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        缺血后適應(yīng)對腦缺血樹鼩海馬TLR4表達(dá)的影響*

        2011-01-30 03:58:06李樹清
        中國病理生理雜志 2011年6期
        關(guān)鍵詞:血栓性腦缺血海馬

        馮 蕊, 李樹清

        (昆明醫(yī)學(xué)院 1第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,2病理生理學(xué)教研室,云南昆明650031)

        腦缺血所導(dǎo)致的炎癥瀑布反應(yīng)在腦損傷中具有重要作用,其機(jī)制迄今尚不明了。已知固有免疫(innate immunity)可影響腦缺血后炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為快速而相對直接的炎癥反應(yīng),可與修飾后的內(nèi)源性抗原分子相互作用[1]。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)則是固有免疫的核心作用因子[2]。國外最新研究[1,3]認(rèn)為 TLR與缺血耐受/免疫耐受密切相關(guān),阻斷TLR及炎癥細(xì)胞因子信號途徑有助于腦和其它器官的缺血耐受。免疫耐受的可能機(jī)制是影響了TLR/細(xì)胞因子途徑,在刺激機(jī)體炎癥反應(yīng)的同時也激發(fā)了機(jī)體抵抗炎癥反應(yīng)的防御機(jī)制。最近有關(guān)TLR在腦缺血中生物學(xué)作用的研究備受關(guān)注,但與后適應(yīng)的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。

        本研究以光化學(xué)法誘導(dǎo)樹鼩血栓性腦缺血模型,觀察血栓性腦缺血時海馬的病理組織學(xué)改變,并定量檢測缺血后適應(yīng)對腦缺血不同時間海馬TLR4蛋白及mRNA表達(dá)的動態(tài)改變,探討后適應(yīng)的腦保護(hù)作用是否與調(diào)控TLR4表達(dá)有關(guān),為臨床缺血性腦疾病的防治開辟出一條新的保護(hù)途徑,具有重要的實(shí)踐意義。

        材料和方法

        1 動物

        健康成年樹鼩126只,雌雄不限,體重(120±20)g,昆明醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。整個實(shí)驗(yàn)過程均由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)、監(jiān)督與檢查。避光、清潔、安靜環(huán)境飼養(yǎng),隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham)、缺血4 h 組(ischemia 4 h,I 4 h)、缺血24 h組(ischemia 24 h,I 24 h),缺血 72 h組(I 72 h)、缺血后適應(yīng)4 h組(IP 4 h)和缺血后適應(yīng)24 h組(IP 24 h)和缺血后適應(yīng)72 h組(IP 72 h),共計(jì)7個組,每組6只。實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前及術(shù)后自由進(jìn)食進(jìn)水。

        2 樹鼩血栓性腦缺血模型的建立

        按照李樹清等[4]的方法,使用腦血栓形成裝置建立樹鼩局灶性腦缺血模型。以1%硫噴妥鈉(5 mg·kg-1)腹腔注射麻醉動物,矢狀切開頭皮1 cm,細(xì)心分離部分顳肌以暴露頂區(qū)顱骨,用一塊含直徑0.5 cm窗孔的鋁片屏蔽照射區(qū),鋁片周圍使用遮光紙遮蓋保護(hù)。實(shí)驗(yàn)組動物經(jīng)舌下靜脈一次性注射孟加拉紅生理鹽水(1.33 mL·kg-1),循環(huán)10 min后,將動物置于SQ-Ⅲ型光化學(xué)誘導(dǎo)腦血栓形成裝置下,使光束透過鋁片窗孔直接照射于顱骨表面,在光強(qiáng)度1W.cm2下照射15 min,照射期間維持顱骨表面溫度于(36±1)℃。術(shù)后取出鋁片,消毒并逐層縫合切口,放入飼養(yǎng)籠,被蓋以保持體溫。假手術(shù)組按規(guī)定劑量注射孟加拉紅而不予光照處理。各組動物術(shù)后待清醒后自由進(jìn)水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)后4 h、24 h及72 h分別取材、觀察。

        3 缺血后適應(yīng)模型的建立

        按照李樹清等[4]的方法,于光化學(xué)法血栓性腦缺血模型復(fù)制成功后,在缺血4 h時點(diǎn)前40 min,用1%硫噴妥鈉(2.5 mg·kg-1)重新麻醉動物,分離缺血側(cè)頸總動脈,在缺血4 h時點(diǎn)前30 min以無創(chuàng)動脈夾在甲狀軟骨上緣平面夾閉頸總動脈,5 min后去除動脈夾再灌注5min,如此夾閉-打開共計(jì)重復(fù)3個循環(huán),共用時30 min。術(shù)后縫合動物頸部創(chuàng)口,保暖回籠,待清醒后自由進(jìn)水、進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)后4 h、24 h及72 h分別取材、觀察。

        4 腦組織灌注與內(nèi)固定

        腦缺血后不同時點(diǎn)(4 h、24 h、72 h)或后適應(yīng)后不同時點(diǎn)(4 h、24 h、72 h)再次麻醉動物,固定動物于手術(shù)臺板上,用眼科剪剪開腹腔,打開胸腔,剪開心包結(jié)扎降主動脈,自心尖部插入一聚乙烯管,使其進(jìn)入升主動脈,扎閉主動脈根部以防回流,剪開右心耳,灌注預(yù)冷的生理鹽水100 mL,待肝臟變白后,再換為在120 mmHg壓力下緩慢滴注固定液10%甲醛200 mL行內(nèi)固定2 h。固定完畢打開顱骨,取腦,再浸泡于10%甲醛中后固定24 h,腦組織與固定液之比為1∶20。常規(guī)脫水、透明、浸蠟,石蠟包埋制作蠟塊標(biāo)本,保存于4℃冰箱備用。行HE染色作光鏡檢查。

        5 Western blotting定量檢測TLR4蛋白的表達(dá)

        BCA法總蛋白質(zhì)含量測定。95℃裂解3-5 min,使蛋白質(zhì)變性。SDS-PAGE垂直電泳120 V、90 min分離蛋白質(zhì),并轉(zhuǎn)膜100 mA、150 min,5%脫脂牛奶37℃封閉30 min。TLR4抗兔多克隆抗體(1∶600,sc-30002,Santa Cruz)或 β -actin抗鼠單克隆抗體(1∶5 000,Abcam)4 ℃孵育過夜,0.1%TBST(Tris-buffered saline-Tween-20)洗 3次,每次15 min,辣根過氧化物酶標(biāo)記Ⅱ抗(1∶5 000,KPL,Gaithersburg)37 ℃孵育1 h,0.1%TBST 洗3次,每次15 min?;瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)試劑盒(KPL,Gaithersburg)進(jìn)行反應(yīng),顯示目的蛋白質(zhì),暗室曝光。掃描X光片,用Pharmacia ImageMaster VDS軟件分析目標(biāo)帶的吸光度值。

        6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)定量檢測TLR4 mRNA的表達(dá)

        采用Bio-Tek離心柱型高純總RNA快速提取試劑盒進(jìn)行組織總RNA的提取。紫外分光光度儀測定RNA樣品純度和含量。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積 40 μL:含總 RNA 7.8 μg、Oligo(dT)18primer 2 μL加 DEPC 水至 24 μL、5 × reaction buffer 8 μL、Ribo-LockTMRNase inhibitor(2 ×107U/L)2 μL、10 mmol/L dNTP Mix 4 μL、RevertAid M - MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(2×108U/L)2 μL,42 ℃孵育60 min,70 ℃終止反應(yīng)5 min,cDNA產(chǎn)物-20℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增,以cDNA為模板,在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行,PCR總反應(yīng)體積 50 μL:RT 產(chǎn)物(cDNA)2 μL、下游引物 1 μL、上游引物 1 μL、2 ×Power Tag PCR MasterMix 25 μL,加ddH2O補(bǔ)足至50 μL。按下述反應(yīng)條件進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng):94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃45 s,35個循環(huán);72℃ 7 min。目的基因TLR4及內(nèi)對照β-actin引物序列見表1。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加樣,以500 bp的DNA marker作標(biāo)記于2%瓊脂糖中電泳90 min(電壓100 V),溴乙啶染色,紫外分析儀下檢測擴(kuò)增產(chǎn)物,照片后用Pharmacia ImageMaster VDS軟件分析目標(biāo)帶的吸光度值。

        表1 RT-PCR引物序列Table 1.Sequences of primers for RT-PCR

        7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        結(jié) 果

        1 后適應(yīng)對腦缺血海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)改變的影響

        隨缺血時間的延長,海馬損傷進(jìn)行性加重,后適應(yīng)后各時點(diǎn)損傷均明顯減輕。假手術(shù)組海馬結(jié)構(gòu)完整,層次清晰,海馬神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)未見異常,CA1區(qū)椎體細(xì)胞形態(tài)正常,細(xì)胞核大而園,核仁明顯,見圖1。缺血4 h時海馬可見數(shù)個神經(jīng)元嗜酸性變,后適應(yīng)4 h組可見神經(jīng)元嗜酸性變減少;缺血24 h時可見大量神經(jīng)元嗜酸性變、核固縮,結(jié)構(gòu)紊亂,見圖2,后適應(yīng)24 h組海馬神經(jīng)元損害明顯減輕,見圖3;缺血72 h時可見神經(jīng)元減少,細(xì)胞層次減少,后適應(yīng)72 h組神經(jīng)元嗜酸性變減少,細(xì)胞層次增加。

        Figure 1.Histological structure of hippocampus in tree shrews from sham -operation group(HE staining,×400).圖1 假手術(shù)組海馬組織結(jié)構(gòu)

        Figure 2.Histological changes of hippocampus 24 h after cerebral ischemia in tree shrews in I24h group(HE staining,×400).圖2 缺血24 h海馬組織學(xué)改變

        Figure 3.Histological changes of hippocampus 24 h after cerebral ischemia in tree shrews in IP24h group(HE staining,×400).圖3 缺血后適應(yīng)24 h海馬組織學(xué)改變

        2 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應(yīng)不同時點(diǎn)海馬TLR4蛋白的表達(dá)

        血栓性腦缺血后4 h和24 h海馬TLR4蛋白表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)(P<0.05),72 h與假手術(shù)組相比表達(dá)減弱(P<0.05)。隨缺血時間的延長(4 h、24 h、72 h),缺血組TLR4的表達(dá)呈逐漸減少趨勢,72 h時最低。后適應(yīng)處理組與假手術(shù)組對比,4 h TLR4表達(dá)有所增多,但無顯著差異(P>0.05),24 h TLR4表達(dá)顯著減少(P<0.05),72 h TLR4表達(dá)增多(P<0.05)。后適應(yīng)組與缺血組對比,經(jīng)后適應(yīng)處理后4 h和24 h海馬TLR4表達(dá)顯著減少(P<0.05),但72 h海馬TLR4表達(dá)增加(P<0.05),見圖4、5。

        Figure 4.Representative Western blotting image of TLR4 in ischemic hippocampus of tree shrews at different time points.Sham:sham - operation group;I4 h,I24 h and I72 h:ischemia 4 h,24 h and 72 h groups,respectively;IP4 h,IP24 h and IP72 h:ischemic postconditioning 4 h,24 h and 72 h groups,respectively.圖4 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應(yīng)不同時點(diǎn)海馬TLR4免疫印跡

        Figure 5.The TLR4 protein expression in hippocampus of tree shrews at different time points after cerebral ischemia.±s.n=6.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs the cerebral ischemia group.圖5 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應(yīng)不同時點(diǎn)海馬TLR4蛋白表達(dá)

        3 缺血后適應(yīng)對腦缺血不同時點(diǎn)海馬TLR4 mRNA表達(dá)的影響

        結(jié)果顯示:與對照組相比,血栓性腦缺血后4 h、24 h及72 h海馬TLR4 mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)。隨缺血時間的延長(4 h、24 h、72 h),缺血組TLR4 mRNA表達(dá)進(jìn)行性降低(4 h、24 h),72 h最低。后適應(yīng)處理組與正常組對比,4 h TLR4 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05),24 h和72 h TLR4 mRNA 表達(dá)增加(P<0.05)。后適應(yīng)組與缺血組對比,經(jīng)后適應(yīng)處理后在4 h和24 h時點(diǎn),TLR4 mRNA表達(dá)較腦缺血組明顯減少(P<0.05),然而72 h時點(diǎn)TLR4 mRNA表達(dá)較腦缺血組明顯增多(P<0.05)。后適應(yīng)組TLR4 mRNA表達(dá)總的趨勢是逐漸遞增的,見圖6、7。RT-PCR分析顯示海馬TLR4 mRNA的表達(dá)規(guī)律與Western blotting分析所示海馬TLR4蛋白的表達(dá)規(guī)律基本一致。

        Figure 6.RT-PCR analysis of mRNA expression of TLR4 and β-actin in hippocampus of tree shrews after cerebral ischemia and ischemic postconditioning.Lane 1,2:sham - operation group;Lane 3,4:ischemia 4 h group;Lane 5,6:ischemic postconditioning 4 h group;Lane 7,8:ischemia 24 h group;Lane 9:marker of DL500;Lane 10,11:ischemic postconditioning 24 h group;Lane 12,13:ischemia 72 h group;Lane 14,15:ischemic postconditioning 72 h group.圖6 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應(yīng)不同時點(diǎn)海馬TLR4 mRNA表達(dá)

        Figure 7.The TLR4 mRNA expression in ischemic hippocampus of tree shrews at different time points after cerebral ischemia.±s.n=6.*P<0.05 vs sham;#P<0.05 vs the cerebral ischemia group.圖7 樹鼩血栓性腦缺血及缺血后適應(yīng)不同時點(diǎn)海馬TLR4mRNA表達(dá)

        討 論

        上世紀(jì)80年代有學(xué)者發(fā)現(xiàn)果蠅背腹部體軸分化發(fā)育所必需的一種跨膜蛋白,稱之為Toll樣受體。1997年,首次證實(shí)人Toll樣受體與果蠅同源。TLR廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng),在應(yīng)對感染、缺血、創(chuàng)傷等損傷方面發(fā)揮重要作用,而TLR則是固有免疫的核心作用因子[2]。TLR4是Toll樣受體家族研究頗多且極具代表性的一個。神經(jīng)元已被證實(shí)可表達(dá)TLR4[5]。受損組織和壞死細(xì)胞以及血管和細(xì)胞間質(zhì)損傷后可釋放TLR4的內(nèi)源性激活物,由TLR4觸發(fā)級聯(lián)免疫炎癥反應(yīng),TLR4極可能是腦內(nèi)免疫炎癥反應(yīng)鏈條上的上游核心作用因子[6]。缺血后適應(yīng)的發(fā)現(xiàn)提示,機(jī)體缺血狀態(tài)下,內(nèi)部天然內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制的激活對機(jī)體抗損傷反應(yīng)具有特殊的生物學(xué)意義。缺血后適應(yīng)可能有賴于TLR及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)變化來抑制缺血所致免疫炎癥反應(yīng)。缺血后適應(yīng)可調(diào)節(jié)機(jī)體異常的免疫炎癥反應(yīng),激活機(jī)體內(nèi)源性調(diào)節(jié)保護(hù)機(jī)制,避免更嚴(yán)重的細(xì)胞損傷[7]。新近研究發(fā)現(xiàn)后適應(yīng)可產(chǎn)生某種抗炎癥反應(yīng)效應(yīng)[8]。

        本研究發(fā)現(xiàn)血栓性腦缺血組海馬TLR4表達(dá)明顯增加,提示腦缺血時TLR4作為炎性損傷因子與缺血后腦損傷相關(guān),與既往報(bào)道[9]一致。腦缺血后4 h及24 h海馬TLR4蛋白和 mRNA的表達(dá)增強(qiáng),可能與嚴(yán)重腦缺血所致細(xì)胞應(yīng)激,蛋白合成加速有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)TLR4是神經(jīng)元死亡的主要原因,TLR4活化小膠質(zhì)細(xì)胞及TLR4信號啟動炎癥毒性反應(yīng)與此有關(guān)[10]。隨缺血時間的延長,缺血組TLR4的表達(dá)呈逐漸減少趨勢,缺血72 h時TLR4蛋白和 mRNA的表達(dá)恢復(fù)至對照水平,與我室既往觀察其它指標(biāo)的變化趨勢一致,可能與腦缺血后期腦組織的抗損傷反應(yīng)有關(guān),對受損細(xì)胞的修復(fù)可能具有積極意義。后適應(yīng)處理后4 h和24 h TLR4蛋白表達(dá)減少,而后適應(yīng)72 h TLR4蛋白表達(dá)增加。海馬TLR4 mRNA的表達(dá)趨勢與蛋白表達(dá)基本一致。同時伴隨的是后適應(yīng)各時點(diǎn)海馬神經(jīng)元損傷明顯減輕。后適應(yīng)產(chǎn)生的神經(jīng)元保護(hù)作用與我室的前期研究相吻合。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)缺血后適應(yīng)有較好的腦保護(hù)作用,表現(xiàn)為增加局部腦血流[4],縮小皮層梗塞面積以及抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的凋亡(另文)。后適應(yīng)可使4、24 h時點(diǎn)TLR4蛋白及mRNA表達(dá)減弱,提示TLR4在腦缺血中的作用可能具有損傷效應(yīng)。

        然而后適應(yīng)致72h TLR4蛋白及mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)的機(jī)制值得進(jìn)一步探索。同時,我們也觀察到在后適應(yīng)各時點(diǎn)TLR4蛋白及mRNA表達(dá)是呈逐漸增高的趨勢,這也提示TLR4在腦缺血后適應(yīng)中的作用是一個動態(tài)連續(xù)的過程。TLR4可促進(jìn)腦組織再生修復(fù)[11]。Marsh等[12]研究認(rèn)為預(yù)適應(yīng)可“再編輯”TLR信號通路,最終達(dá)到某種炎癥因子和抗炎因子之間的平衡,起到腦保護(hù)作用,這種內(nèi)源性的調(diào)控機(jī)制是機(jī)體有效的自我保護(hù)措施。我們推測后適應(yīng)是否亦有類似作用,后適應(yīng)的腦保護(hù)作用在腦缺血損傷急性期(<72 h)可能與抑制TLR4的表達(dá)有關(guān),但在腦缺血損傷中后期(≥72 h)可能與TLR4表達(dá)增加有關(guān)。Buchanan等[13]亦認(rèn)為TLR4既可以起保護(hù)作用又可以是損傷性因子,這取決于不同的神經(jīng)生理?xiàng)l件。海馬TLR4蛋白和mRNA的表達(dá)均在缺血4 h達(dá)高峰,其TLR4的動態(tài)變化在時間進(jìn)程上較皮層的24 h要早(待發(fā)表),顯然與海馬特殊的結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)。

        綜上所述,TLR4可能在缺血后適應(yīng)介導(dǎo)的腦保護(hù)機(jī)制中發(fā)揮作用,今后尚有待更多更全面深入的研究予以證實(shí),同時早日將缺血后適應(yīng)運(yùn)用到臨床缺血性腦卒中的防治中去。

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