徐 熠，徐玲玲，年 華(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，上海 200437)

痛風(fēng)是由嘌呤代謝紊亂，尿酸產(chǎn)生過多或尿酸排泄減少所引起的一組代謝障礙性疾?。?］。近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢［2］。對于該疾病的研究也逐漸受到廣泛關(guān)注，其中中醫(yī)藥和中西醫(yī)結(jié)合的方式治療痛風(fēng)有著療效好、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)。目前，對于痛風(fēng)發(fā)病的作用機(jī)制、代謝方式等研究也已取得了顯著成果［3，4］，這為中醫(yī)藥治療痛風(fēng)疾病的基礎(chǔ)研究提供了理論依據(jù)。痛風(fēng)顆粒(滬藥制字Z05050342)是源自上海市名老中醫(yī)夏涵教授的經(jīng)典方，已有數(shù)十年臨床使用經(jīng)驗(yàn)，在減輕痛風(fēng)癥狀上取得了良好治療效果。該方具有清熱利濕、通絡(luò)的功效。其主要成分為綠原酸及阿魏酸等［5］，具有抗炎、鎮(zhèn)痛及降尿酸等作用。故本實(shí)驗(yàn)對其中的抗炎及降尿酸作用進(jìn)行藥效學(xué)研究，為進(jìn)一步了解其作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

健康SD大鼠48只，雄性，清潔級，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥物

痛風(fēng)顆粒，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科提供，批號20090722;苯溴馬隆(立加利仙)，由德國赫曼大藥廠生產(chǎn)，批號0807845。臨用前以蒸餾水配成所需濃度。

1.3 試劑

尿酸(uric acid)，由美國 Sigma公司生產(chǎn)，批號 Lot.No.WA200907212;NaOH，由上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號081020。

1.4 儀器

日立7170全自動(dòng)生化分析儀，由日立公司生產(chǎn);KX-21血球計(jì)數(shù)儀，由sysmex公司生產(chǎn);自制足跖體積測量儀。

2 方法

2.1 尿酸鈉晶體的制備［6，7］

取3 g尿酸加入600 mL沸水中，用1 mol·L-1的 NaOH溶液調(diào)pH至7，加熱至95℃，室溫?cái)嚢柚晾鋮s，4℃冰箱放置24 h，過濾，用0.9%氯化鈉注射液洗滌3次，用濾紙將沉淀吸干，70℃烘干，取出，刮下粉末，研細(xì)，高溫滅菌。使用前用0.9%氯化鈉注射液配成100 mg·mL-1的懸浮液。

2.2 分組及給藥

取體重在(180±20)g左右雄性SD大鼠48只，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為6組，每組8只，即空白組、模型組、痛風(fēng)顆粒低劑量組、痛風(fēng)顆粒中劑量組、痛風(fēng)顆粒高劑量組和陽性藥組(苯溴馬隆)?？瞻捉M和模型組分別灌服蒸餾水;痛風(fēng)顆粒低劑量組，痛風(fēng)顆粒中劑量組和痛風(fēng)顆粒高劑量組依次灌服3.8、7.7 、15.4 g·kg-1劑量的痛風(fēng)顆粒;陽性藥組灌服 5.25 mg·kg-1的苯溴馬隆，1日1次。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 尿酸鈉致大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹實(shí)驗(yàn)［8］:上述大鼠正常飼養(yǎng)2 d后，連續(xù)灌胃9 d。末次給藥1 h后，除空白組外在各組大鼠右后足踝關(guān)節(jié)上同一位置劃一標(biāo)記線，測量標(biāo)記線以下正常足容積，后由踝關(guān)節(jié)背側(cè)向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射尿酸鈉混懸液0.2 mL/只，在注射后 1、2、3.5、5 h時(shí)分別再次測量足容積，計(jì)算腫脹率。

2.3.2 尿酸鈉致大鼠足跖腫脹實(shí)驗(yàn)［9］:各組大鼠灌胃至第15 d，末次給藥1 h后，在除空白組外各組大鼠左后足踝關(guān)節(jié)上同一位置劃一標(biāo)記線，測量標(biāo)記線以下正常足容積，后向左后肢足底皮下注射尿酸鈉混懸液0.2 mL/只，在注射后1.5、3、4.5、6 h時(shí)分別再次測量足跖體積，計(jì)算腫脹率。

2.3.3 大鼠患肢壓力積分及步態(tài)積分實(shí)驗(yàn):在2.3.2實(shí)驗(yàn)4 h時(shí)觀測大鼠站立及行走患肢壓力積分、步態(tài)積分［6］。大鼠患肢壓力積分評分標(biāo)準(zhǔn):0分:后肢正常壓力，2后肢一樣重量或平等負(fù)重;1分:模型側(cè)后肢負(fù)重輕度減少，完全在地上;2分:后肢壓力中度減少，腿屈曲僅有部分肢體負(fù)重，接觸板;3分:后肢負(fù)重嚴(yán)重減少，少接觸地。大鼠患足步態(tài)積分評分標(biāo)準(zhǔn):0分:正常步態(tài);1分:輕度跛行，注射尿酸鈉的患肢屈曲;2分:中度跛行，注射尿酸鈉的下肢接觸地;3分:嚴(yán)重跛行，甚至出現(xiàn)3肢拖行步態(tài)。

2.3.4 尿酸致大鼠高尿酸癥實(shí)驗(yàn):第16 d灌胃0.5 h后向除空白組外的各組大鼠左后足跖皮下注射尿酸鈉混懸液0.2 mL/只;空白組腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，其余5組均腹腔注射100 mg·kg-1尿酸。1.5 h后處死，腹主動(dòng)脈取血2 mL，測定血液內(nèi)白細(xì)胞數(shù)量，將全血以3 500 r·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，取血清測定血尿酸值。摘取大鼠兩側(cè)腎臟，稱重，計(jì)算腎臟重量系數(shù)(腎臟重量系數(shù)(mg·g-1)=(左側(cè)腎臟重量 +右側(cè)腎臟重量)/(2×體重))。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS for Windows 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，踝關(guān)節(jié)腫脹和足跖腫脹實(shí)驗(yàn)采用repeated measures和multivariate過程進(jìn)行分析;血尿酸、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和腎臟重量系數(shù)采用One-Way ANOVA方差分析;壓力積分及步態(tài)積分采用 nonparametric test中Kruskal-Wallis H法分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對尿酸鈉致大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響

結(jié)果表明當(dāng)模型組腫脹率達(dá)最高值時(shí)，高中低3組中藥組均能不同程度抑制尿酸鈉致大鼠的踝關(guān)節(jié)腫脹，與模型組相比，有顯著性差異(F=6.403，P＜0.01)，見表1。

表1 痛風(fēng)顆粒對尿酸鈉致大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響(n=8，±s)Tab 1Effect of gout granula on sodium urate－induced swelling of ankle joints in rats(n=8，±s)

表1 痛風(fēng)顆粒對尿酸鈉致大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的影響(n=8，±s)Tab 1Effect of gout granula on sodium urate－induced swelling of ankle joints in rats(n=8，±s)

注:與模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01note:vs.model group:*P ＜0.05，**P ＜0.01

1 h 2 h 3.5 h 5 h模型組 8 82.23±20.54 106.39±25.59 27.48±16.50 7.80組別動(dòng)物數(shù)/只劑量/g·kg-1腫脹率/(±s，%)±11.38痛風(fēng)顆粒 8 3.8 72.65±17.49 73.34±23.66** 5.56±6.47** 1.39±3.93痛風(fēng)顆粒 8 7.7 66.87±12.47* 58.42±15.28** 12.39±4.9** 3.18±4.24痛風(fēng)顆粒 8 15.4 69.10±15.63* 51.14±18.68** 13.93±13.20* 6.91±6.91苯溴馬隆 8 5.25 mg·kg-1 68.49±17.95* 48.55±21.07** 11.00±5.88**2.77±4.19

3.2 對尿酸鈉致大鼠足跖腫脹的影響

造模后3～6 h間高中低3組中藥劑量均能抑制尿酸鈉致大鼠的足跖腫脹，與模型組相比，有顯著性差異(F=17.972，P ＜0.01)，見表2。

表2 痛風(fēng)顆粒對尿酸鈉致大鼠足跖腫脹的影響(n=8，±s)Tab 2 Effect of gout granula on sodium urate － induced voix pedis swelling of rats(n=8，ˉx ± s)

表2 痛風(fēng)顆粒對尿酸鈉致大鼠足跖腫脹的影響(n=8，±s)Tab 2 Effect of gout granula on sodium urate － induced voix pedis swelling of rats(n=8，ˉx ± s)

注:與模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01note:vs.model group:*P ＜0.05，**P ＜0.01

1.5 h 3 h 4.5 h 6 h模型組 8 77.93±23.91 143.16±21.06 46.00±11.49 24.5組別動(dòng)物數(shù)/只劑量/g·kg-1腫脹率/(±s，%)5±10.58痛風(fēng)顆粒 8 3.8 73.72±12.95 54.08±7.76** 26.30±9.85** 11.34±8.30**痛風(fēng)顆粒 8 7.7 82.64±12.95 55.59±15.61** 28.79±9.68** 13.20±5.87*痛風(fēng)顆粒 8 15.4 61.77±15.65 29.68±7.15** 11.16±6.99** 3.66±3.22**苯溴馬隆 8 5.25 mg·kg-1 67.52±17.17 64.50±20.66** 9.88±7.42** 7.70±7.70**

3.3 對大鼠站立行走的影響

痛風(fēng)顆粒3組和陽性藥組的患肢壓力和步態(tài)積分高于空白組，中藥高劑量組和西藥組與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05)，說明痛風(fēng)顆粒能緩解足跖關(guān)節(jié)腫脹，見表3。

3.4 對尿酸鈉致炎大鼠血液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響

高劑量痛風(fēng)顆粒組能減少白細(xì)胞數(shù)量，與模型組相比，有顯著性差異(P＜0.05);中低劑量組痛風(fēng)顆粒及陽性藥組與模型組相比，無顯著性差異(P＞0.05)，見表4。

3.5 對尿酸致大鼠高尿酸的影響

高中低3組痛風(fēng)顆粒能有效降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸水平，與模型組相比，有顯著性差異(F=25.264，P＜0.01)，見表4。

3.6 對尿酸致大鼠高尿酸的腎臟變化影響

與模型組相比，各實(shí)驗(yàn)組腎臟系數(shù)無顯著性差異(F=1.060，P=0.396)，見表4。

表3 患肢壓力及步態(tài)積分(n=8)Tab 3 Scores of pressure and gait of affected limbs(n=8)

4 討論

痛風(fēng)屬于中醫(yī)學(xué)的“痹癥”、“風(fēng)濕熱痹”范疇［10］，痛風(fēng)慢性期是由于長期高尿酸在體內(nèi)累積，使尿酸鹽在關(guān)節(jié)內(nèi)沉積增多，炎癥反復(fù)發(fā)作進(jìn)入慢性期而不能消失以至于關(guān)節(jié)組織受損從而累積腎臟的階段，中醫(yī)在臨床上主要采用清熱利濕、伸筋活絡(luò)的治療方法。本方采用茵陳和連錢草清熱利濕，加之伸筋草的通絡(luò)作用，在臨床上治療達(dá)到顯著的療效。

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是由于體內(nèi)尿酸濃度超出正常范圍，析出的尿酸鹽結(jié)晶沉積在關(guān)節(jié)軟骨、滑膜等部位。結(jié)晶激活補(bǔ)體及因子，誘發(fā)白細(xì)胞滲出聚集，吞噬結(jié)晶，在吞噬過程中白細(xì)胞破裂釋放致炎致痛因子，改變體液環(huán)境，體液的pH環(huán)境改變又引起了更多白細(xì)胞的侵襲，從而引起關(guān)節(jié)周圍的非特異性炎癥反應(yīng)［11］。針對關(guān)節(jié)炎的發(fā)炎機(jī)制，考慮處方有效成分可能改變關(guān)節(jié)體液pH環(huán)境，從而達(dá)到抑制炎癥細(xì)胞增生的作用。本研究采用尿酸鈉致大鼠踝關(guān)節(jié)及足跖腫脹模型對該方的抗炎作用進(jìn)行藥效學(xué)研究。將臨床常用的治療慢性痛風(fēng)的排尿酸藥物苯溴馬隆作為陽性對照藥物。抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明痛風(fēng)顆粒有明顯抑制尿酸鈉致大鼠踝關(guān)節(jié)及足跖炎癥的作用，且痛風(fēng)顆粒高劑量組大鼠血液中的白細(xì)胞數(shù)較模型組有明顯的減少，提示痛風(fēng)顆粒對致炎細(xì)胞的抑制有一定的作用。這與臨床療效結(jié)果相一致。

表4 白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血尿酸值及腎臟系數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=8，±s)Tab 4 Experimental results of white blood cell count，uric acid level and the weight coefficient of kidney(n=8，ˉx ± s)

表4 白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血尿酸值及腎臟系數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=8，±s)Tab 4 Experimental results of white blood cell count，uric acid level and the weight coefficient of kidney(n=8，ˉx ± s)

注:與模型組相比，*P ＜0.05，**P ＜0.01note:vs.model group:*P ＜0.05，**P ＜0.01

組別 動(dòng)物數(shù)/只 劑量/g·kg-1 白細(xì)胞計(jì)數(shù)/(個(gè)/L) 血尿酸值/mol·L-1 腎臟系數(shù)/mg·g -1空白組 8 (5.20±0.65)×109** 141±6**4.33±0.40模型組 8 (8.09±1.46)×109 235±26 4.15±0.27痛風(fēng)顆粒 8 3.8 (7.91±3.20)×109 182±19** 4.39±0.15痛風(fēng)顆粒 8 7.7 (6.43±1.07)×109 159±33** 4.34±0.45痛風(fēng)顆粒 8 15.4 (6.36±1.12)×109* 158±10** 4.44±0.28苯溴馬隆 8 5.25 mg·kg-1(6.69±1.22)×109 147±7**4.31±0.32

腎損害是高尿酸血癥常見的并發(fā)癥，血液中高尿酸可刺激腎素的合成，減少一氧化碳的釋放，造成腎內(nèi)高壓，使腎臟肥大，同時(shí)尿酸結(jié)晶沉積可破壞腎小管上皮細(xì)胞，引起腎臟纖維化和硬化［12］。本研究結(jié)果顯示痛風(fēng)顆粒能夠有效降低體內(nèi)尿酸水平，但下降幅度較陽性對照組較少。腎臟系數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明其組間并無顯著性差異，推測原因可能是造模時(shí)間較短，尿酸未能在腎臟累積，使其未產(chǎn)生器質(zhì)性變化所致。

痛風(fēng)顆粒對于抑制炎癥，降低尿酸水平有明顯的作用，故將其推廣用于治療痛風(fēng)有著廣泛的前景。在深入的研究中，可進(jìn)一步對方中活性物質(zhì)的代謝途經(jīng)及代謝方式進(jìn)行藥動(dòng)學(xué)研究。

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