王淑秋， 李曉捷， 姜志梅， 秦曉玉， 韓玉澤， 劉 蕾，劉君星， 王芳芳， 梁衍峰， 王淑湘

(佳木斯大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研究室，2康復(fù)醫(yī)學(xué)院，3兒童神經(jīng)康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154007)

癲癇發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)元損傷，其中有一部分是通過細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)從線粒體釋放入胞漿是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而引起Cyt C自線粒體釋放的主要原因是活性氧的損傷和線粒體的Ca2+超載［1］。靈芝孢子粉是一種名貴的中藥材含豐富的維生素C、維生素E及其它能清除自由基的物質(zhì)，在每100 g孢子中，維生素E含量超過60 mg，在線粒體中，維生素E能有效地消除該部位電子傳遞體系單價泄漏產(chǎn)生的O-·2，減少體內(nèi)自由基數(shù)量［2-4］。本文將通過研究靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、總抗氧化能力(total antioxidative capacity，T-AOC)、Cyt C、線粒體Ca2+和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的影響，探討靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制。

材料和方法

1 主要試劑與儀器

戊四氮(pentetrazole，PTZ)購自 Sigma，用前以雙蒸水配制成溶液，濃度為10 g/L;靈芝孢子粉:佳木斯市野生靈芝種植基地，品種為赤芝Ganoderma lucidum(Leyss，ex Fr);用前以雙蒸水配制成溶液，濃度為30 g/L;SOD、MDA、T-AOC檢測試劑盒及HSP70、BDNF免疫組化試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 健康雄性Wistar大鼠30只，體重150-230 g，普通級動物，由佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號為黑動字第99102001號。實(shí)驗(yàn)過程中動物的處置符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。按體重將大鼠隨機(jī)分為3組:空白對照組、癲癇模型組和靈芝孢子粉組，每組10只。

2.2 模型制備 參照Morgan等［5］的方法并加以改進(jìn)，靈芝孢子粉組和癲癇模型組用PTZ亞驚厥劑量(32 mg/kg)，每天1次，腹腔注射28 d，停藥1周，再用相同劑量的PTZ測試，凡顯示連續(xù)5次2級以上驚厥的大鼠為達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)［6］。對照組給予等量生理鹽水。

2.3 動物的處理 戊四氮癲癇模型制備成功后，靈芝孢子粉組給予靈芝孢子粉灌胃，劑量為150 mg/kg;癲癇模型組和對照組給予等量生理鹽水灌胃，1 次/d，持續(xù)28 d。

2.4 腦組織細(xì)胞線粒體鈣測定 采用火焰原子吸收法，將大鼠斷頭迅速取出大腦，剔除腦膜，每克腦組織加8 mL預(yù)冷的蔗糖-Tris緩沖液，用玻璃勻漿器將腦組織制成勻漿，差速離心，得到線粒體沉淀物，取線粒體懸液1.5 mL置于10 mL加蓋刻度試管中，加入濃硝酸5 mL，陰暗處硝化1周。然后烘箱加熱使硝酸盡量分解蒸發(fā)，加入1%氯化鑭至10 mL。混勻，原子火焰吸收分光計測定線粒體鈣的吸光度;同時測定線粒體懸液的蛋白濃度，將各樣品的蛋白濃度調(diào)整至0.2 g/L。

2.5 腦組織胞漿及線粒體內(nèi)Cyt C的測定 采用改良的張均田［7］方法測定，每克腦組織加入19 mL預(yù)冷的分離介質(zhì)，用電動玻璃勻漿后，制成10%勻漿。600 r/min離心15 min，取上清液;4℃ 18 000 r/min離心15 min，取上清液留樣，進(jìn)行胞漿Cyt C測定。沉淀加入0.1 mol/L Tris-HCl 0.5 mL制成線粒體懸液。線粒體懸液和胞漿中加入10 mg連二亞硫酸鈉，520 nm測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

2.6 腦組織中HSP70和BDNF表達(dá)的檢測 使用免疫組織化學(xué)方法，常規(guī)固定和包埋大腦皮質(zhì)和海馬組織。組織做連續(xù)冠狀切片。染色切片在BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)顯微鏡下觀察，呈棕黃色顆粒者為陽性。每張切片觀察10個有代表性的視野(×100)，并計數(shù)每一個視野的陽性細(xì)胞數(shù)以檢測HSP70和BDNF的表達(dá)情況。

2.7 MDA含量、SOD和T-AOC活性的測定 按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間差異采用完全隨機(jī)設(shè)計成組資料的方差分析，各因素之間關(guān)系用直線相關(guān)分析。

結(jié) 果

1 動物模型復(fù)制

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時癲癇模型組和靈芝孢子粉組動物均有連續(xù)多次的Ⅲ-Ⅴ級癲癇發(fā)作，根據(jù)文獻(xiàn)報道的標(biāo)準(zhǔn)可以認(rèn)為上述2組實(shí)驗(yàn)動物均達(dá)到點(diǎn)燃標(biāo)準(zhǔn)，癲癇模型復(fù)制成功。

2 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織線粒體Ca2+和細(xì)胞色素C含量的影響

結(jié)果見表1，與癲癇模型組相比，靈芝孢子粉組大鼠腦細(xì)胞線粒體Ca2+水平和線粒體內(nèi)Cyt C含量顯著增高(P＜0.01);而胞漿內(nèi)Cyt C含量明顯低于癲癇模型組(P＜0.05)。

表1 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織線粒體鈣和細(xì)胞色素C的影響Table 1.The content change of mitochondrial Ca2+and Cyt C in brain tissues(±s.n=8)

表1 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織線粒體鈣和細(xì)胞色素C的影響Table 1.The content change of mitochondrial Ca2+and Cyt C in brain tissues(±s.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs epilepsy;##P ＜0.01 vs control.

Group Mitochondrial Ca2+(mg/L)Cyt C(mmol/L)Mitochondrial Cytoplasmic Control 2.310±0.131 1.017±0.189 7.204±0.520 Epilepsy 2.132±0.115## 1.168±0.095## 8.667±0.614##Ganoderma lucidum spores 2.253±0.104＊＊ 1.471±0.120* 7.982±0.482*

3 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織HSP70表達(dá)的影響

腦組織免疫組織化學(xué)切片見表2、圖1-3，正常對照組腦內(nèi)未見HSP70的表達(dá)。與癲癇模型組相比，靈芝孢子粉治療組海馬CA3區(qū)、CA1區(qū)、大腦基底核區(qū)和大腦皮質(zhì)區(qū)HSP70陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)明顯增多，陽性反應(yīng)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P＜0.05)。

表2 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織HSP70表達(dá)的影響Table 2.The expression of HSP70 in brain tissues(±s.n=8)

表2 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織HSP70表達(dá)的影響Table 2.The expression of HSP70 in brain tissues(±s.n=8)

*P ＜0.05 vs epilepsy;##P ＜0.01 vs control.

Group Cerebral cortex Hippocampus Basal nucleus Control 0 0 0 Epilepsy 61.72±5.13## 35.74±3.71## 51.78±4.03##Ganoderma lucidum spores 73.67±6.38* 57.25±5.34* 63.53±5.64*

Figure 1.HSP70 expression in the hippocampus of rat brain(DAB，×200).圖1 大鼠海馬HSP70的表達(dá)

Figure 2.HSP70 expression in the basal nucleus of rat brain(DAB，×100).圖2 大鼠大腦基底核HSP70的表達(dá)

Figure 3.HSP70 expression in the cerebral cortex of rat brain(DAB，×100).圖3 大鼠大腦皮層HSP70的表達(dá)

4 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織MDA含量、SOD活性和T－AOC的影響

結(jié)果見表3，靈芝孢子粉組大鼠腦組織MDA水平明顯低于癲癇模型組(P＜0.05);而靈芝孢子粉組大鼠腦組織SOD和T-AOC的活性明顯高于癲癇模型組(P＜0.01，P＜0.05)。

表3 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織MDA含量、SOD活性和T－AOC的影響Table 3.The MDA content，SOD activity and T-AOC in brain tissues(±s.n=8)

表3 靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦組織MDA含量、SOD活性和T－AOC的影響Table 3.The MDA content，SOD activity and T-AOC in brain tissues(±s.n=8)

＊＊P ＜0.01 vs epilepsy;##P ＜0.01 vs control.

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5 腦組織BDNF含量變化

腦組織免疫組織化學(xué)切片，正常對照組皮質(zhì)和海馬區(qū)均有少量BDNF分布，但分布不均衡，皮質(zhì)表達(dá)高于海馬。BDNF陽性神經(jīng)元呈棕黃色，形態(tài)未見異常。癲癇模型組與正常對照組比較，陽性神經(jīng)元數(shù)目明顯增多，差異顯著(P＜0.05);靈芝孢子粉組與模型組相比，皮質(zhì)和海馬區(qū)BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)目進(jìn)一步增多，差異顯著(P＜0.05)，見表4、圖4、5。

表4 各組皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)BDNF表達(dá)水平Table 4.The expression of BDNF in brain tissues(±s.n=10)

表4 各組皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)BDNF表達(dá)水平Table 4.The expression of BDNF in brain tissues(±s.n=10)

*P ＜0.05 vs epilepsy;#P ＜0.05 vs control.

Control 11.00±2.25 6.00±1.75 Epilepsy 23.75±4.00# 11.75±2.75#Ganoderma lucidum spores 32.50±6.00* 20.75±3.25*

Figure 4.The BDNF expression in the cortex of rat brain(DAB，×400).圖4 大鼠皮質(zhì)區(qū)BDNF的表達(dá)

Figure 5.The BDNF expression in the hippocampus of rat brain(DAB，×400).圖5 大鼠海馬區(qū)BDNF表達(dá)

討 論

在各種癲癇模型中可以觀察到神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象存在，而癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)則是頻繁而持續(xù)地癲癇發(fā)作。SE模型中，神經(jīng)細(xì)胞在24 h內(nèi)開始死亡，72 h達(dá)高峰，主要是海馬的CA1和CA3區(qū)的錐體細(xì)胞丟失，SE后6 d在CA1和CA3區(qū)可見明顯的DNA片段，神經(jīng)元形態(tài)有明顯的凋亡征象［8，9］。在過去，人們認(rèn)為細(xì)胞核決定細(xì)胞凋亡，但是隨著細(xì)胞死亡生物學(xué)的研究，人們將更多的關(guān)注放在了線粒體上，因?yàn)樗鼈兪羌?xì)胞凋亡的控制中心。在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡特征出現(xiàn)之前，線粒體膜的完整性已發(fā)生了很大變化，這些變化包括線粒體內(nèi)膜、外膜和線粒體通透性轉(zhuǎn)變(mitochondrial permeability transition，MPT)，其在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。MPT是由于通透性轉(zhuǎn)變孔(permeability transition pore，PTP)的開放引起［10，11］，MPT 可使電子呼吸鏈解偶聯(lián)和氧化磷酸化，導(dǎo)致三磷酸腺苷的產(chǎn)生明顯減少;線粒體對分子量小于1 500 kD分子的通透增加;線粒體內(nèi)Ca2+和Cyt C釋放，內(nèi)膜跨膜電位(Δφm)徹底消失;線粒體腫脹和破壞。如果開放的PTP是暫時的，線粒體仍可給細(xì)胞提供能量，細(xì)胞不會立即壞死，但線粒體同時釋放的Cyt C和凋亡誘導(dǎo)因子可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［12-14］。

近年來，對Cyt C的認(rèn)識已經(jīng)從其對能量代謝的控制進(jìn)展為對其參與凋亡過程的研究，Cyt C自線粒體釋放入胞漿是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［15］。線粒體內(nèi)的Cyt C移位至胞質(zhì)，并與凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)結(jié)合，在Apaf-1的介導(dǎo)下，Cyt C首先使caspase-9前體裂解產(chǎn)生活化的caspase-9，后者再使caspase-3前體裂解產(chǎn)生活化的caspase-3，而活化的 caspase-3啟動凋亡通路，引起多聚ADP核糖聚合酶斷裂，核小體間DNA水解、細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)邊集、核碎裂［16］。此過程中線粒體上PTP開放是關(guān)鍵，Ca2+、Pi、自由基等氧化因子、游離脂肪酸以及電子傳遞鏈抑制劑等可以誘導(dǎo)PTP開放［17］，其中以線粒體Ca2+超載和自由基損傷作用最為重要，Ca2+是PTP開放的關(guān)鍵，研究證明當(dāng)線粒體內(nèi)游離Ca2+濃度低于0.2 μmol/L時，PTP失活;而濃度高于10 μmol/L 時，則誘導(dǎo) PTP 開放［18］。

癲癇發(fā)作時神經(jīng)末梢釋放大量的谷氨酸，并通過神經(jīng)元細(xì)胞膜上的N-甲基-D-天冬氨酸受體介導(dǎo)Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，造成神經(jīng)元細(xì)胞Ca2+超載，從而細(xì)胞內(nèi)高濃度Ca2+順電-化學(xué)梯度進(jìn)入線粒體內(nèi)，造成線粒體Ca2+超載，從而誘導(dǎo)PTP開放。此外，氧化應(yīng)激是調(diào)節(jié)PTP開放的又一個重要因素。有研究表明癲癇發(fā)作后，活性氧的產(chǎn)生大量增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過自身內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力［4］，許多動物誘發(fā)的癲癇模型可檢測到大量活躍的自由基。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了這一點(diǎn)，大量自由基不僅可以造成細(xì)胞膜和線粒體的損傷，而且還可以通過氧化PTP上的硫醇而觸發(fā)PTP開放［19］。

靈芝孢子粉含豐富的維生素C、維生素E等天然的抗氧化成分，可有效清除癇性發(fā)作產(chǎn)生的自由基，具有減輕癲癇發(fā)作保護(hù)神經(jīng)元的作用［20］。本研究表明，靈芝孢子粉組腦組織SOD活性和T-AOC明顯高于癲癇模型組;而MDA含量則明顯低于癲癇模型組，同時發(fā)現(xiàn)靈芝孢子粉組線粒體內(nèi)Cty C含量顯著高于癲癇模型組;而胞漿內(nèi)Cty C含量則明顯低于癲癇模型組，提示靈芝孢子粉是通過清除癲癇大鼠腦組織自由基、提高機(jī)體的抗氧化能力來減輕細(xì)胞膜和線粒體膜的損傷，使生物膜的完整性和正常功能得以保持，減輕神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載，降低胞漿與線粒體基質(zhì)之間的電-化學(xué)梯度，進(jìn)而減輕線粒體內(nèi)的Ca2+超載，使線粒體膜上的PTP處于關(guān)閉狀態(tài)，阻止Cyt C從線粒體進(jìn)入胞漿;與此同時由于癇性發(fā)作過多生成的自由基得以清除，通過自由基誘導(dǎo)線粒體PTP開放途徑被阻斷，進(jìn)而阻止電子呼吸鏈與氧化磷酸化的解偶聯(lián)，恢復(fù)線粒體的能量代謝、防止線粒體生成過多的自由基，阻斷自由基與線粒體之間的惡性循環(huán)。

本研究表明，靈芝孢子粉組線粒體鈣含量明顯高于癲癇模型組，其原因是由于靈芝孢子粉清除癇性發(fā)作過程中過多產(chǎn)生的自由基，減少自由基對線粒體膜的攻擊;同時能夠減輕線粒體的Ca2+超載，二者共同作用來保持線粒體形態(tài)和功能的完整性，維持線粒體的正常儲鈣功能;阻止線粒體PTP開放，防止Ca2+經(jīng)PTP進(jìn)入胞漿內(nèi)。由于本實(shí)驗(yàn)采用的是慢性癲癇模型，長期的癇性發(fā)作對線粒體造成嚴(yán)重的損傷，PTP過度開放，線粒體內(nèi)的物質(zhì)如Ca2+、Cty C由線粒體進(jìn)入胞漿內(nèi)，使線粒體內(nèi)的Ca2+減少，過多的Ca2+進(jìn)入胞漿造成細(xì)胞Ca2+超載，它通過一系列生化反應(yīng)使細(xì)胞受到損傷;而進(jìn)入胞漿內(nèi)的Cty C則通過激活caspase-3途徑誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，靈芝孢子粉組大鼠皮質(zhì)和海馬部位BDNF陽性神經(jīng)元數(shù)目進(jìn)一步增多，證明靈芝孢子粉可促進(jìn)癲癇大鼠BDNF的表達(dá)，延長其表達(dá)時程，保護(hù)并促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)能，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。應(yīng)用靈芝孢子粉治療后，大腦皮質(zhì)及海馬區(qū)的HSP70免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元較對照組明顯增多，陽性強(qiáng)度亦增強(qiáng)，同時同一區(qū)域內(nèi)異常神經(jīng)元的數(shù)目明顯減少。提示靈芝孢子粉可能通過增加HSP70合成發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用，靈芝孢子粉是如何在癲癇狀態(tài)下促進(jìn)HSP70在腦組織中的表達(dá)尚需進(jìn)一步的研究。

綜上所述，靈芝孢子粉對癲癇大鼠腦細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是靈芝孢子粉通過減輕神經(jīng)元細(xì)胞Ca2+超載，穩(wěn)定線粒體的儲鈣功能;清除自由基、增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力，從而減輕自由基對線粒體膜的損傷作用，恢復(fù)線粒體的能量代謝，減輕腦細(xì)胞的損傷與凋亡。

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