何 芳， 彭 鏡， 鄧小鹿， 楊麗芬， 吳麗文， 張慈柳， 尹 飛

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)院兒科，湖南長沙410008)

內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的組成成分。中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染時LPS表達(dá)顯著升高，導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，最終引發(fā)血管源性腦水腫，后者是導(dǎo)致患兒致殘致死的主要原因之一。緊密連接(tight junction，TJ)是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞間的主要連接方式之一，對維持血腦屏障(blood brain barrier，BBB)結(jié)構(gòu)和功能的完整性的有重要作用。我們前期研究已證實LPS能破壞TJ，導(dǎo)致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加［1］，但具體調(diào)控機制不明。NF－κB是一種核蛋白因子，參與眾多與免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄。NF－κB活化后，增加多種細(xì)胞因子(IL－8、IL－1、TNF－α等)的轉(zhuǎn)錄，這些因子可引起B(yǎng)BB通透性增加。最近的研究發(fā)現(xiàn)IL－1引起的腸上皮細(xì)胞通透性增高與NF－κB介導(dǎo)的TJ蛋白的表達(dá)與分布異常密切相關(guān)［2］。那么NF－κB是否通過調(diào)控TJ蛋白的狀態(tài)，參與了LPS引起的腦血管內(nèi)皮細(xì)通透性增高的過程?目前國內(nèi)外均未見研究報道。本研究以小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3和利用負(fù)性質(zhì)粒抑制了NF－κB活化的bEnd.3/muIκBα細(xì)胞為實驗對象，分別檢測了LPS對此二者的屏障功能、TJ蛋白ZO－1、claudin－5的表達(dá)以及細(xì)胞骨架蛋白F－actin分布的不同影響，旨在探討LPS是否通過NF－κB信號途徑誘導(dǎo)bEnd.3細(xì)胞TJ破壞，進(jìn)而增加其通透性。

材料和方法

1 材料

永生化小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株bEnd.3、DNMu－IκBα 質(zhì)粒和Pnf－kb－luc質(zhì)粒(美國芝加哥大學(xué)章堅教授饋贈)，細(xì)胞培養(yǎng)插入皿(Corning，0.4 μm孔徑，24孔板)，Millicell－ESR電阻儀(Millipore)，胎牛血清(Gibco)，Lipofectamine 2000(Invitrogen)，羅丹明－鬼筆環(huán)肽(Invitrogen)，螢火蟲熒光素酶報告基因檢測底物(Sigma)，鼠抗兔ZO－1Ⅰ抗和claudin－5Ⅰ抗(Santa Cruz)，鼠抗羊肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)Ⅰ抗和磷酸化MLC(p－MLC)Ⅰ抗(Santa Cruz)。其余生化試劑均為進(jìn)口分裝或國產(chǎn)分析純試劑。

2 方法

2.1 bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基(4.5 g/L葡萄糖，3.7 g/L碳酸氫鈉，4 mmol/L谷氨酰胺，10%胎牛血清)，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，約3 d細(xì)胞基本融合。以1×107cells/L的密度將bEnd.3細(xì)胞懸液0.3 mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)插入皿內(nèi)池，并于外池加入完全培養(yǎng)基1.2 mL，保證內(nèi)外池兩側(cè)液面相等，倒置相差顯微鏡下每日觀察bEnd.3細(xì)胞形態(tài)變化。

2.2 實驗分組 實驗分 3組:bEnd.3細(xì)胞組、bEnd.3/vector細(xì)胞組和 bEnd.3/muIκBα 細(xì)胞組，后2組分別為轉(zhuǎn)染空載pcDNA3.1hygro質(zhì)粒和IκBα顯性負(fù)性突變體 DNMu－IκBα質(zhì)粒的 bEnd.3細(xì)胞。各組又根據(jù)LPS(100 mg/L)作用時間不同分為0、0.5、3、6 和12 h 5 個亞組。

2.3 熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測NF－κB活性 采用Invitrogen公司的Lipofectamine 2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，步驟按說明書進(jìn)行:將細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞生長融合達(dá)90%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，bEnd.3組細(xì)胞每孔分別加入4 μL脂質(zhì)體和2 μg Pnf－kb－luc質(zhì)粒，bEnd.3/muIκBα 組細(xì)胞每孔分別加入 6 μL 脂質(zhì)體和 2 μg Pnf－ kb － luc+1 μg DNMu － IκBα，bEnd.3/vector組細(xì)胞每孔分別加入6 μL脂質(zhì)體和2 μg Pnf－ kb － luc+1 μg pcDNA3.1hygro。轉(zhuǎn)染 48 h后，按分組中所示時點分別加入LPS預(yù)處理。收集處理后各細(xì)胞樣本，按熒光素酶活性檢測試劑操作指南提供的方法裂解、離心，從每個樣本取20 μL上清，分別與100 μL熒光檢測試劑(試劑盒提供)混合，置TD－20/20熒光單光子檢測儀(Bio－Rad)中讀數(shù)得到各樣品的單光子儀讀數(shù)。同時利用BCA法檢測各樣品蛋白濃度。各樣品NF－κB活性以RLU讀數(shù)/蛋白濃度表示。

2.4 跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻抗(transendothelial electrical resistance，TEER)測定 參照文獻(xiàn)方法應(yīng)用電阻儀測定各組細(xì)胞的TEER。為保證數(shù)值的準(zhǔn)確性，整個過程在恒定溫度下(23℃)進(jìn)行，每個細(xì)胞插入皿均取不同方向的3個點，重復(fù)測定3次。因為細(xì)胞插入皿本身也具有一定的TEER，因此標(biāo)準(zhǔn)的TEER應(yīng)將樣品的實測TEER值減去空白對照的TEER值。以未接種細(xì)胞僅在細(xì)胞插入皿內(nèi)加入等量相同培基的樣品為空白對照。TEER=(接種有細(xì)胞的樣品讀數(shù)－空白對照樣品讀數(shù))×0.33。

2.5 直接熒光染色 按實驗分組的方法預(yù)處理后，將各組樣品予 PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，隨后0.1%Triton X －100透膜10 min，再加入羅丹明－鬼筆環(huán)肽2 U/well。室溫、避光的條件下反應(yīng)45 min，PBS漂洗5次，每次2 min。熒光顯微鏡觀察拍照，激發(fā)光為綠光。

2.6 Western blotting 將細(xì)胞以1×107cells/L的密度接種于6孔板內(nèi)，按分組對細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后收集各組總蛋白，定量后－70℃保存。每孔加樣品總蛋白量20 μg，于15%或8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離;120 V恒壓濕轉(zhuǎn)120 min使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉2 h。緊密連接蛋白claudin－5、ZO－1、內(nèi)參照β－actin以及磷酸化MLC和總MLC的Ⅰ抗稀釋倍數(shù)分別為 1∶500、1∶500、1∶10 000 以及1∶300、1∶500，4 ℃下結(jié)合過夜。TBST 洗膜，10 min，4次。兔、鼠、羊Ⅱ抗稀釋倍數(shù)分別為1∶10 000、1∶15 000和 1∶4 000，室溫下結(jié)合 1 h。TBST 洗膜，10 min，4次。加入等量發(fā)光劑和增強劑，反應(yīng)2 min。X光膠片感光后顯影、定影。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1 NF－κB活性檢測結(jié)果

1.1 DNMu－IκBα 質(zhì)粒對NF－κB 活性的抑制效果

熒光素酶報告基因法結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染DNMu－IκBα質(zhì)粒48 h后，bEnd.3細(xì)胞NF－κB活性僅分別為未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的25.8%，轉(zhuǎn)染對照空載質(zhì)粒細(xì)胞的34.0%(P ＜0.05)，證實轉(zhuǎn)染 DNMu－IκBα 質(zhì)粒對bEnd.3細(xì)胞NF－κB活性有抑制作用，見圖1。

Figure 1.Inhibitory effect of DNMu－IκBα plasmid.±s.n=4.*P ＜0.05 vs bEnd.3 cells#P ＜ 0.05 vs bEnd.3/vector cells.圖1 DNMu－IκBα質(zhì)粒對bEnd.3細(xì)胞NF－κB活性的抑制效果

1.2 LPS引起 NF－κB活性改變 如圖2所示，100 mg/L LPS 作用 0.5 h，bEnd.3 和 bEnd.3/vector組細(xì)胞的 NF－κB活性顯著上升。然而 bEnd.3/muIκBα組中，LPS活化NF－κB的作用被明顯抑制。

Figure 2.Effect of LPS on activating NF － κB in bEnd.3，bEnd.3/vector and bEnd.3/muIκBα cells.The monolayer of bEnd.3 cells was treated with LPS(100 mg/L)for 0－12 h.NF－κB activity was detected by reporter gene assay.±s.n=4.*P＜0.05 vs the same group cells exposed to LPS for 0 h;#P ＜0.05 vs bEnd.3 cells exposed to LPS for the same time periods;△P ＜ 0.05 vs bEnd.3/vector cells exposed to LPS for the same time periods.圖2 LPS 對 bEnd.3、bEnd.3/vector 和 bEnd.3/muIκBα組細(xì)胞NF－κB活性的影響

2 TEER測定結(jié)果

在bEnd.3組細(xì)胞中，LPS可導(dǎo)致TEER以時間依賴性方式下降。與0 h［(80.36±2.74)Ω· cm2］相比，LPS(100 mg/L)作用 3 h，TEER開始下降［(62.02±2.02)Ω·cm2］(P ＜0.05)，12 h時降至最低水平［(49.56±3.67)Ω·cm2］，僅為未處理時基線水平的61.67%;而24 h時，細(xì)胞TEER讀數(shù)為(51.06±3.14)Ω·cm2，雖然其TEER平均值略高于LPS作用12 h時，但并無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。bEnd.3/vector組細(xì)胞TEER變化趨勢與bEnd.3組細(xì)胞一致，100 mg/L LPS作用3 h、12 h時，該組細(xì)胞TEER與同時點bEnd.3細(xì)胞相比差異不明顯(P＞0.05)。

bEnd.3/muIκBα 組中，LPS 增加細(xì)胞通透性的作用被明顯抑制。100 mg/L LPS作用3 h、12 h時，該組細(xì)胞TEER分別為(72.12±4.33)Ω· cm2和(56.23 ±2.33)Ω· cm2，與 bEnd.3 和 bEnd.3/vector組細(xì)胞相比通透性均明顯減低(P＜0.05)，見圖3。

Figure 3.Effect of LPS on the permeability of bEnd.3 ，bEnd.3/vector and bEnd.3/muIκBα cells.TEER assay was used to detect barrier function.The results showed that LPS－ induced hyperpermeability of bEnd.3 cells was alleviated in bEnd.3/muIκBα cells.±s.n=4.△P ＜0.05 vs the same group cells exposed to LPS for 0 h.*P ＜0.05 vs bEnd.3 cells exposed to LPS for the same time periods;#P ＜ 0.05 vs bEnd.3/vector cells exposed to LPS for the same time periods.圖3 LPS 對 bEnd.3、bEnd.3/vector 和 bEnd.3/muIкBα組細(xì)胞通透性的影響

3 F－actin分布變化

如圖4所示，在bEnd.3組中，未予刺激時細(xì)胞主要表現(xiàn)為致密的皮質(zhì)actin網(wǎng)絡(luò)，幾乎沒有看到應(yīng)力纖維形成(圖4A)。然而，LPS(100 mg/L)作用3 h后，細(xì)胞間出現(xiàn)少量的細(xì)胞旁空洞(圖4C);6 h時應(yīng)力纖維形成，細(xì)胞間空洞變大(圖4D);12 h時上述破壞性效果更加明顯(圖4E)。LPS對bEnd.3/vector組細(xì)胞F－actin分布的影響與bEnd.3組相似(圖4K －O)。而在 bEnd.3/muIκBα 組中，LPS引發(fā)的F－actin重組出現(xiàn)較晚，且程度明顯減輕(圖4F－J)。

4 緊密連接蛋白的表達(dá)變化

LPS作用 3 h，bEnd.3 組和 bEnd.3/vector組細(xì)胞緊密連接蛋白ZO－1的表達(dá)下降(圖5A);6 h時claudin－5蛋白表達(dá)水平也顯著降低(圖5B)。而bEnd.3/muIκBα 組中，LPS下調(diào)緊密連接蛋白 ZO －1和claudin－5的作用被明顯抑制(圖5A、B)。

5 MLC磷酸化水平改變

LPS 作用 3 h，bEnd.3 細(xì)胞和 bEnd.3/vector組MLC磷酸化明顯增高，但該現(xiàn)象在 bEnd.3/muIκBα組細(xì)胞中被阻斷，見圖6。

Figure 4.Effect of LPS on F － actin distribution in bEnd.3，bEnd.3/vector and bEnd.3/muIκBα cells.Cells were exposed to LPS(100 mg/L)for a 12 h experimental period and the shape of F－actin was detected by actin staining(×200);red:F－actin;blue:nuclear.LPS led to F －actin rearrangement in a time－dependent manner in bEnd.3(A －E)and bEnd.3/vector(K － O)cells，which occurred less often and later after inhibiting the activation of NF － κB(F － J).A，F(xiàn)，K:before LPS exposure(0 h);B，G，L:LPS exposure for 0.5 h;C，H，M:LPS exposure for 3 h;D，I，N:LPS exposure for 6 h;E，J，O:LPS exposure for 12 h.圖4 LPS 對 bEnd.3、bEnd.3/vector和 bEnd.3/muIκBα組細(xì)胞 F －actin 分布的影響

Figure 5.Effect of LPS on the expression of tight junction proteins in bEnd.3，bEnd.3/vector and bEnd.3/muIκBα cells.Expression of claudin－5 and ZO－1 was determined by Western blotting.A:time course of the effect of LPS(100 mg/L)on ZO－1 expression;B:time course of the effect of LPS(100 mg/L)on claudin－5 expression.±s.n=4.*P＜0.05 vs bEnd.3 cells exposed to LPS for the same time periods;#P ＜ 0.05 vs bEnd.3/vector cells exposed to LPS for the same time periods;△P ＜0.05 vs the same group cells exposed to LPS for 0 h.圖5 LPS對bEnd.3、bEnd.3/vector和bEnd.3/muIκBα組細(xì)胞緊密連接蛋白ZO－1和claudin－5表達(dá)水平的影響

討 論

bEnd.3細(xì)胞是永生化小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株。Brown等［3］利用 RT－PCR、Western blotting和免疫熒光法證實在結(jié)構(gòu)上該細(xì)胞株具有與原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相似的緊密連接蛋白的表達(dá)。而我們前期實驗［4］也發(fā)現(xiàn)，其 TEER 為80 －140 Ω·cm2，與大多數(shù)目前發(fā)表的各個種屬原代培養(yǎng)獲得的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的TEER值(50－180 Ω·cm2)相當(dāng)，這說明bEnd.3細(xì)胞具有良好的限制物質(zhì)通透的屏障功能。并且bEnd.3細(xì)胞還具有細(xì)胞純度高、性質(zhì)穩(wěn)定，傳代快等諸多優(yōu)點。我們通過對其TJ和通透性調(diào)控的研究，證實LPS能增加腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株細(xì)胞通透性，其機制與MLC磷酸化增加所致的緊密連接蛋白cluadin－5、ZO－1表達(dá)下調(diào)以及細(xì)胞骨架蛋白F－actin重組有關(guān)。且NF－κB活化參與此過程調(diào)控。

TJ蛋白和細(xì)胞骨架蛋白相互作用，共同維持TJ的結(jié)構(gòu)完整和正常功能，而各種細(xì)胞外刺激可以引起TJ蛋白和細(xì)胞骨架蛋白重構(gòu)，進(jìn)而破壞TJ功能。ZO－1屬于外在膜蛋白家族，是第一個被證實的TJ蛋白。越來越多的證據(jù)表明ZO－1的下調(diào)可引起TJ的重構(gòu)。而claudin－5是緊密連接中一種重要的細(xì)胞黏附分子，其主要表達(dá)在腦內(nèi)皮細(xì)胞上。已有研究認(rèn)為其直接參與了BBB的建立以及BBB屏障功能的調(diào)控［5］。本實驗發(fā)現(xiàn)LPS可下調(diào)TJ蛋白clau din－5和ZO－1的表達(dá)，以及改變claudin－5的分布，并且LPS致TJ蛋白claudin－5和ZO－1的表達(dá)量降至最低的時間與其引起代表細(xì)胞屏障功能的TEER降至最低的時間一致。此提示LPS可以通過下調(diào)claudin－5和ZO－1的表達(dá)來破壞TJ功能。此外我們發(fā)現(xiàn)ZO－1的表達(dá)在3 h開始減少，這與已有研究一致［6］。該時間遠(yuǎn)早于翻譯前水平的調(diào)控，我們推測LPS誘導(dǎo)的腦內(nèi)皮細(xì)胞ZO－1表達(dá)下調(diào)主要由翻譯或翻譯后調(diào)控介導(dǎo)，其可能與基質(zhì)金屬蛋白酶等一系列的細(xì)胞溶質(zhì)酶有關(guān)。近年來研究顯示細(xì)胞骨架蛋白actin在維持TJ復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和功能正常以及BBB低通透性方面均有重要作用［7］。我們的研究也發(fā)現(xiàn)LPS可以引起時間依賴性方式的F－actin重組，并且其變化趨勢與LPS致細(xì)胞屏障功能變化的趨勢一致。綜上，我們認(rèn)為LPS可通過破壞緊密連接蛋白以及引起F－actin重組來增加bEnd.3細(xì)胞通透性。

有文獻(xiàn)報道在部分放射損傷、癲癇以及高血壓實驗?zāi)Ｐ椭薪o實驗動物預(yù)先腹腔注射LPS可以減輕其血腦屏障的損害，提示大劑量LPS對血腦屏障具有保護(hù)作用［8］。那么這是否與LPS致血腦屏障的破壞作用矛盾呢?答案是否定的。由于機體存在大量反饋－負(fù)反饋的精密調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，建模前給予LPS腹腔注射不僅可迅速啟動機體內(nèi)一系列炎癥反應(yīng)，還可反饋性產(chǎn)生大量的保護(hù)性因子(如IL－6等)，而后者可以抵抗隨后各類損傷性建模因素對BBB的破壞。但是大量的體內(nèi)體外實驗均證明，在正常的生理情況下，LPS是一個明確的BBB的損害因子，可以引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性上升［9］，這與我們的實驗結(jié)果一致。

Figure 6.Effect of LPS on the phosphorylation of MLC in bEnd.3，bEnd.3/vector and bEnd.3/muIκBα cells.The phosphorylation level of MLC was investigated by Western blotting.As shown above，LPS mediated an increase in MLC phosphorylation，which was reverted in bEnd.3/muIκBα cells.±s.n=4.*P＜0.05 vs bEnd.3 cells exposed to LPS for the same time periods;#P ＜0.05 vs bEnd.3/vector cells exposed to LPS for the same time periods;△ P ＜0.05 vs the same group cells exposed to LPS for 0 h.圖6 LPS 對 bEnd.3、bEnd.3/vector和 bEnd.3/muIκBα組細(xì)胞 MLC 磷酸化水平的影響

然而LPS增加腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)控機制尚未完全闡明。目前研究表明，NF－κB是維持內(nèi)皮細(xì)胞低通透性的重要因素［10］。通常情況下，NF－κB與IκB結(jié)合以靜止形式存在于細(xì)胞漿內(nèi)。而LPS使IκB磷酸化后與NF－κB分離，分離后NF－κB移位到細(xì)胞核內(nèi)，啟動一系列炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生細(xì)胞因子等炎癥介質(zhì)。我們以往的研究也發(fā)現(xiàn)向大鼠頸內(nèi)動脈注射LPS后NF－κB被活化，腦組織內(nèi)細(xì)胞因子和氧自由基大量增加，與感染性腦水腫腦損傷形態(tài)學(xué)改變呈正相關(guān)關(guān)系［11］。最近的研究也表明，NF－κB活化可介導(dǎo)TJ蛋白ZO－1的表達(dá)與分布異常［12］，并且NF－κB活性狀態(tài)對細(xì)胞骨架裝配的動力學(xué)也有重大影響［13］。那么在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，NF－κB是否通過調(diào)控腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞TJ蛋白的狀態(tài)，參與了LPS引起的BBB通透性增高的過程?目前未見研究報道。本研究結(jié)果證實LPS引起bEnd.3細(xì)胞緊密連接變化前有NF－κB的活化，而抑制bEnd.3細(xì)胞 NF－κB活化可明顯改善LPS對TJ、細(xì)胞骨架蛋白和細(xì)胞屏障功能的破壞作用，說明NF－κB參與調(diào)控LPS所致腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高的過程。

那么上述過程中NF－κB的信號又是通過什么下游調(diào)控事件引起TJ破壞的呢?大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為MLC磷酸化可活化肌球蛋白重鏈頭部的ATP，所產(chǎn)生的能量使細(xì)胞骨架actin微絲滑動，細(xì)胞發(fā)生收縮，通透性改變。同時有研究表明MLC磷酸化在腸上皮屏障功能紊亂及細(xì)胞TJ相關(guān)蛋白的調(diào)控中起著重要作用［14］。因而我們假設(shè)MLC磷酸化是LPS介導(dǎo)的NF－κB活化的下游調(diào)控事件。為此，我們比較了LPS作用下，抑制NF－κB活性的bEnd.3細(xì)胞與普通bEnd.3細(xì)胞的MLC磷酸化水平的改變，發(fā)現(xiàn)LPS引起bEnd.3細(xì)胞的MLC磷酸化增加與F－actin重組，ZO－1下調(diào)的時點一致，提示LPS介導(dǎo)的MLC磷酸化與TJ損害密切相關(guān)。而抑制NF－κB活性可使LPS介導(dǎo)的MLC磷酸化增加作用出現(xiàn)的晚且程度輕，提示MLC磷酸化受NF－κB的調(diào)控。

綜上所述，本實驗證實LPS引起腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞株通透性上升，其機制為細(xì)胞骨架F－actin重組和緊密連接蛋白claudin－5和ZO－1表達(dá)下調(diào);并首次提出NF－κB活化是上述過程的重要調(diào)控信號，其可能通過介導(dǎo)MLC磷酸化增高參與TJ調(diào)控。這些提示我們調(diào)控NF－κB活化狀態(tài)對阻斷炎癥因子引起的血管源性腦水腫有重要的作用。

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