劉 丹 王亞春 孫洪英 連 瑜 賈 璐 吳麗娥 王貴喜 郭 霞

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)2科 包頭 014010

MMP-2、MMP-9基因多態(tài)性與缺血性腦卒中臨床分型及預(yù)后

劉 丹 王亞春 孫洪英 連 瑜 賈 璐 吳麗娥 王貴喜 郭 霞

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)2科 包頭 014010

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix Metalloproteinase-2,MMP-2)基因 C1306T、C735T和MM P-9基因C1562T多態(tài)性位點(diǎn)與缺血性腦卒中的關(guān)系。方法采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析技術(shù),檢測(cè)缺血性腦卒中組232例和健康對(duì)照組235例MMP-2基因C1306T、C735T和MMP-9基因C1562T多態(tài)的分布。結(jié)果缺血性腦卒中組和對(duì)照組MMP-2 C1306T基因型和等位基因頻率分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組MM P-9 C1562T的CT+TT基因型頻率和T等位基因頻率、MMP-2 C735T的CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組(P＜0.05),而在腦栓塞組、腔梗組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。多因素Logistic回歸分析,MM P-2、MMP-9不同基因型別與缺血性腦卒中預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。結(jié)論MMP-2 C735T的C等位基因、MM P-9 C1562T的T等位基因是動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死的遺傳易感基因之一。MMP-2、MMP-9基因多態(tài)性與缺血性腦卒中預(yù)后無(wú)關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9基因多態(tài)性;缺血性腦卒中;臨床分型;預(yù)后

MMP-2基因啟動(dòng)子區(qū)1306、735和 MMP-9基因啟動(dòng)子區(qū)1562位點(diǎn)存在C→T突變,從而影響 MMP-2、MMP-9的表達(dá),影響腦卒中的發(fā)生發(fā)展。本文擬探討 MMP-2、M MP-9基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象和方法 選擇2009-07～2010-10在我科連續(xù)住院的初發(fā)缺血性腦卒中患者,均符合全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議通過(guò)的診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)頭顱CT或M RI檢查證實(shí)。缺血性腦卒中臨床分型包括動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死、腦栓塞、腔隙性腦梗死。有嚴(yán)重感染、惡性腫瘤、結(jié)締組織病以及1 a內(nèi)患組織損傷疾病如心肌梗死、重大外科手術(shù)及接受免疫抑制劑治療者除外。同期選擇健康人群作為對(duì)照組。入組者均為包頭市長(zhǎng)住居民,均為漢族,彼此無(wú)親緣關(guān)系。

1.2 基因型判定

1.2.1 標(biāo)本采集及DNA的抽提：抽取患者晨空腹靜脈血2 m L,置EDTA-Na2抗凝管中-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用北京天根公司血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.2 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)：PCR引物序列參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì),由上海生工合成。MMP-2 C1306T序列為：上游引物5′-CTTCCTAGGCTGGTCCTTACTGA-3′下 游 引 物 5′-CTGAGACCTG AAGACCTAAAGAGCT-3′, 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 為193bp。MM P-2 C735T序列為：上游引物5′-GGAT TCTTGGCTTGGCGCAGGA-3′下游引物 5′-GGGGGCTGGGTAAAATGAGGCTG-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物為 391 bp;MM P-9 C1562 T序列為：上游引物 5′-GCCTGGCACATAGTAGGCCC-3′下游引物 5′-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3′,擴(kuò)增產(chǎn)物 為435 bp。反應(yīng)體系為 25μL,其中模板 DNA 100 ng,10×buffer 5μL,dDNPs 1μL,TaqDNA聚合酶 1.0 U和上下游引物各2μL;反應(yīng)條為：94℃預(yù)變性5 min,然后94℃30 s,58 ℃(MMP-2 C1306T)、62 ℃(MMP-2 C735T)、或 65 ℃(MMP-9 C1562T)45 s,72℃45 s,30個(gè)循環(huán)后,72℃延伸10 m in。3種 PCR產(chǎn)物分別經(jīng) XspⅠ(MMP-2 C1306T)、HinfⅠ(MMP-2 C735T)和 PaeⅠ(MMP-9 C1562T)限制性內(nèi)切酶酶切后分析基因型。結(jié)果見(jiàn)圖1、2、3。

圖1 PCR-XSPⅠ酶切的MMP-2 C1306T SNP基因型分型

圖2 PCR-HinfⅠ酶切的MMP-2 C735T SNP基因型分型

圖3 PCR-PaeⅠ酶切的MMP-9 C1562T SNP基因型分型

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件處理。用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算單個(gè)基因型和等位基因頻率。不同基因型和等位基因頻率比較采用卡方檢驗(yàn)。不同基因型別的預(yù)后比較,采用logistic回歸分析,并對(duì)年齡、性別、既往病史、血脂、血糖、并發(fā)癥、治療等因素進(jìn)行校正。

表1 缺血性腦卒中與對(duì)照組 MMP-2、MM P-9的基因型和等位基因頻率 [例(%)]

2 結(jié)果

2.1 腦卒中組和對(duì)照組的一般臨床資料 缺血性腦卒中組232例,男144例,女 88例;平均年齡(62.07±4.88)歲。對(duì)照組235例,男146例,女89例;平均年齡(60.86±9.92)歲。2組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,有可比性。和對(duì)照組比較,腦卒中組吸煙者、合并頸動(dòng)脈粥樣硬化、收縮壓、舒張壓甘油三酯水平增高人數(shù)較多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而體重指數(shù)、血糖、總膽固醇水平雖然增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 MMP-2基因C1306T、C735T和 MMP-9基因 C1562T基因型頻數(shù)分布 表2結(jié)果顯示,2組人群MM P-2基因C1306T、C735T和MM P-9基因 C1562T多態(tài)性基因型分布均處于H ardy-Weinberg平衡(P＜0.05),具有群體代表性。MMP-2基因C1306T的基因型和等位基因頻率分布缺血性腦卒中各組(動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組115例、腦栓塞組31例、腔隙性腦梗死組 86例)和對(duì)照組之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組MMP-2基因 C735T的 CC基因型、C等位基因頻率和MMP-9基因C1562T的CT+TT基因型頻率和T等位基因頻率明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 MMP-2、MMP-9不同基因型與預(yù)后的關(guān)系 在患者病后21 d及3個(gè)月進(jìn)行隨訪。預(yù)后評(píng)價(jià)指標(biāo)采用死亡和殘疾。殘疾采用Barthel Index(BI)評(píng)價(jià),BI指數(shù)≤60分為依賴,BI＞60分為非依賴。缺血性腦卒中組發(fā)病21 d時(shí)死亡2例,殘疾34例,到發(fā)病3個(gè)月時(shí)共死亡3例,殘疾19例。死亡和依賴者為預(yù)后差。非依賴者為預(yù)后好。以預(yù)后為因變量,以年齡、性別、既往史、入院時(shí)病情嚴(yán)重程度、有無(wú)并發(fā)癥、治療和MMP-2基因 C1306T、C735T和MM P-9基因C1562T基因型為自變量,進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果表明各基因型別與缺血性腦卒中預(yù)后無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05)。

3 討論

缺血性腦卒中是一個(gè)多基因遺傳疾病,目前為止,其確切發(fā)病機(jī)制及其病理生理過(guò)程仍不清楚。大量研究表明MMP-2、MM P-9通過(guò)降解細(xì)胞外間質(zhì)(ECM),參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、遷移、破裂崩解;腦缺血后再灌注損傷、腦梗死后出血轉(zhuǎn)化;神經(jīng)元的凋亡等[1-5]。而與腦卒中的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

MMP-2基因定位于人類染色體16q21,包含多個(gè)SNPs,其中位于基因啟動(dòng)子區(qū)存在1306C→T和735C→T變異,體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí),C等位基因轉(zhuǎn)錄活性顯著高于T等位基因[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2基因C1306T的基因型和等位基因頻率分布腦卒中各組和對(duì)照組之間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。而MMP-2基因C735T的CC基因型和C等位基因頻率在動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),提示MMP-2 C735T的C等位基因與缺血性腦卒中的發(fā)病有關(guān)。我們推測(cè),由于MMP-2 C735T的C等位基因頻率明顯高于對(duì)照組,導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平增高,引起梗死區(qū)MMP-2表達(dá)增多,MMP-2降解 ECM,血腦屏障被破壞,進(jìn)一步導(dǎo)致缺血性腦卒中患者血清MMP-2水平明顯增高,造成卒中后繼發(fā)性腦損傷。

MMP-9基因定位于人類染色體16q11.2-13.1,其中基因啟動(dòng)子區(qū)存在1562C→T變異。當(dāng)C突變?yōu)門(mén)后,最終表現(xiàn)為啟動(dòng)子的活性增強(qiáng),基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加[8]。我們的研究發(fā)現(xiàn)MMP-9基因C1562T的CT+TT基因型頻率和T等位基因頻率在動(dòng)脈粥樣硬化性血栓性腦梗死組中明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。我們推測(cè),腦梗死組T等位基因增高,即C突變?yōu)門(mén)增多,導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng),MM P-9表達(dá)明顯增加,促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成,增加斑塊的不穩(wěn)定性,斑塊崩解、破裂,導(dǎo)致腦梗死的發(fā)生和梗死后繼發(fā)性腦損傷,因此MMP-9 C1562T的T等位基因與缺血性腦卒中的發(fā)病相關(guān)。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) MM P-2基因 C1306T、C735T和 MMP-9基因C1562T各基因型別與腦卒中預(yù)后,無(wú)顯著相關(guān)性(P＞0.05),國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

綜上所述,MMP-2 C735T的 C等位基因、MMP-9 C1562T的T等位基因是缺血性腦卒中遺傳易感基因之一。然而,腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,是獲得性危險(xiǎn)因素如生活方式、高血脂、高血壓、糖尿病等和種族、地域、環(huán)境、遺傳性危險(xiǎn)因素如基因多態(tài)性等共同相互作用所致,本研究樣本含量較小,缺乏大規(guī)模、前瞻性特點(diǎn),尚需擴(kuò)大樣本深入研究,也將為防治缺血性腦卒中帶來(lái)新的方向。

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Study on polymorphisms ofmatrix metalloproteinase-2 and-9 genes,and clinical classification and prognosis of ischem ic stroke

Liu Dan,Wang Yachun,Sun Hongying,etal.Departmentof Neurology,the First A f filiated Hospita l,Baotou Medica l Col lege,Baotou014010,China

ObjectiveTo investigate theassociation betw een C1306T,C735T polymorphism ofmatrixmetalloproteinase-2 gene,C1562T polymorphism of matrix metalloproteinase-9 gene and ischem ic stroke.MethodsTwo hund red and thirty-two patientsw ith ischem ic stroke(115 cases of atherosclerotic thrombotic cerebral in farction,86 cases of lacunar infarc tion and 31 cases of cerebral embolism)and 235 healthy controlsw ere recruited.Polymerase chain reaction follow ed by restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to detect C1306T,C735T po lymorphism of MMP-2 gene and C1562T polymorphism of MMP-9 gene.ResultsThere wereno significant differences in genotype frequency of C1306T polymorphism of MMP-2 gene between ischemic stroke and controls.CT and TT genotype frequency of C1562T polymorphism of MMP-9 gene and T allele,CC genotype frequency of C735T polymorphism of MMP-2 gene and C allele in atherosclerotic thrombotic cerebral infarction w ere higher than controls;there wasn't significant difference between lacunar infarction,cerebralembolism and controls.There w ere no significant correlations betw een different genotype of MMP-2,MMP-9 and p rognosis of ischem ic stroke by Logistic regression analysis.ConclusionThese results suggest that the C allele of C735T of MMP-2 gene and T allele of C1562T ofMM P-9 gene are one of genetic susceptiblegenes to atherosclerotic th rombotic cerebral infarction.Polymorphisms of matrixmetalloproteinase-2,-9 genes have no correlation with p rognosis of ischemic stroke.

Polymorphisms ofmatrixmetallop roteinase-2 and-9 genes;Ischem ic stroke;Clinica lclassification;Prognosis

R743.33

A

1673-5110(2011)07-0003-03

(收稿2011-01-17)