田殿鋒，郭建昇 *，肖 虹，張艷梅

1.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院普外科，山西太原 030001；2.山西醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院病理科，山西太原 030001；3.山西省汾陽醫(yī)院ICU科，山西汾陽 032200

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤，我國年發(fā)病率約為60/10萬，病死率約為30/10萬，居所有惡性腫瘤導致死亡的第1位[1]。同其他實體腫瘤一樣，手術切除是尋求根治的主要手段，但僅有30%~50%的患者可獲得根治性切除，且長期預后并不滿意[2]，故近年來輔助化療已成為除手術外胃癌的另一重要治療手段。大量臨床資料表明，多西他賽（TAX）與奧沙利鉑（OXA）聯合治療多種類型的腫瘤時都有較高的療效，但在體外誘導人胃癌細胞凋亡的研究國內外少有報道。本研究旨在探討多西他賽（TAX）與奧沙利鉑（OXA）聯用是否可以增強對人胃癌細胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人胃癌SGC-7901細胞株購于武漢博士德生物工程有限公司。TAX為深圳萬樂藥業(yè)有限公司產品，OXA為成都長青制藥有限公司產品。RPMI-1640培養(yǎng)基為Hyclone公司產品，胎牛血清購自杭州四季青公司，CCK-8試劑盒為碧云天生物技術有限公司產品，鈣熒光探針Fluo-3/AM為美國Sigma公司產品，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，活細胞、凋亡細胞、壞死細胞鑒別試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人胃腺癌SGC-7901細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的改良型RPMI-1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度、每隔2~3天用0.25%胰酶消化傳代一次。

1.2.2 藥物干預分組 根據公式，臨床藥物血漿峰值濃度（PPC）（mg/L）=[臨床用藥量 （mg/m2）×平均體表面積/平均體重]×100/60，結合臨床藥物常用劑量計算出每種藥物的PPC值，再參考有關文獻[3-4]，確定各實驗組每種藥物的濃度。TAX 組：2.5、5、10、20、40 mg/L，OXA 組：5、10、20、40、80 mg/L，聯合組：以相應的TAX濃度和OXA濃度聯合應用。

1.2.3 CCK-8法檢測不同濃度單藥及聯合用藥處理后SGC-7901細胞的生長抑制率 將處于對數生長期中的SGC-7901細胞用培養(yǎng)基制成細胞懸液，調濃度至2×104cells/ml接種于96孔板內，100 μl/孔。待細胞貼壁后將細胞分成實驗組和對照組，對照組為不加細胞而只加培養(yǎng)基，實驗組分別加入80 μl含有不同濃度的單藥或聯合藥物，每組設6個復孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入 CCK-8 20 μl混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯免疫檢測儀上測定A值，所用波長450 nm，計算各復孔吸光度的平均A值，作為試驗組或對照組的吸光度，計算細胞增殖抑制率，實驗重復3次。細胞生長抑制率=（空白對照組 A均值-實驗組 A均值）/空白對照組 A均值×100%。

1.2.4 中效濃度（Dm）及合用指數（CI）的計算 根據中效原理（Chou-Talalay聯合指數法）[5-6]，應用中效方程式計算來判斷兩種藥物之間相互作用的效果。中效方程式為fa/fu=（D/Dm）m，其中fa為藥物作用效應（即抑制率），fu為存活率，fu=1-fa；D為藥物濃度，m為斜率；Dm為中效濃度IC50。根據抑制率及其濃度，繪出趨勢直線，求出直線回歸方程，計算出兩藥單用及合用時的Dm和m，然后算出兩藥的合用指數（Combination Index，CI）：CI=D1/D×1+D2/D×2+α（D1D2/D×1D×2）。 D1、D2為兩藥合用時產生×效應時兩藥各自所需濃度，Dx1、Dx2為兩藥單獨使用時產生×效應時兩藥各自所需濃度。當兩藥作用機制一致時，α=1；不一致時，α=0。CI＜1兩藥合用時產生協同作用；CI=1 相加；CI＞1 拮抗。

1.2.5 激光共聚焦顯微鏡測定細胞內鈣濃度 取對數生長期細胞，用培養(yǎng)基調整細胞濃度為5×104cells/ml加入內置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內，待細胞貼壁后，根據CCK-8實驗結果選擇的劑量分別加入不同濃度的TAX、OXA，單用或合用24 h后終止培養(yǎng)，用PBS液漂洗細胞2～3次，加入終濃度為10μmol/L Fluo-3/AM應用液，在37℃下避光孵育60 min。置于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)波長488 nm，掃描細胞內熒光強度，可在525 nm處探測到熒光發(fā)射，取得最大熒光信號后，采用IDQ軟件對選定的區(qū)域進行熒光強度的數據采集，數據輸入到Excel 2010作進一步分析處理。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡情況 取對數生長期細胞，以5×104cells/ml密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，根據CCK-8實驗結果選擇的劑量加入不同濃度的TAX、OXA，單用或合用經相應的時間作用后收集給藥組及對照組細胞，PBS 洗滌 2～3 次。 離心收集 1×105細胞，加入 500 μl Binding Buffer懸浮細胞，分別加入 10 μl Annexin V-FITC 和 5 μl PI輕輕混勻，室溫避光反應15 min后流式細胞儀檢測，CellQuest軟件分析細胞凋亡率。

1.2.7 熒光顯微鏡觀察細胞的形態(tài)變化并計算細胞凋亡率SGC-7901細胞經CCK-8實驗結果選擇的藥物濃度單用或合用作用24 h后，收集細胞，PBS洗細胞2次，配成濃度為5×105cells/ml的細胞懸液，取 1 μl的 Mixed Dyes Reagent與25 μl細胞懸液混勻后，吸取10 μl混勻后細胞懸液涂片，在熒光顯微鏡下觀察300個細胞，分別計數活細胞（VN）、早期凋亡細胞（VA）、晚期凋亡細胞（NVA）和死細胞（NVM）數并計算細胞凋亡率。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 不同藥物對SGC-7901細胞增殖的抑制作用

TAX、OXA以及兩者聯合，三組分別對胃癌SGC-7901細胞作用24 h后的細胞增殖抑制率進行比較，結果表明，各組同一時間點不同濃度對SGC-7901細胞增殖抑制率不同，隨濃度升高，增殖抑制率逐漸升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；TAX與OXA聯合組對細胞生長抑制率高于單藥組（P＜0.05），見表1（表中濃度分組1代表TAX組：2.5 mg/L，OXA 組：5 mg/L，聯合組：TAX 2.5 mg/L+OXA 5 mg/L；分組 2代表 TAX 組：5 mg/L，OXA 組：10mg/L，聯合組：TAX 5 mg/L+OXA 10 mg/L；其余分組以相同方式進行）。根據中效方程式計算 TAX 24 h對 SGC-7901細胞的 IC50值為 21.9 mg/L；OXA 24 h的IC50值為31.5 mg/L；聯合時 24 h的IC50值為8.74/13.68 mg/L。CI=0.42，提示兩藥有協同作用。

表1 不同處理24 h后細胞增殖抑制率（ ±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s,n=6)

表1 不同處理24 h后細胞增殖抑制率（ ±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s,n=6)

注：與 TAX 組比較，aP＜0.05；與 OXA 組比較，bP＜0.05

濃度分組 抑制率（%）TAX組 OXA組 TAX+OXA組12345 17.08±7.21 21.15±5.92 26.68±7.93 39.35±5.26 47.24±3.87 20.37±7.86a 25.25±9.27a 30.37±6.57a 41.83±4.63a 48.72±7.11a 30.65±7.24b 36.45±6.32b 45.08±5.39b 47.97±4.94b 61.52±5.27b

2.2 細胞內Ca2+熒光強度變化

正常細胞內外鈣離子濃度相差達100 000倍[7]。胞外鈣內流和胞內鈣庫動員形成的鈣震蕩（鈣峰或鈣波）在各種生理過程中起重要作用。病理狀態(tài)下細胞內鈣超負荷將造成一系列代謝紊亂，直至細胞壞死或凋亡。檢測結果顯示見表2。SGC-7901細胞經TAX和OXA單用及合用24 h后，與空白對照組相比Ca2+熒光強度明顯升高（P＜0.05）。

2.3 不同處理24 h后各組細胞凋亡率比較

流式細胞儀檢測發(fā)現SGC-7901細胞經TAX和OXA單用及合用24 h，對SGC-7901細胞凋亡見表3。兩藥合用組無論與對照組或單用組相比，其誘導的腫瘤細胞凋亡率的升高，均有統計學意義（均 P＜0.01）。

表2 不同處理24 h后各組細胞內Ca2+熒光強度（ ±s）Tab.2 Ca2+fluorescence intensity of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

表2 不同處理24 h后各組細胞內Ca2+熒光強度（ ±s）Tab.2 Ca2+fluorescence intensity of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

注：與空白對照組比較，*P＜0.05

空白對照組TAX組OXA組TAX+OXA組組別 藥物濃度-10 mg/L 20 mg/L 10 mg/L+20 mg/L Ca2+熒光強度18.97±2.35 312.50±25.30*387.63±26.05*562.59±19.60*

表3 不同處理24 h后各組細胞凋亡率比較（ ±s）Tab.3 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

表3 不同處理24 h后各組細胞凋亡率比較（ ±s）Tab.3 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of cells after 24 h( ±s)

注：與空白對照組比較，aP＜0.01

空白對照組TAX組OXA組TAX+OXA組組別 藥物濃度-10 mg/L 20 mg/L 10 mg/L+20 mg/L凋亡率（%）2.03±1.05 11.61±3.06a 13.37±2.51a 28.24±4.11a

2.4 TAX和OXA誘導SGC-7901細胞凋亡

熒光顯微鏡下觀察：對照組細胞呈圓形，核質體被均勻染成綠色，藥物作用組出現形狀不規(guī)則的綠色早期凋亡細胞、橙色的晚期凋亡細胞和呈橢圓形的橙黃色繼發(fā)壞死細胞，與對照組細胞相比，凋亡細胞細胞核碎裂成點狀，可見胞質芽狀突起，且隨著藥物濃度的增加，凋亡細胞和壞死細胞的比例逐漸增多。細胞計數后，不同處理組24 h時間點細胞凋亡率（表4），與流式細胞儀下檢測的凋亡結果基本吻合。

表4 不同處理24 h后SGC-7901細胞凋亡數（個）Tab.4 Apoptosis effects of different treatments on the proliferation of SGC-7901 cells after 24 h

3 討論

胃癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤之一，盡管在診斷和治療方面取得了一定進展，但進展期胃癌的預后仍然很差，不能手術或術后轉移的胃癌，給予化療聯合最佳支持治療與單純最佳支持治療相比，生存期和生活質量方面均具有益處[8-9]。體外研究證明，很多抗癌藥物的抗腫瘤作用不是直接殺傷腫瘤細胞而是誘導腫瘤細胞凋亡或兩種方式并存[10]，由于藥物殺傷腫瘤細胞可導致細胞壞死，產生嚴重的炎性反應，所以誘導腫瘤細胞的凋亡成為治療腫瘤的理想方法。目前已經有多種促凋亡的藥物，其中化療藥物是主要的促細胞凋亡的藥物。

多西他賽是一種新型抗腫瘤藥物，屬于紫杉類，其作用機制是促進微管蛋白聚合和阻止微管解聚，從而抑制癌細胞有絲分裂和增殖。在抑制微管解聚方面，其作用是紫杉醇的2倍，與微管蛋白有更強的親和力，血漿半衰期更長，藥物在細胞內潴留時間更長[11]。奧沙利鉑是1，22-二氨基環(huán)己烷鉑類的水溶性衍生物，是第三代鉑類廣譜抗瘤藥，其主要作用機制是通過DNA-復合體的形成來介導的[12]。和第一代的鉑類藥物相比具有更強的抗瘤作用，能夠引發(fā)細胞的DNA一級和次級損傷，造成惡性腫瘤細胞的凋亡。

本研究發(fā)現，在相同藥物濃度下，聯合用藥組對胃癌細胞抑制作用明顯強于相應單藥組，在同一作用時間點，低濃度TAX和OXA合用，取得了與單藥高濃度組相近或更高療效，減少了單藥用量，降低高濃度化療藥帶來的較嚴重的毒副反應。CCK-8實驗示兩藥合用指數（CI）小于1，表明兩藥間存在協同作用。通過流式細胞儀技術、激光共聚焦顯微鏡檢測細胞鈣超載以及細胞的形態(tài)學觀察，證明TAX和OXA對SGC-7901細胞均具有誘導凋亡的作用。兩藥合用時細胞凋亡率明顯提高，可見TAX和OXA具有協同誘導SGC-7901細胞凋亡的作用。

總之，本研究證實了TAX與OXA聯合用藥的合理性，為臨床設計高效低毒的胃癌化療方案提供實驗資料。

[1]陳凜,李濤.進展期胃癌外科治療的相關問題與思考[J].中華胃腸外科雜志,2007,10：413-415.

[2]Parkin DM,Pisani P,Ferlay J.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin,1999,49：33-64.

[3]蘇艷新,王立.多西他賽聯合TRAIL誘導胃癌細胞SGC7901凋亡的作用[J].中國癌癥雜志,2008,18(4)：262-266.

[4]邵應舉,鄭玉玲,樊青霞,等.全反式維甲酸與奧沙利鉑在誘導人胃癌BGC-823細胞凋亡中的協同作用[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版,2010,31(4)：454-458.

[5]Chou TC,Motzer RJ,Tong Y,et al.Computerized quantitation of synergism and antagonism of taxol,topotecan,and cisplatin against human teratocarcinom a cell growth：a rational approach to clinical protocol design[J].J Natl Cancer Inst,1994,86(20)：1517-1524.

[6]Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis of dose-effect relationships：the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors [J].Adv Enzyme Regul,1984,22：27-55.

[7]李楠,王俊玫,楊軍,等.激光掃描共聚焦顯微鏡測定細胞內游離鈣的方法[J].中國體視學與圖像分析,1997,2(3)：188-191.

[8]Van Cutsem E,A jani JA,Moiseyenko V,et al.Docetaxel(D),cisplatin(C),flluorouracil(F)comparaed to cisplatin and flluorouracil for chemotherapy-naive patients with meta-static or locally recurrent,unresectable gastric carcinoma(MGC)：interim results of a randomized phaseⅢ trial(V325)[J].Proc Am Soc C lin Onco1,2003,22：249(Abstract999).

[9]Ajani J.Clinical update on an internationa l phaseⅡ/Ⅲ do-cetaxel trial(TAX325)[C].Proc Update Meeting on GIC,2002.

[10]呂瑞,高英敏.奧沙利鉑對人宮頸癌HeLa細胞株的體外作用[J].中山大學學報：醫(yī)學科學版,2007,28(5)：485-489.

[11]Crown J,O'Leary M.The taxanesl an update[J].Lancet,2000,355(9210)：1176.

[12]周際昌.實用腫瘤內科學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2006：163-166.