王貴振 范衛(wèi)慶 曹剛?cè)?湯永洋 王 亮 史 強(qiáng)

山東新泰市人民醫(yī)院神經(jīng)外科 新泰 271200

依達(dá)拉奉對(duì)沙鼠前額葉切除后學(xué)習(xí)與記憶的影響

王貴振 范衛(wèi)慶 曹剛?cè)?湯永洋 王 亮 史 強(qiáng)

山東新泰市人民醫(yī)院神經(jīng)外科 新泰 271200

目的探討依達(dá)拉奉對(duì)沙鼠前額葉切除后學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制。方法40只蒙古沙土鼠隨機(jī)分為4組,假手術(shù)組、前額葉切除組、對(duì)照組、依達(dá)拉奉治療組,每組10只。7 d后應(yīng)用4-PTT(4-pellet taking test)旱路迷宮對(duì)各組沙鼠學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行評(píng)定。完成迷宮實(shí)驗(yàn)的沙鼠取腦組織行HE染色和膽堿能神經(jīng)元免疫組化染色,觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷程度,用錐體細(xì)胞密度評(píng)價(jià),CHAT陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞用真彩色圖像分析系統(tǒng)定量和半定量分析。結(jié)果4-PTT旱路迷宮實(shí)驗(yàn)顯示,前額葉切除組中沙鼠參照記憶指標(biāo)和工作記憶指標(biāo)與假手術(shù)組有明顯的差異(P＜0.05),依達(dá)拉奉治療組上述指標(biāo)顯著改善(P＜0.05)。假手術(shù)組未見壞死神經(jīng)元,前額葉皮質(zhì)切除組每個(gè)高倍視野中錐體細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元數(shù)均少于假手術(shù)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。依達(dá)拉奉治療組每個(gè)高倍視野中錐體細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元數(shù)均多于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論依達(dá)拉奉能改善前額葉切除沙鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,與其對(duì)膽堿能神經(jīng)元的保護(hù)有關(guān)。

前額葉;膽堿能神經(jīng)元;4-PTT旱路迷宮;依達(dá)拉奉

依達(dá)拉奉可清除自由基,抑制脂質(zhì)過氧化,從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷,在治療缺血性腦血管病方面有一定療效。但依達(dá)拉奉對(duì)腦損傷后引發(fā)的高級(jí)功能障礙是否具有改善作用尚需深入研究。本研究利用沙鼠的前額葉切除模型,用4-PTT(4-pellet taking test)旱路迷宮及組織學(xué)方法,從海馬區(qū)神經(jīng)元和膽堿能細(xì)胞的變化角度,來探討依達(dá)拉奉對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物模型制備 參考文獻(xiàn)[1]報(bào)道的方法制作前額葉皮質(zhì)切除模型。在(22±1)℃環(huán)境溫度下,將沙鼠予3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后,固定于立體定向儀上。切開頭皮,暴露顱骨,在冠狀縫前 1.0 mm、矢狀縫旁開2 mm處用顯微磨鉆鉆一小骨窗,用顯微持針器擴(kuò)大骨窗。用自制吸引器吸除冠狀縫前約1.0 mm至額極的右側(cè)額葉背外側(cè)皮質(zhì),作一 4 mm×3 mm×1mm大小的創(chuàng)腔,明膠海綿填塞止血后縫合頭皮。各組動(dòng)物在手術(shù)完成7 d或21 d后進(jìn)行4-PTT旱路迷宮實(shí)驗(yàn),測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2 分組及給藥方法 40只雄性蒙古沙土鼠(浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),體質(zhì)量60～80 g,9～12周齡,隨機(jī)分為：假手術(shù)組,前額葉切除組,對(duì)照組(與依達(dá)拉奉等量0.9%氯化鈉溶液),依達(dá)拉奉治療組,每組10只。依達(dá)拉奉組于腦缺血后即刻尾靜脈注射依達(dá)拉奉0.5 mg/kg,1次/d,連續(xù) 7 d。對(duì)照組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.3 腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 迷宮實(shí)驗(yàn)完成后動(dòng)物取前囟后2.5～4.0mm之間的大腦部分進(jìn)行常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片行HE染色。海馬神經(jīng)元損傷的評(píng)價(jià)主要依據(jù)Kirino[2]等人的方法,在Olympus光鏡下觀察海馬CA 1區(qū)錐體層細(xì)胞形態(tài)變化并計(jì)數(shù)單位高倍視野(400×)下的神經(jīng)元數(shù),即神經(jīng)元密度(Neuronal density,ND)。我們?cè)谧笥覂蓚?cè)海馬各任取3個(gè)高倍視野(400×)記數(shù),取平均值。

1.4 膽堿能神經(jīng)元觀察 石蠟切片,常規(guī)脫蠟至水。按試劑盒說明行CHA T免疫組化染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)兩側(cè)海馬CA1區(qū)各3個(gè)高倍視野(400×)范圍內(nèi)的 CHA T陽(yáng)性細(xì)胞并取平均值。

1.5 4-PTT旱路迷宮實(shí)驗(yàn),測(cè)試沙鼠學(xué)習(xí)記憶能力 主要采用的檢測(cè)指標(biāo)為：(1)達(dá)到完成標(biāo)準(zhǔn)所需的實(shí)驗(yàn)次數(shù);(2)每次完成實(shí)驗(yàn)所用的時(shí)間;(3)每次實(shí)驗(yàn)中從開始到吃掉第一個(gè)食丸所用的時(shí)間;(4)每次實(shí)驗(yàn)中的正確錯(cuò)誤數(shù)。指標(biāo)(1)、(2)、(3)主要觀察動(dòng)物通過訓(xùn)練后能正確完成實(shí)驗(yàn)的情況,反映動(dòng)物參照記憶的形成,指標(biāo)(4)主要觀察動(dòng)物進(jìn)入無食物盒次數(shù)、重復(fù)進(jìn)入已吃掉食物食盒次數(shù),反映動(dòng)物工作記憶的形成。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SAS 8.20版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)記憶測(cè)試結(jié)果 與假手術(shù)組比較,前額葉切除組中沙鼠TCTP、TCFP、TRCS、IE和 CE都有明顯差異(P＜0.05);與前額葉切除組比較,對(duì)照組中上述指標(biāo)無明顯變化,而依達(dá)拉奉治療組有較大的改善,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

2.2 病理結(jié)果(HE染色)假手術(shù)組 海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,排列整齊致密,未見變性壞死的神經(jīng)元;缺血組與對(duì)照組海馬CAI區(qū)神經(jīng)元大部分變性壞死,細(xì)胞間隙加大,細(xì)胞核濃縮、深染,溶解、消失;依達(dá)拉奉治療組海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元較前額葉切除組明顯增多,大部分為結(jié)構(gòu)完整的神經(jīng)元;4組神經(jīng)元密度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

2.3 CHAT免疫組織化學(xué)結(jié)果 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組沙鼠海馬CA1區(qū)陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,排列整齊致密,可見2～3層細(xì)胞,細(xì)胞核染色淡,核仁清晰,胞漿染成深棕色,未見明顯變性壞死的神經(jīng)元。前額葉切除組可見海馬CA 1區(qū)陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元排列稀疏,胞漿染成淺棕色,可見變性壞死的神經(jīng)元。見表2。

表1 各組工作記憶與參照記憶的比較

表2 各組海馬CA 1區(qū)神經(jīng)元密度與陽(yáng)性膽堿能神經(jīng)元的比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)用4-P1T旱路迷宮測(cè)試系統(tǒng),全面、客觀的對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間認(rèn)知、記憶加工過程進(jìn)行評(píng)價(jià),結(jié)果顯示：前額葉切除后沙鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯受損,依達(dá)拉奉治療組沙鼠參照記憶和工作記憶明顯改善。依達(dá)拉奉通過多個(gè)途徑減少自由基的產(chǎn)生,減輕自由基對(duì)組成細(xì)胞磷脂膜的多聚不飽和脂肪酸的氧化損傷,抑制出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)的過氧化作用,從而減輕腦水腫和腦組織損傷[3-4]。因膽堿能神經(jīng)元釋放的乙酰膽堿在學(xué)習(xí)與記憶中有重要的調(diào)節(jié)作用,保持其功能正常,是維持哺乳動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶正常進(jìn)行的必要條件[5]。

[1]吳佐泉,王溶楊,馬廉亭,等.胎腦組織移植對(duì)額葉皮層損傷大鼠辨別學(xué)習(xí)、記憶之影響[J].中華器官移植雜志,1997,18(1)：42-44.

[2]Kirino T,Tamu ra A,Sano K.A reversible ty pe of neu ronal injury follow ing ischem ia in the gerbil hippocam pus[J].Stroke,1986,17：455

[3]Kozue S,Yuki OL Semi S,et al.Edaravone scavengers nitric oxide[J].Redox Report,2002,7(4)：219-222.

[4]陳吉相,季艷梅,孫圣剛,等.依達(dá)拉奉對(duì)腦出血大鼠細(xì)胞凋亡及Bc l-2、Bax蛋白表達(dá)的影響[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,36(2)：259-261.

[5]萬選才,楊天祝,徐承燾.現(xiàn)代神經(jīng)生物學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1999：127.

Effect of Edaravone on learning-mem ory after prefrontal cortex excision in gerbils

Wang Guizhen,Fan Weiqing,Cao Gangren,etal.Departmentof Neurosurgery,X intaiPeop le's Hospital,X intai271200,China

ObjectiveTo investigate the effect and the possib le p rotectivemechanism of Edaravone on learning-memory function after p refrontal cortex(PFC)excision in gerbils.MethodsForty gerbils w ere random ly divided into sham-operated group,prefrontal cortex excision group,controlgroup,and Edaravone treatment group.The gerbils of allgroupsw ere carried out 4-PTT maze experiment on the seventh day after operating.After themaze experiment,the brain tissue of the gerbilsw as performed HE staining and immunohistochemical staining of CHAT-positive cholinergic neuron.The damaging degreeofnerve cells in hippocam pus CA1 region w as evaluated by neuronal density.CHAT-positive cho linergic neuron were detected by color image analysis system.Resu lts There were significant differences in the indexes of reference-memory and workingmemory betw een sham operation group and prefrontal cortex excision group.The indexes in Edaravone treatmentgroup w ere improved obviously(P＜0.05);No degenerated and necrotic neurons were found in sham operation group.The density of neurons in p refrontal cortex excision group w as significantly decreased,as compared with that in sham group(P＜0.05).The density of neurons in Edaravone was obviously increased,as compared with that in prefrontal cortex excision group(P＜0.05).The ND/HS,CHAT-positive cells/HS of PFC group w ere fewer than those of sham-operated group,and had statistical significance(P＜0.05);The ND/HS,CHAT-positive cells/HS of Edaravone treatment group weremore than those of controlgroup,and had statistical significance(P＜0.05).ConclusionEdaravone can imp rove the learning-memory function after prefrontal cortex excision in gerbils,because of its protection on cholinergic neurons.

PFC;Cholinergic neuron;4-pellet taking test;Edaravone

R-332

A

1673-5110(2011)07-0014-03

(收稿2011-01-18)