,,,

(右江民族醫(yī)學院形態(tài)學實驗教學中心,廣西 百色 533000 E-mail：78477503@qq.com)

脫鈣是骨組織切片最常用的技術(shù),傳統(tǒng)的脫鈣方法所需時間較長,短則3～4天,長則1～2個月,大大影響工作效率,也影響制片的質(zhì)量。常用的快速脫鈣法用戊二醛等試劑加強滲透力來加快脫鈣速度,但很容易破壞骨組織的結(jié)構(gòu)。如果在加戊二醛之前先用足夠量的甲醛固定骨組織,既可以縮短脫鈣時間又可以保護骨組織的結(jié)構(gòu),保證了切片質(zhì)量?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 教學、科研所用的大、小鼠和兔的股骨,蒸餾水,濃鹽酸(36%～38%),甲酸(99%),冰醋酸,飽和的苦味酸溶液,磷酸二氫鈉,磷酸氫二鈉,甲醛溶液,戊二醛(25%)。

1.2 方法

1.2.1 固定 用Bouin,固定時間2.5h。

1.2.2 脫鈣 甲溶液：蒸餾水60ml加濃鹽酸(36%～38%)9ml加甲酸溶液6ml加磷酸氫二鈉5g加磷酸二氫鈉1g配制待用;乙溶液：甲醛溶液10ml;丙溶液：25%戊二醛15ml。脫鈣時甲、乙和丙三種溶液臨時按 75ml∶10ml∶15ml混合后作為脫鈣工作液使用。取標本約1.5cm×1.5cm×0.3cm的小塊便于脫鈣,脫鈣時最好用廣口瓶,敞開瓶口,隨時觀察脫鈣情況,標本要分散,聚集和緊貼瓶底都會影響脫鈣的速度。室溫控制在37℃左右便于脫鈣,溫度過高試劑易揮發(fā),溫度過低脫鈣的速度減慢。脫鈣工作液換1～2次,時間約為4h。脫鈣終點的檢測：標本脫鈣不足易于損傷切刀,組織切片也易于碎裂,標本脫鈣過度對組織結(jié)構(gòu)是不可逆的損害,所以要及時準確判斷脫鈣終點。脫鈣終點的檢測有化學方法和物理方法,化學方法準確但比較煩瑣,物理方法比較簡單但易損傷組織結(jié)構(gòu)。化學檢測脫鈣終點所需要的是5%的氫氧化銨儲存液(蒸餾水95ml加28%氫氧化銨5ml)和5%的草酸銨儲存液。檢測時用5%的氫氧化銨儲存液和5%的草酸銨儲存液按1∶1配制檢測工作液。檢測時把吸管插入正在進行脫鈣含有樣本的脫鈣液中,從脫鈣瓶的底部吸取3ml脫鈣液,裝入一干凈的試管,再加入6ml氫氧化銨/草酸銨工作液,靜放置30min無沉淀說明脫鈣完全,如有沉淀應換脫鈣工作液,繼續(xù)脫鈣直至檢測無沉淀為止。物理檢測方法,可輕度彎曲標本、細針插入標本和用刀片切割,易彎曲、插入或切割說明脫鈣完全。經(jīng)嚴格檢查脫鈣完全后,組織塊應充分沖洗,按常規(guī)進行脫水、透明、包埋、切片和染色。

2 結(jié)果

標本用改良快速骨組織的脫鈣法處理后切片質(zhì)量良好,切片完整,切片厚度可達3～4 μ m,染色時切片不易脫落,骨組織結(jié)構(gòu)完整,鏡下觀察骨密質(zhì)著色均勻,骨陷窩清楚,骨細胞核染色清晰,對比鮮明,胞漿界限清楚。骨松質(zhì)紋理清楚,人為斷裂、缺損少。骨髓腔的各種細胞染色分明,細胞邊界清晰。此脫鈣法處理后切片效果良好(見圖1)。

圖1 快速脫鈣法骨切片效果圖

3 討論

傳統(tǒng)的脫鈣方法是將標本取好材固定后直接放入稀酸溶液中進行脫鈣[1],脫鈣時間短則需要24h,長則需要幾天,甚至幾個月,而本方法僅需要3～4h。傳統(tǒng)的脫鈣方法經(jīng)脫水包埋后,切片厚度較厚,常在5μ m以上,而且切片染色時組織易出現(xiàn)脫落現(xiàn)象[2]。如脫鈣時間掌握不好不僅損壞刀刃,還會破壞骨組織中的細胞學形態(tài)。此法脫鈣,在脫鈣液中加入甲醛可以在脫鈣過程中進一步固定骨組織的結(jié)構(gòu)免受酸的破壞,在脫鈣液中加入戊二醛可以加大脫鈣液的穿透力而加快脫鈣速度[3]。本方法同時使用甲醛和小劑量的戊二醛,減少甲醛用量,降低組織塊脆性,防止組織塊的碎裂;減少戊二醛的用量,減輕對組織結(jié)構(gòu)的破壞。所以此法脫鈣既有保護組織的結(jié)構(gòu)又能縮短脫鈣時間從而使切片既快又好,節(jié)約時間和成本,值得推廣。

[1]王伯,李玉松,黃高升,等.病理學技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2001：944.

[2]趙潔,李霞,魏志敏,等.骨組織脫鈣方法的改良[J].齊魯醫(yī)學雜志,2006,21(4)：356.

[3]李江濤.一種骨組織塊速脫鈣方法[J].陜西腫瘤醫(yī)學,2001,9(4)：261.