAGE和Western blotting參照文獻[8],抽提 Norm+sham 組 、Norm+I組、HPC+sham組和HPC+I組皮層缺血核心區(qū)、半影區(qū)和對側(cè)皮層組織的全細胞蛋白組分,BCA法蛋白定量,-20℃保存?zhèn)溆?。分別取50 μg各組蛋白樣品進行蛋白電泳(10%SDS PAGE,4℃,20-30 mA)和轉(zhuǎn)膜(PVDF膜,400 mA,3 h)。用cPKCγ抗體、HSP 60抗體和β-actin(內(nèi)參照)抗體進行雜交。所得結(jié)果用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描后分析。
實驗數(shù)據(jù)處理和檢驗應(yīng)用Quantity One分析軟件進行半定量分析,并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用SPSS軟件,首先進行單因素方差分析(One-way ANOVA),然后進行Bonferroni檢驗。
采用相同上樣量的Norm組和HPC組小鼠皮層與cPKCγ相互作用蛋白進行雙向電泳,獲得了較滿意的電泳圖譜,見圖1。應(yīng)用雙向電泳圖譜專業(yè)分析軟件Image Master 2D Platinum對Norm組和HPC組小鼠皮層蛋白雙向電泳圖譜進行了比較分析,結(jié)合質(zhì)譜鑒定我們發(fā)現(xiàn),與常氧組比較,HPC小鼠腦皮層膜相關(guān)成分中,與cPKCγ相互作用的HSP60在膜相關(guān)成分中升高了(1.34 ±0.19)倍,n=3,見圖2。
Figure 1.Representative 2D mapping of cPKCγ-interacted proteins in particulate fraction of cortex in normoxic(Norm)and hypoxic preconditioning(HPC)mice.Differentially expressed proteins were highlighted by arrows in silver- stained 2D PAGE gels.In particular,from 1 to 15,they were transitional endoplasmic reticulum ATPase,aconitate hydratase,heat- shock protein 70,heat-shock protein 60,synapsin,pyruvate kinase,ATP synthase,creatine kinase,phosphoglycerate kinase,purinerich element-binding protein A,fructose-bisphosphate aldolase A,guanine nucleotide-binding protein,14-3-3 protein gamma and ubiquitin carboxyl- terminal hydrolase L1,respectively.圖1 小鼠腦組織膜相關(guān)成分中與cPKCγ相互作用蛋白的典型雙向電泳圖
Figure 2. Protein expression of cPKCγ - interacted HSP60.Magnified pictures of 2-DE images showed an increase in HSP60 protein expression level in particulate fraction of cerebral cortex of HPC mice.圖2 與cPKC γ相互作用的HSP60蛋白表達
利用免疫沉淀發(fā)現(xiàn),cPKCγ在膜相關(guān)蛋白成分中與HSP60存在相互作用。同時,在膜相關(guān)蛋白成分中利用HSP60的抗體也能沉淀出cPKCγ,見圖3。
Figure 3.The interaction between HSP60 and cPKCγ.cPKCγ was immunoprecipitated with HSP60 antibody in particulate and cytosolic fraction in HPC mice.WCL:whole-cell lysate;P:particulate;C:cytosolic.圖3 HSP60和cPKCγ的免疫共沉淀結(jié)果
在MCAO誘導(dǎo)的缺血模型中,與Norm+sham組小鼠相比,Norm+I組及HPC+I組小鼠皮層缺血核心區(qū)HSP60表達水平明顯升高(P<0.05,n=6);與Norm+sham組小鼠相比,Norm+I組及HPC+I組小鼠皮層半影區(qū)HSP60表達水平升高(P<0.05,n=6)。HPC+I組小鼠皮層缺血核心區(qū)HSP60表達水平低于Norm+I組(P <0.05,n=6),而 HPC+I組小鼠皮層半影區(qū)與Norm+I組小鼠皮層半影區(qū)相比,HSP60表達水平有降低,但差異無顯著,見圖4。
Figure 4.Protein expression levels of HSP60 in ischemic cortex of MCAO mice.A:Western blotting results;B:quantitative analysis.S:sham;Ic:ischemic core;P:penumbra;C:contralateral area of occluded hemisphere.±s.n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs Ic in Norm+I group.圖4 腦缺血/預(yù)適應(yīng)小鼠皮層組織HSP60蛋白表達
HPC是機體的一種內(nèi)源性保護機制,即亞致死性低氧刺激可激發(fā)組織器官產(chǎn)生對繼發(fā)嚴重缺血/低氧性損傷的耐受。目前為止,人們已利用多種腦缺血模型證實了其保護作用。然而,HPC腦保護作用的確切機制仍不清楚。很多研究表明,腺苷及其受體和低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor,HIF)等均參與了HPC的腦保護作用,并且在這些機制中均有PKC家族的參與。cPKCγ是PKC家族中最特殊和重要的亞型之一,其在組織中的分布局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng),對于突觸的形成以及可塑性的調(diào)節(jié)都具有極其重要的作用。許多研究表明,cPKCγ在腦I/HPC方面同樣發(fā)揮重要作用。PKCs激活后可以發(fā)生移位,即從胞漿轉(zhuǎn)移到胞膜、細胞骨架結(jié)構(gòu)或細胞核內(nèi),稱為膜轉(zhuǎn)位。我們在小鼠整體HPC模型中也發(fā)現(xiàn)了cPKCγ的膜轉(zhuǎn)位激活[6],cPKCγ的激活可能參與了HPC減輕小鼠大腦中動脈阻塞所致腦缺血性損傷[3]。為了進一步揭示參與 HPC的cPKCγ信號網(wǎng)絡(luò),本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及整體HPC小鼠模型,發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)適應(yīng)可致小鼠皮層組織膜相關(guān)成分中與cPKCγ相互作用的多種蛋白的表達量發(fā)生明顯變化,如HSP60、ATP synthase、creatine kinase、phosphoglycerate kinase 、14 -3 - 3 protein gamma、HSP70等,提示這些蛋白可能均參與了cPKCγ介導(dǎo)的腦低氧預(yù)適應(yīng)形成。在新生心肌細胞PKC參與HSP介導(dǎo)的應(yīng)激損傷保護作用[9],在缺血預(yù)適應(yīng)的肝臟,HSP表達受依賴PKC的P44/42信號通路調(diào)節(jié)[10]。我們通過雙向電泳和質(zhì)譜分析鑒定及免疫共沉淀證實,低氧預(yù)適應(yīng)時在小鼠皮層膜相關(guān)成分中cPKCγ與HSP60存在相互作用。
HSP60家族屬于熱應(yīng)激蛋白,熱應(yīng)激蛋白存在于所有的原核與真核生物中,在細胞內(nèi)起“分子伴侶”的作用,可協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉(zhuǎn)位、折疊和裝配,具有維持蛋白穩(wěn)定、促進細胞生存等功能,在細胞生長、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮重要作用[11]。正常狀態(tài)下HSP60主要以穩(wěn)定狀態(tài)存在于線粒體基質(zhì)中,胞質(zhì)內(nèi)含量較少,在機體處于應(yīng)激狀態(tài)時可過表達或異位表達。因此,HSP60也被認為是反映線粒體應(yīng)激和損傷程度的指標(biāo)。近來的研究表明,低氧/缺血損傷可致新生大鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)周圍組織內(nèi)HSP60蛋白量增高[12]。腦缺血損傷可使神經(jīng)元內(nèi)未折疊蛋白毒性堆積并導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡,腦缺血所致的未折疊蛋白毒性堆積及線粒體應(yīng)激可能引起HSP60 mRNA和蛋白表達水平增加[13]。本研究結(jié)果顯示,在MCAO誘導(dǎo)的缺血模型中,小鼠皮層缺血核心區(qū)及半影區(qū)HSP60表達水平較假手術(shù)組均明顯升高,而低氧預(yù)適應(yīng)后缺血核心區(qū)HSP60表達水平降低,提示神經(jīng)細胞在缺血/低氧狀態(tài)下未折疊蛋白毒性堆積及線粒體應(yīng)激致HSP60表達增高,低氧預(yù)適應(yīng)可能通過調(diào)節(jié)HSP60蛋白表達,起到一定的腦保護作用。
本研究借助蛋白質(zhì)組學(xué)與整體HPC小鼠模型證實,cPKCγ可能通過HSP60參與腦低氧預(yù)適應(yīng)的形成。進一步通過HPC結(jié)合MCAO小鼠模型發(fā)現(xiàn),在腦缺血缺氧損傷時HSP60蛋白表達水平明顯升高,低氧預(yù)適應(yīng)后HSP60蛋白表達有所降低。以上結(jié)果揭示cPKCγ-HSP60信號通路參與腦低氧預(yù)適應(yīng)過程,cPKCγ可能通過調(diào)節(jié)與其相互作用蛋白HSP60在低氧/缺血損傷和預(yù)適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。然而,其相互作用機制及在腦缺血/低氧損傷中如何發(fā)揮作用等均有待進一步研究。
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