楊俊霞，楊惠超，王東江，潘志強(qiáng)

1.徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室&江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221000；2.北京金康馳醫(yī)藥投資有限公司，北京 100142；3.河北省臨漳縣人民醫(yī)院胸外科，河北臨漳 056600

親環(huán)蛋白A(CypA)是親環(huán)蛋白家族主要成員，于1984年在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中首次被發(fā)現(xiàn)，是免疫抑制劑環(huán)孢酶素A(CyclosporinA,CsA)在細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)[1]，具有肽基脯氨酸順/反異構(gòu)酶活性。研究顯示，CypA在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[2-6]，提示其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。最近研究證實(shí)氧化應(yīng)激和缺血時(shí)，CypA對(duì)神經(jīng)元有保護(hù)作用[7-8]。

以往的研究表明，銀杏內(nèi)酯(ginkgolides,Gin)對(duì)氧糖剝奪和過(guò)氧化氫損傷的神經(jīng)元有良好的保護(hù)作用[9-12]，但其保護(hù)機(jī)制是否與CypA的表達(dá)有關(guān)尚未見報(bào)道。為此，本研究以過(guò)氧化氫損傷的皮層神經(jīng)元為模型觀察Gin對(duì)CypA表達(dá)的影響，為進(jìn)一步證實(shí)在過(guò)氧化氫損傷時(shí)Gin與CypA表達(dá)的關(guān)系，本研究還采用了過(guò)氧化氫損傷的SH-SY5Y細(xì)胞模型，進(jìn)一步證實(shí)了過(guò)氧化氫損傷時(shí)，Gin對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用與CypA表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

Gin（長(zhǎng)沙上禾生物科技有限公司）、DMED培養(yǎng)基、Neurobasal Medium、B27(Gibco,USA)、胎牛血清(杭州四季青生物公司)、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物L(fēng)-多聚賴氨酸、MTT、胰酶(Sigma,USA)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、SDS、Tris(上海朝瑞生物技術(shù)公司進(jìn)口分裝)、PVDF 膜(Bio-Rad Laboratories,USA)、抗 β-actin單克隆抗體(Sigma公司)、抗CyPA多克隆抗體 (Biomol,USA)、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔 IgG（Cell Signaling Technology,USA）免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑 ECL（PIERCE），Kodak 膠片(USA)，其余為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 過(guò)氧化氫損傷的皮層神經(jīng)元模型的建立

取胎齡為13～15 d的ICR小鼠，無(wú)菌條件下分離出大腦皮層，在D-Hank′s平衡鹽溶液中漂洗3次，盡量剔除腦膜，剪碎后用終濃度為0.25%胰酶，37℃消化10 min，離心，棄去上清，用含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基制備成1.5×109cell/L密度的細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。第二天換成含2%B27的Neurobasal繼續(xù)培養(yǎng)，隔天換液。培養(yǎng)至第7天，換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，加入新鮮配制的 H2O2，H2O2終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各濃度 H2O2分別與細(xì)胞共同孵育2 h后測(cè)細(xì)胞活力。

1.3 過(guò)氧化氫損傷的SH-SY5Y細(xì)胞模型的建立

取指數(shù)增長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，將完全培養(yǎng)基換成無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基，加入新鮮配制的H2O2，H2O2終濃度為0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L， 各濃度 H2O2分別與細(xì)胞共同孵育2 h后測(cè)細(xì)胞活力。

1.4 分組和藥物處理

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(Control)、H2O2損傷組（Model）和 H2O2損傷加Gin組(Gin)。Gin用1%的二甲基亞砜溶液配制(濃度為 42.4 mg/L[9-12])，加 H2O2前 12 h加入培養(yǎng)基,使終濃度為42.4 mg/L；對(duì)照組、H2O2組同時(shí)加入相應(yīng)量的二甲基亞砜溶液。H2O2處理前去除各組原細(xì)胞培養(yǎng)液，換成2 ml DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液，處理后即檢測(cè)細(xì)胞活力。用于Western Blot分析的細(xì)胞處理后換成完全培養(yǎng)基12 h后提取蛋白。

1.5 細(xì)胞存活率測(cè)定(MTT法)

MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力的原理是利用活細(xì)胞線粒體脫氫酶將MTT鹽還原成藍(lán)紫色的甲瓚顆粒，以顆粒溶解后呈現(xiàn)的顏色深淺反映細(xì)胞活性。各組細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，經(jīng)H2O2處理后，用D-Hank's液洗2遍，每孔加入1 g/L的MTT溶液100 μl，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中4 h，然后再加入100 μl，20%SDS，37℃孵育 20～24 h，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于 570 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度值(A)，A值越大說(shuō)明細(xì)胞活力越好。每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩次以上。

1.6 Western Blot檢測(cè)CypA的表達(dá)

將培養(yǎng)于96孔板的各組細(xì)胞 (處理神經(jīng)元與SH-SY5Y細(xì)胞的H2O2終濃度分別為0.1、0.2 mmo/L)用冰冷的PBS洗滌兩遍，每空加入0.6 ml蛋白裂解液，刮取細(xì)胞，搜集到1.5 ml EP管，冰上放置30min，超聲粉碎細(xì)胞，13000r/min離心10min，取少量上清液用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)蛋白濃度，30 μg總蛋白量分裝成一管，-20℃保存。

制膠：配制12%分離膠溶液7.5 ml(去離子水2.625 ml，Tris·HCl pH8.8 1.875 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 3 ml，10%AP 45 μl，TEMED 15 μl)，現(xiàn)將上三樣混勻后，取出 0.250 ml加入 5 μl 10%AP和5 μl TEMED迅速混勻，打入板中，封底，約10 min后，加入混勻的其他成分，輕輕地在頂層加入幾毫升去離子水至玻片齊平。聚合完成(約30 min)之后，倒掉覆蓋液體，用吸水紙吸干凝膠上部的殘存液體。配制5%濃縮膠2 ml(去離子水 1.2 ml,Tris·HCl pH6.8 0.48 ml，29.2%Acr-0.8%Bis 0.25 ml，10%AP 19.2 μl，TEMED 3.8 μl)，插入梳子，小心避免混入氣泡，室溫下約15 min后聚合。

電泳：將樣品蛋白與適量上樣緩沖液混勻，100℃水浴加熱5 min。將制備好的凝膠放在電泳槽上。上下槽均加入1×電泳緩沖液，檢查是否滲漏。繼續(xù)向上槽內(nèi)添加電泳緩沖液直至充滿上樣孔；拔去梳子。在加樣指導(dǎo)器的幫助下按次序上樣，并加上預(yù)染的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量蛋白質(zhì)分子。濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為100 V，至溴酚蘭抵達(dá)分離膠底部后，斷開電源。切下與CypA蛋白分子量（18 kD)對(duì)應(yīng)的分離膠，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中待轉(zhuǎn)膜用。

轉(zhuǎn)膜：將電泳后的凝膠、甲醇浸濕過(guò)的PVDF膜(大小與分離膠相似或略大)、多孔濾墊、厚濾紙用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡15min。采用BIO-RAD電泳儀，用二張厚濾紙貼于兩張多孔濾墊，將PVDF膜、凝膠夾于中間。PVDF膜朝正極，0℃、350 mA恒流轉(zhuǎn)移2 h。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將PVDF膜取出剪去一角以標(biāo)記膜的方向，用1×TBS溶液漂洗3遍，每遍10 min。

抗原抗體反應(yīng)：PVDF膜轉(zhuǎn)入一盛有5%脫脂奶粉的平皿中，室溫下?lián)u床包被2 h。封閉結(jié)束后，將膜浸入加有一抗(抗 CypA 抗體 1：25 000 稀釋，抗 β-actin 抗體 1：10 000 稀釋)的新鮮配制的封閉液，4℃過(guò)夜。次日，用TBS溶液將膜漂洗3遍，每遍5 min。向膜的正面滴加含有二抗的封閉液，室溫?fù)u床反應(yīng)2 h。取出濾膜，TBS溶液漂洗3遍，每遍5 min，用濾紙吸干膜上液體。等量吸出ECL試劑A和B(每2 cm2膜需ECL總量0.1 ml)，混勻后滴加在膜正面5 min后，將膜上的多余液體吸干，封入保鮮膜，放入壓片盒中。

顯影：在暗室中將膠片放在PVDF膜的正面，蓋上暗盒。曝光2 min后，取出膠片放入顯影液中，待條帶出現(xiàn)后取出用自來(lái)水沖洗，放入定影液中。取出膠片，晾干，待拍照用。

1.7 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

采用Sigma Stat統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，n代表樣本數(shù)。采用One Way ANOVA法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 H2O2對(duì)培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

分別用終濃度為 0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L 的 H2O2與細(xì)胞共同孵育2 h后檢測(cè)細(xì)胞活力（見圖1）。結(jié)果顯示：隨著濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降。

神經(jīng)元對(duì)照組與0.05 mmol/L組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與0.1 mmol/L 比較，P＜0.05， 與 0.2、0.4 mmol/L 比較，P＜0.01。SH-SY5Y細(xì)胞對(duì)照組與0.05 mmol/L比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與0.1、0.2、0.4 mmol/L 比較，P＜0.01。

2.2 42.4 mg/L的Gin對(duì)H2O2損傷細(xì)胞活力的影響

根據(jù)圖1提示：因0.1 mmol/L的H2O2作用神經(jīng)元2 h與對(duì)照組比較，P＜0.05，既能制造神經(jīng)元損傷模型，對(duì)細(xì)胞損傷也不太嚴(yán)重，所以采用0.1 mmol/L的H2O2作用神經(jīng)元2 h來(lái)檢驗(yàn)Gin對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。0.1 mmol/L的H2O2作用神經(jīng)元2 h與0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y細(xì)胞2 h的細(xì)胞活力比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以采用0.2 mmol/L的H2O2作用SH-SY5Y細(xì)胞2h來(lái)檢驗(yàn)Gin對(duì)損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。加入H2O2前，42.4 mg/L的Gin與細(xì)胞共孵育12 h。圖2結(jié)果顯示：Gin能明顯抑制H2O2造成的細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力。

2.3 42.4 mg/L Gin對(duì)H2O2損傷細(xì)胞CypA表達(dá)的影響

采用圖2的分組方法，H2O2作用后換上加有血清的DMEM培養(yǎng)12 h后提取細(xì)胞蛋白，Werstern Blot檢測(cè)CypA表達(dá)的變化（圖3A）。結(jié)果顯示，42.4 mg/L Gin預(yù)處理12 h，可提高H2O2所致的神經(jīng)元和SH-SY5Y損傷細(xì)胞的CypA表達(dá)。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度掃描(圖 3B)。

3 討論

銀杏中具有生理活性的主要化學(xué)成分為黃酮苷、萜內(nèi)酯和聚戊烯醇等化合物。其中萜內(nèi)酯類化合物有：銀杏內(nèi)酯A、B、C、M、J及白果內(nèi)酯。已證明銀杏內(nèi)酯均為強(qiáng)的血小板活化因子（PAF）拮抗劑,EGb對(duì)PAF的拮抗作用可能與其降低腦損傷大鼠甘氨酸水平、減少PAF誘導(dǎo)的胞內(nèi)鈣離子水平增加、減弱蛋白激酶C(PKC)激活和降低興奮性氨基酸受體功能等有關(guān)。銀杏內(nèi)酯B可通過(guò)調(diào)節(jié)超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)等抗氧化酶活性發(fā)揮抗氧化作用。銀杏內(nèi)酯B還能抑制谷氨酸對(duì)培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的損傷,其機(jī)制可能是通過(guò)降低缺血時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣水平對(duì)抗谷氨酸的神經(jīng)毒性[14-15]。H2O2是一種重要的活性氧成分,參與衰老、腦缺血缺氧等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過(guò)程。它能使膜脂質(zhì)過(guò)氧化,膜脂質(zhì)過(guò)氧化引起細(xì)胞外鈣內(nèi)流激活磷脂酶和蛋白激酶[15]本實(shí)驗(yàn)證實(shí)銀杏內(nèi)酯能夠提高雙氧水造成的細(xì)胞活力降低。

多數(shù)研究表明，缺血預(yù)處理和低氧預(yù)適應(yīng)能有效減輕神經(jīng)元隨后的嚴(yán)重缺血缺氧損傷。這些保護(hù)作用與其調(diào)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)新的蛋白質(zhì)合成有關(guān)[7,13]，CypA在腦組織廣泛表達(dá)，能夠上調(diào)過(guò)氧化物還原酶活性，抑制凋亡造成的營(yíng)養(yǎng)因子缺乏。神經(jīng)元經(jīng)EPO預(yù)處理時(shí)，CypA表達(dá)上調(diào)。CypA還能與鈣網(wǎng)蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度。且能上調(diào)SOD和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性，從而發(fā)揮抗氧化功能，降低氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷[17-23]。銀杏內(nèi)酯對(duì)缺血缺氧以及氧化應(yīng)激造成的神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用[9-12]。

本研究證實(shí)銀杏內(nèi)酯能夠提高H2O2所致神經(jīng)元及SHSY5Y損傷細(xì)胞的活力，這種保護(hù)作用與其上調(diào)CypA的表達(dá)有關(guān)。

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