蔣淑君， 張 楠， 李俊發(fā)

(1濱州醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山東煙臺264003;2首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系，北京100069)

腦中風(fēng)等缺血性腦血管疾病已經(jīng)和冠心病、惡性腫瘤等一并列為當(dāng)今世界上嚴重威脅人類健康的三大殺手，尤其在我國，急性腦血管疾病的發(fā)病率及死亡率明顯高于冠心病。據(jù)統(tǒng)計，2007年我國有600萬人罹患中風(fēng)，其中45%為腦缺血所致［1］。腦低氧預(yù)適應(yīng)(hypoxic preconditioning，HPC)是一種內(nèi)源性保護機制，即短暫、亞致死性的重復(fù)性低氧刺激可引起組織或器官對繼發(fā)嚴重缺氧/缺血的耐受。其形成機制的研究，尤其是對參與HPC形成的細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究，可為臨床治療腦缺血/低氧損傷開辟新思路。我們以往研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)型蛋白激酶Cγ(conventional protein kinase，Cγ，cPKCγ)的激活參與了腦HPC的發(fā)生發(fā)展過程［2］。同時我們也發(fā)現(xiàn)，HPC可能通過增加大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)小鼠皮層組織內(nèi)cPKCγ等的膜轉(zhuǎn)位水平，對缺血損傷起抑制作用［3］。然而究竟哪些蛋白可能與cPKCγ相互作用并參與該過程，至今仍不清楚。本研究擬利用小鼠整體HPC模型及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進一步鑒定HPC小鼠腦皮層組織內(nèi)與cPKCγ相互作用的蛋白，并探討與cPKCγ相互作用的熱休克蛋白60(heat－shock protein 60，HSP60)表達水平在HPC及腦缺血過程中的變化。

材料和方法

1 材料

免疫沉淀試劑盒(Sigma－Aldrich)，蛋白酶抑制劑(亮肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A、糜蛋白酶抑制素)、磷酸酶抑制劑(KF、岡田酸、Na2P2O7、原礬酸鈉)、脂氧膽酸鈉、DTT、NP －40、EDTA、EGTA 等試劑(Sigma Aldrich);兔源性cPKCγ多克隆抗體(Santa Cruz)，兔源性熱休克蛋白(HSP)60抗體(Cell Signalling Technology)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體、山羊抗小鼠抗體和ECL反應(yīng)底物(Chemicon);Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio－Rad);BCA蛋白定量試劑盒(Pierce);11cm IPG預(yù)制干膠條(pH 3－10，線性，GE Healthcare);銀染試劑盒(Amersham);Kodak BioMaxMR X－光膠片(Kodak)。

2 方法

2.1 動物及模型制備 健康BALB/c小鼠(雄性，體質(zhì)量18－22 g，8－10周，SPF級，醫(yī)學(xué)實驗動物質(zhì)量合格證書，許可證編號SCXK－(軍)2009－004，首都醫(yī)科大學(xué)動物部。按文獻方法［4］，首先制備常氧(normoxia，Norm)和HPC組小鼠。低氧暴露結(jié)束后，室溫恢復(fù)1 h，再進行MCAO缺血(ischemia，I)模型制備［5］，實驗動物分為Norm組、HPC組、常氧假手術(shù)組(Norm+sham)、常氧缺血組(Norm+I)、HPC假手術(shù)組(HPC+sham)和HPC缺血組(HPC+I)，每組 n=6。

2.2 胞漿和膜相關(guān)蛋白的提取 參照文獻［6］進行，將凍存Norm組和HPC組小鼠皮層組織按10 mL/g的比例加入裂解液A［mmol/L:Tris－HCl 50(pH 7.5)，EGTA 2，EDTA 2，DTT 2，Na4P2O75，KF 50，岡田酸5×10－5，高肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素 A、糜蛋白酶抑制素各 5 mg/L］，勻漿、超聲破碎，4℃、30 000×g離心30 min，取上清液作為胞漿成分(cytosolic)保存;沉淀物再加入相同體積的裂解液B(勻漿液A+0.5%NP－40)，并進一步超聲破碎，在4℃、30 000×g離心30 min，取上清液作為膜相關(guān)蛋白成分(particulate)。

2.3 免疫沉淀 取相應(yīng)的蛋白質(zhì)組分1 mg，加入2 μgⅠ抗，室溫下置于搖床數(shù)小時，再加入protein GSepharose 4℃過夜。12 000×g離心1 min，棄去上清，沉淀用緩沖液洗數(shù)次，最后加入thiourea buffer(用于雙向電泳)處理沉淀5 min，離心棄去沉淀，所得上清即為免疫沉淀產(chǎn)物。

2.4 雙向電泳、銀染及凝膠圖像分析 第一向等電聚焦電泳(isoelectric focusing，IEF)采用固相化11cm IPG預(yù)制干膠條(pH 3－10，線性)，再水化同時上樣。聚焦程序如下:30 V 12 h，step;200 V 1 h，step;500 V 1 h，step;1 000 V 1 h，step;8 000 V 1 h，gradient;8 000 V 3 h，step。IEF后IPG膠條從電泳槽中取出，分別在平衡液A和平衡液B中平衡15 min后轉(zhuǎn)入預(yù)先灌制好的SDS－PAGE膠上進行第二向電泳，每面膠電流為15 mA，待溴酚藍前沿至陽極約5 mm時停止電泳。固定電泳后的凝膠，按敏化、銀染、顯色和終止步驟依次進行凝膠的銀染顯色。應(yīng)用Image Master 2D Platinum軟件對凝膠進行分析。

2.5 膠內(nèi)酶切和質(zhì)譜鑒定 按文獻［7］進行蛋白點的膠內(nèi)酶解及 MALDI－TOF－MS(prOTOF 2000，PerkinElmer)檢測，獲得數(shù)據(jù)應(yīng)用NCBInr和Swissprot數(shù)據(jù)庫進行蛋白鑒定。

2.6 蛋白樣品制備、SDS－PAGE和Western blotting參照文獻［8］，抽提 Norm+sham 組 、Norm+I組、HPC+sham組和HPC+I組皮層缺血核心區(qū)、半影區(qū)和對側(cè)皮層組織的全細胞蛋白組分，BCA法蛋白定量，－20℃保存?zhèn)溆?。分別取50 μg各組蛋白樣品進行蛋白電泳(10%SDS PAGE，4℃，20－30 mA)和轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，400 mA，3 h)。用cPKCγ抗體、HSP 60抗體和β－actin(內(nèi)參照)抗體進行雜交。所得結(jié)果用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)掃描后分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)處理和檢驗應(yīng)用Quantity One分析軟件進行半定量分析，并以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。應(yīng)用SPSS軟件，首先進行單因素方差分析(One－way ANOVA)，然后進行Bonferroni檢驗。

結(jié) 果

1 HPC小鼠腦皮層膜相關(guān)成分中與cPKCγ相互作用差異表達蛋白HSP60的鑒定

采用相同上樣量的Norm組和HPC組小鼠皮層與cPKCγ相互作用蛋白進行雙向電泳，獲得了較滿意的電泳圖譜，見圖1。應(yīng)用雙向電泳圖譜專業(yè)分析軟件Image Master 2D Platinum對Norm組和HPC組小鼠皮層蛋白雙向電泳圖譜進行了比較分析，結(jié)合質(zhì)譜鑒定我們發(fā)現(xiàn)，與常氧組比較，HPC小鼠腦皮層膜相關(guān)成分中，與cPKCγ相互作用的HSP60在膜相關(guān)成分中升高了(1.34 ±0.19)倍，n=3，見圖2。

Figure 1.Representative 2D mapping of cPKCγ－interacted proteins in particulate fraction of cortex in normoxic(Norm)and hypoxic preconditioning(HPC)mice.Differentially expressed proteins were highlighted by arrows in silver－ stained 2D PAGE gels.In particular，from 1 to 15，they were transitional endoplasmic reticulum ATPase，aconitate hydratase，heat－ shock protein 70，heat－shock protein 60，synapsin，pyruvate kinase，ATP synthase，creatine kinase，phosphoglycerate kinase，purinerich element－binding protein A，fructose－bisphosphate aldolase A，guanine nucleotide－binding protein，14－3－3 protein gamma and ubiquitin carboxyl－ terminal hydrolase L1，respectively.圖1 小鼠腦組織膜相關(guān)成分中與cPKCγ相互作用蛋白的典型雙向電泳圖

Figure 2. Protein expression of cPKCγ － interacted HSP60.Magnified pictures of 2－DE images showed an increase in HSP60 protein expression level in particulate fraction of cerebral cortex of HPC mice.圖2 與cPKC γ相互作用的HSP60蛋白表達

2 免疫共沉淀驗證差異表達的HSP60與cPKCγ相互作用情況

利用免疫沉淀發(fā)現(xiàn)，cPKCγ在膜相關(guān)蛋白成分中與HSP60存在相互作用。同時，在膜相關(guān)蛋白成分中利用HSP60的抗體也能沉淀出cPKCγ，見圖3。

3 低氧預(yù)適應(yīng)對MCAO小鼠皮層組織HSP60表達量的影響

Figure 3.The interaction between HSP60 and cPKCγ.cPKCγ was immunoprecipitated with HSP60 antibody in particulate and cytosolic fraction in HPC mice.WCL:whole－cell lysate;P:particulate;C:cytosolic.圖3 HSP60和cPKCγ的免疫共沉淀結(jié)果

在MCAO誘導(dǎo)的缺血模型中，與Norm+sham組小鼠相比，Norm+I組及HPC+I組小鼠皮層缺血核心區(qū)HSP60表達水平明顯升高(P＜0.05，n=6);與Norm+sham組小鼠相比，Norm+I組及HPC+I組小鼠皮層半影區(qū)HSP60表達水平升高(P＜0.05，n=6)。HPC+I組小鼠皮層缺血核心區(qū)HSP60表達水平低于Norm+I組(P ＜0.05，n=6)，而 HPC+I組小鼠皮層半影區(qū)與Norm+I組小鼠皮層半影區(qū)相比，HSP60表達水平有降低，但差異無顯著，見圖4。

Figure 4.Protein expression levels of HSP60 in ischemic cortex of MCAO mice.A:Western blotting results;B:quantitative analysis.S:sham;Ic:ischemic core;P:penumbra;C:contralateral area of occluded hemisphere.±s.n=6.*P＜0.05 vs sham group;#P＜0.05 vs Ic in Norm+I group.圖4 腦缺血/預(yù)適應(yīng)小鼠皮層組織HSP60蛋白表達

討 論

HPC是機體的一種內(nèi)源性保護機制，即亞致死性低氧刺激可激發(fā)組織器官產(chǎn)生對繼發(fā)嚴重缺血/低氧性損傷的耐受。目前為止，人們已利用多種腦缺血模型證實了其保護作用。然而，HPC腦保護作用的確切機制仍不清楚。很多研究表明，腺苷及其受體和低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia－inducible factor，HIF)等均參與了HPC的腦保護作用，并且在這些機制中均有PKC家族的參與。cPKCγ是PKC家族中最特殊和重要的亞型之一，其在組織中的分布局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對于突觸的形成以及可塑性的調(diào)節(jié)都具有極其重要的作用。許多研究表明，cPKCγ在腦I/HPC方面同樣發(fā)揮重要作用。PKCs激活后可以發(fā)生移位，即從胞漿轉(zhuǎn)移到胞膜、細胞骨架結(jié)構(gòu)或細胞核內(nèi)，稱為膜轉(zhuǎn)位。我們在小鼠整體HPC模型中也發(fā)現(xiàn)了cPKCγ的膜轉(zhuǎn)位激活［6］，cPKCγ的激活可能參與了HPC減輕小鼠大腦中動脈阻塞所致腦缺血性損傷［3］。為了進一步揭示參與 HPC的cPKCγ信號網(wǎng)絡(luò)，本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)及整體HPC小鼠模型，發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)適應(yīng)可致小鼠皮層組織膜相關(guān)成分中與cPKCγ相互作用的多種蛋白的表達量發(fā)生明顯變化，如HSP60、ATP synthase、creatine kinase、phosphoglycerate kinase 、14 －3 － 3 protein gamma、HSP70等，提示這些蛋白可能均參與了cPKCγ介導(dǎo)的腦低氧預(yù)適應(yīng)形成。在新生心肌細胞PKC參與HSP介導(dǎo)的應(yīng)激損傷保護作用［9］，在缺血預(yù)適應(yīng)的肝臟，HSP表達受依賴PKC的P44/42信號通路調(diào)節(jié)［10］。我們通過雙向電泳和質(zhì)譜分析鑒定及免疫共沉淀證實，低氧預(yù)適應(yīng)時在小鼠皮層膜相關(guān)成分中cPKCγ與HSP60存在相互作用。

HSP60家族屬于熱應(yīng)激蛋白，熱應(yīng)激蛋白存在于所有的原核與真核生物中，在細胞內(nèi)起“分子伴侶”的作用，可協(xié)助多肽或蛋白質(zhì)的正確轉(zhuǎn)位、折疊和裝配，具有維持蛋白穩(wěn)定、促進細胞生存等功能，在細胞生長、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮重要作用［11］。正常狀態(tài)下HSP60主要以穩(wěn)定狀態(tài)存在于線粒體基質(zhì)中，胞質(zhì)內(nèi)含量較少，在機體處于應(yīng)激狀態(tài)時可過表達或異位表達。因此，HSP60也被認為是反映線粒體應(yīng)激和損傷程度的指標(biāo)。近來的研究表明，低氧/缺血損傷可致新生大鼠腦皮質(zhì)缺血區(qū)周圍組織內(nèi)HSP60蛋白量增高［12］。腦缺血損傷可使神經(jīng)元內(nèi)未折疊蛋白毒性堆積并導(dǎo)致神經(jīng)細胞死亡，腦缺血所致的未折疊蛋白毒性堆積及線粒體應(yīng)激可能引起HSP60 mRNA和蛋白表達水平增加［13］。本研究結(jié)果顯示，在MCAO誘導(dǎo)的缺血模型中，小鼠皮層缺血核心區(qū)及半影區(qū)HSP60表達水平較假手術(shù)組均明顯升高，而低氧預(yù)適應(yīng)后缺血核心區(qū)HSP60表達水平降低，提示神經(jīng)細胞在缺血/低氧狀態(tài)下未折疊蛋白毒性堆積及線粒體應(yīng)激致HSP60表達增高，低氧預(yù)適應(yīng)可能通過調(diào)節(jié)HSP60蛋白表達，起到一定的腦保護作用。

本研究借助蛋白質(zhì)組學(xué)與整體HPC小鼠模型證實，cPKCγ可能通過HSP60參與腦低氧預(yù)適應(yīng)的形成。進一步通過HPC結(jié)合MCAO小鼠模型發(fā)現(xiàn)，在腦缺血缺氧損傷時HSP60蛋白表達水平明顯升高，低氧預(yù)適應(yīng)后HSP60蛋白表達有所降低。以上結(jié)果揭示cPKCγ－HSP60信號通路參與腦低氧預(yù)適應(yīng)過程，cPKCγ可能通過調(diào)節(jié)與其相互作用蛋白HSP60在低氧/缺血損傷和預(yù)適應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。然而，其相互作用機制及在腦缺血/低氧損傷中如何發(fā)揮作用等均有待進一步研究。

［1］Liu M，Wu B，Wang WZ，et al.Stroke in China:epidemiology，prevention，and management strategies［J］.Lancet Neurol，2007，6(5):456 － 464.

［2］Niu C，Li J，Cui X，et al.Changes in cPKC isoform －specific membrane translocation and protein expression in the brain of hypoxic preconditioned mice［J］.Neurosci Lett，2005，384(1－2):1 － 6.

［3］楊巍巍，江 君，卜祥寧，等.蛋白激酶CβⅡ和γ參與低氧預(yù)適應(yīng)降低腦中動脈阻塞所致鼠腦缺血性損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床2009，29(2):129 －134.

［4］Li J，Niu C，Han S，et al.Identification of protein kinase C isoforms involved in cerebral hypoxic preconditioning of mice［J］.Brain Res，2005，1060(1－2):62 －72.

［5］蔣淑君，張 楠，卜祥寧，等.P38MAPK磷酸化增高參與HPC降低MCAO所致小鼠缺血性腦損傷［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2009，29(7):691 －696.

［6］張 楠，韓 松，李俊發(fā).低氧預(yù)適應(yīng)鼠腦海馬組織內(nèi)與cPKCγ相互作用的 ERK1/2磷酸化水平降低［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2008，28(3):209 －212.

［7］Zhou Y，Bhatia I，Cai Z，et al.Proteomic analysis of neonatal mouse brain:evidence for hypoxia and ischemia induced dephosphorylation of collapsin response mediator proteins［J］.J Proteome Res，2008，7(6):2507 － 2515.

［8］Wexler EJ，Peters EE，Gonzales A，et al.An objective procedure for ischemic area evaluation of the stroke intraluminal thread model in the mouse and rat［J］.J Neurosci Methods，2002，113(1):51 － 58.

［9］Coaxum SD，Martin JL，Mestril R.Overexpression of heat shock proteins differentially modulates protein kinase C expression in rat neonatal cardiomyocytes［J］.Cell Stress Chaperones，2003，8(4):297 －302.

［10］Gao Y，Shan YQ，Pan MX，et al.PKC －dependent activation of P44/42 MAPKs and HSP70 during hepatocyte ischemic preconditioning ［J］. World J Gastroenterol，2004，10(7):1019 － 1027.

［11］龔興國，于 紅.熱休克蛋白60研究進展［J］.中國病理生理雜志，2004，20(11):2151 －2154.

［12］Wei Y，Signore AP，Iwai M，et al.Rapidly increased neuronal mitochondrial biogenesis after hypoxic－ischemic brain injury［J］.Stroke，2008，39(11):3057 － 3063.

［13］Sung JH，Cho EH，Min W，et al.Identification of proteins regulated by estradiol in focal cerebral ischemic injury－a proteomics approach［J］.Neurosci Lett，2010，477(2):66 －71.