隋志甫 ，劉靜杰 ，谷廷敏 ，李 蠡 ，趙志力 ，閻曉輝

1.解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院美容整形中心，北京 100125；2.海軍總醫(yī)院整形外科，北京 100048

隨著細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)的深入發(fā)展，人們對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)的認(rèn)識(shí)不斷豐富和深化。OPN是一種磷酸化糖蛋白，作為一種炎癥因子，參與了多種組織的病理性纖維化過(guò)程，最近的研究發(fā)現(xiàn)抑制ICR小鼠OPN的表達(dá)可加速其皮膚創(chuàng)口愈合，并減少肉芽組織及瘢痕的形成[1-2]。EGFr作為表皮生長(zhǎng)因子的受體具有促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖和爬行、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和增加膠元合成等獨(dú)特的生物學(xué)作用[3]。既往動(dòng)物試驗(yàn)提示OPN和EGFr與創(chuàng)面愈合過(guò)程明顯相關(guān)，為了解其相關(guān)性的普遍意義，筆者采用免疫組化與原位雜交學(xué)方法觀察燒傷患者創(chuàng)面中OPN和EGFr的表達(dá)變化，分析并探討OPN和EGFr在臨床創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中的作用。

1 資科與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源及制備

自2008年6月～2010年6月選取大面積燒傷患者，平均燒傷面積為（32.5±4.2）%TBSA，創(chuàng)面中的淺Ⅱ度創(chuàng)面，共15例，男10例，女5例；年齡19～43歲，創(chuàng)面位于下腹部和大腿，經(jīng)組織學(xué)證實(shí)均為淺Ⅱ度創(chuàng)面，患者無(wú)特殊疾患。每一病例經(jīng)知情同意后， 分別于傷后 1、3、5、7、9、11 d 時(shí)于局麻下用眼科角膜環(huán)鉆切取包括創(chuàng)面、創(chuàng)基及少量皮下脂肪在內(nèi)的標(biāo)本，選取植皮手術(shù)時(shí)取皮區(qū)的正常皮膚作為對(duì)照，分別置于10%中性福爾馬林和4%多聚甲醛中固定，乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成5 μm的組織切片備用。

1.2 OPN和EGFr檢測(cè)

①OPN檢測(cè)：切片二甲苯脫蠟2次，每次10 min；梯度乙醇水化，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min；3%過(guò)氧化氫室溫孵育30 min，0.01 mol/L PBS浸洗；0.1%胃蛋白酶37℃孵育10 min，0.01 mol/L PBS浸洗3次，每次5 min；滴加5%BSA，37℃封閉30 min，吸去多余液體。鼠抗人OPN單克隆抗體（1∶100）（美國(guó)SANTA CRUZ公司）37℃孵育1 d，經(jīng)0.01 mol/L PBS浸洗后滴加生物素化羊抗鼠IgG（美國(guó)SANTA CRUZ公司），37℃孵育30 min后，0.01 mol/L PBS清洗，滴加SABC，37℃下孵育30 min，再次經(jīng)0.01 mol/L PBS清洗，以二氨基聯(lián)苯氨（DAB）顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蘇木精輕度復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片，同時(shí)設(shè)無(wú)一抗的空白對(duì)照。顯微鏡下觀察，陽(yáng)性顆粒為棕色。②EGFr檢測(cè)：用地高辛標(biāo)記EGFr的cDNA探針后進(jìn)行組織切片的原位雜交，組織切片脫蠟入水，0.2 mol/L鹽酸酸化，蛋白酶K消化，酒精脫水，置預(yù)雜交液（42℃）預(yù)雜交4 h，入雜交液雜交（42℃）17 h后用Boegringer Mannheim公司產(chǎn)品Dig-DNA labelling and detection試劑盒觀察切片中EGFr活化表達(dá)的mRNA的變化情況。顯微鏡下觀察，陽(yáng)性顆粒為棕黃色。400倍光鏡下測(cè)定其相對(duì)含量，每組選擇5張切片，每張切片連續(xù)記數(shù)5個(gè)視野，求出每個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性顆粒平均數(shù)。 陰性（-）：視野內(nèi)無(wú)陽(yáng)性信號(hào)；弱陽(yáng)性（+）：視野內(nèi)可見(jiàn)10個(gè)以下陽(yáng)性信號(hào)；中等陽(yáng)性（++）：視野內(nèi)可見(jiàn)11～30個(gè)陽(yáng)性信號(hào)；強(qiáng)陽(yáng)性（+++）：視野內(nèi)可見(jiàn)大于30個(gè)陽(yáng)性信號(hào)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理組間變化，進(jìn)行方差分析，組間行Student's t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燒傷能誘導(dǎo)創(chuàng)面組織OPN和EGFr的表達(dá)，但二者表達(dá)不盡相同。在正常皮膚中，OPN陽(yáng)性顆粒細(xì)胞分布于毛囊、汗腺及皮脂腺，在表皮及真皮部分均無(wú)分布，表達(dá)強(qiáng)度（-）。燒傷后第1天起OPN陽(yáng)性顆粒廣泛分布于真皮層成纖維細(xì)胞的胞漿中及毛囊、汗腺及皮脂腺周圍，但呈松散稀疏分布；在第3天時(shí)這種分布最為密集，OPN表達(dá)強(qiáng)度最高（+++），隨后的5～7 d其表達(dá)強(qiáng)度逐步減弱。正常皮膚內(nèi)EGFr僅有弱陽(yáng)性表達(dá)（+），燒傷后第1天起EGFr的表達(dá)逐漸增加，在傷后7 d時(shí)達(dá)峰值，呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（+++），此后逐漸下降，其陽(yáng)性顆粒主要分布于表皮基底細(xì)胞胞漿、真皮成纖維細(xì)胞的胞核內(nèi)及毛囊、汗腺及皮脂腺周圍。傷前OPN和EGFr陽(yáng)性顆粒表達(dá)數(shù)量與傷后表達(dá)高峰期自身對(duì)比差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中骨橋蛋白和表皮生長(zhǎng)因子受體表達(dá)強(qiáng)度

3 討論

皮膚創(chuàng)傷愈合的基本過(guò)程可以分為三個(gè)連續(xù)或者重疊的時(shí)期：炎癥期、細(xì)胞外基質(zhì)沉積期及組織改建期。這一過(guò)程有多種細(xì)胞因子、各類型的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)共同參與[4-5]。這些細(xì)胞因子如果調(diào)控失常會(huì)干擾正常的組織修復(fù)過(guò)程而出現(xiàn)愈合過(guò)慢形成潰瘍或者愈合過(guò)度形成瘢痕[6]。骨橋蛋白是一種磷酸化糖蛋白，在1985年，F(xiàn)ranzen等[7]在大鼠礦化的骨基質(zhì)中分離出一種含“精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸”序列（RGDsequence）的磷酸化糖蛋白，命名為骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）。隨后的研究發(fā)現(xiàn)OPN廣泛存在于多種組織中，包括腎、膽囊、肺部、乳房、腸胃以及尿道[8-9]。此外，OPN作為一種炎癥因子，參與各種組織的病理性纖維化過(guò)程，在多種腫瘤組織內(nèi)也發(fā)現(xiàn)OPN的表達(dá)[10-11]。在皮膚創(chuàng)口愈合方面，最近的研究發(fā)現(xiàn)抑制ICR小鼠OPN的表達(dá)可加速其皮膚創(chuàng)口愈合，并減少肉芽組織及瘢痕的形成，但其內(nèi)在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)顯示，在正常皮膚的表皮及真皮部分均未檢測(cè)到OPN陽(yáng)性顆粒，在毛囊、汗腺及皮脂腺周圍可見(jiàn)散在分布。燒傷后第1天起OPN陽(yáng)性顆粒廣泛分布于真皮層成纖維細(xì)胞的胞漿及毛囊、汗腺、皮脂腺周圍，但呈松散稀疏分布；在第3天時(shí)這種分布最為密集，OPN表達(dá)強(qiáng)度最高，隨后的5～7 d其表達(dá)強(qiáng)度逐步減弱?？梢钥闯鯫PN表達(dá)的高峰期與細(xì)胞外基質(zhì)沉積的高峰期一致，推測(cè)OPN可能參與了創(chuàng)面修復(fù)初期的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而影響創(chuàng)面愈合。表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、EGFr蛋白在調(diào)控組織細(xì)胞的增殖方面有很重要的作用，各種刺激引起EGF、EGFr蛋白表達(dá)后，組織中相應(yīng)的細(xì)胞因子增多，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖和創(chuàng)傷的愈合[12]。EGFr是多細(xì)胞生物中介導(dǎo)EGF發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵成分，EGF只有與其靶細(xì)胞膜表面的EGFr結(jié)合才能發(fā)揮其生物學(xué)作用。本研究結(jié)果表明：正常皮膚內(nèi)EGFr僅有弱陽(yáng)性表達(dá)，燒傷后第1天起EGFr的表達(dá)逐漸增加，陽(yáng)性顆粒多數(shù)分布在創(chuàng)緣上皮、創(chuàng)面表面的細(xì)胞、真皮淺層成纖維細(xì)胞、皮脂腺、汗腺、毛囊周圍，傷后7～9 d EGFr表達(dá)量最多，表達(dá)最強(qiáng)，傷后3～5 d次之，傷后11 d進(jìn)一步減少。這可能是傷后早期創(chuàng)面組織細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷刺激尚無(wú)明顯反應(yīng)，EGFr合成較少；傷后7～9 d時(shí)組織細(xì)胞對(duì)創(chuàng)傷刺激反應(yīng)明顯增強(qiáng)，EGFr合成增多；傷后11 d以后，創(chuàng)面縮小，組織細(xì)胞自我調(diào)節(jié)，降低了反應(yīng)性，因此EGFr蛋白合成下降，這與機(jī)體為避免組織過(guò)度增生所產(chǎn)生的“接觸性抑制”相一致[13]。

創(chuàng)面修復(fù)是一個(gè)多種因素參與的復(fù)雜生物過(guò)程，本研究顯示：在整個(gè)臨床創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，特別是創(chuàng)面修復(fù)的初、中期，OPN和EGFr均有明顯的表達(dá)，且分布范圍多數(shù)在創(chuàng)面修復(fù)細(xì)胞增殖的活躍部位（表皮或真皮層成纖維細(xì)胞的胞漿或胞核、毛囊、汗腺、皮脂腺等），這與以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相似，這種表達(dá)的時(shí)相性和區(qū)域性分布特點(diǎn)表明OPN和EGFr參與了臨床創(chuàng)面修復(fù)的各時(shí)期（特別是初、中期）的細(xì)胞代謝和增殖。提示我們?nèi)绻谂R床創(chuàng)面修復(fù)的不同時(shí)期采取措施，合理調(diào)控OPN和EGFr的表達(dá)，將有助于加快創(chuàng)面愈合，減少瘢痕形成。

[1]Wang Z,Li L.Adenovirus-mediated RNA interference a-gainst collagenspecific molecular chaperone 47-KDa heatshock protein suppresses scar formation on mouse wounds[J].Cell Biol Int,2008,32(5)：484-493.

[2]Mori R,Shaw TJ,Martin P.Molecular mechanisms linking wound inflammation and fibrosis：knockdownof osteopontin leads to rapid repair and reduced scarring[J].J Exp Med,2008,205(1)：43-51.

[3]Chang PL,Harkins L,Hsieh YH,et al.Osteopontin expression in normal skin and non-melanoma skin tumors[J].J Histochem Cytochem,2008,56(1)：57-66.

[4]Baum CL,Arpey CJ.Normal cutaneous wound healing：clinical correlation with cellular and molecular events[J].Dermaltol Surg,2005,31(6)：674-686.

[5]隋志甫,魏壯,李文,等.C-fos和c-myc原癌基因在燒傷創(chuàng)面修復(fù)中的表達(dá)變化[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2009,29(13)：1628-1629.

[6]Jie Li,Juan Chen,Robert.Pathophysiology of acute wound healing[J].Clinics in Dermatology,2007,25(1)：9-11.

[7]Franzen A,Heinegard D.Isolation and characterization of two sialoproteins present only in bone calcif-yed matrix[J].Biochem J,1985,232(3)：715-724.

[8]Fisher LW,Torchia DA,Fohr B,et al.Flexible structures of SIBLING proteins,bone sialoprotein,and osteop-ontin[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,280(2)：460-465.

[9]Brown LF,Berse B,Vande WL,et al.Expression and distribution of osteopontin in human tissues：widespread association with luminal epithelial surfaces[J].Mol Biol Cell,1992,3(10)：1169-1180.

[10]Rodrigues LR,Teixeira JA,Schmitt FL,et al.The role of osteopontin in tumor progression and metastasis in breast cancer[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2007,16(6)：1087-1097.

[11]Thalmann GN,Sikes RA,Devoll RE,et al.Osteopontin：possible role in prostate cancer progression[J].Clin Cancer Res,1999,5(8)：2271-2277.

[12]谷廷敏,谷陽(yáng),隋志甫,等.燒傷創(chuàng)面內(nèi)表皮生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子受體、Cmyc三種基因表達(dá)變化的臨床觀察[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(9)：1431-1433.

[13]隋志甫,谷廷敏,趙志力,等.兩種組織生長(zhǎng)相關(guān)因子在臨床創(chuàng)面愈合中的表達(dá)變化[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2010,14(5)：697-699.