陳海榮，郭照輝，劉前剛，劉清術(shù)

（湖南省微生物研究所，湖南 長沙 410009）

紫云英又名紅花草，豆科黃芪屬植物，主要分布在長江中下游和華南地區(qū)，在海拔400～3 000 m的地帶生長良好，是一種重要的綠肥、飼料兼用作物。人們發(fā)現(xiàn)，根瘤菌與豆科植物共生固氮體系是自然界固氮效率最高、固氮量最大的生物固氮體系[1-2]。我國陳華癸和徐明光最先獲得紫云英根瘤菌有效菌株[3]。隨后，人們對紫云英根瘤菌進(jìn)行了多方面的研究，發(fā)現(xiàn)采用紫云英根瘤菌劑接種能使作物增產(chǎn)20%～30%，效果顯著。在初次栽種紫云英的土壤中接種有效根瘤菌是種植成敗的重要因素，多年種植紫云英的地區(qū)接種優(yōu)良菌株也能促進(jìn)地上部分增產(chǎn)[4]。因此，開發(fā)一類高效的紫云英固氮菌劑對提高紫云英的產(chǎn)量，增加稻田土壤肥力具有重要意義。根瘤菌接種效果與根瘤菌株的的固氮能力、競爭結(jié)瘤能力和活菌數(shù)有關(guān)。筆者以中慢生華癸根瘤菌13004#菌株為供試菌株，篩選優(yōu)質(zhì)高效的培養(yǎng)基，提高根瘤菌的活菌數(shù)，以期為根瘤菌劑的生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 株 中慢生華癸根瘤菌（Mesorhizobium huakuii）13004#菌株，為紫云英中慢生根瘤菌，從中國農(nóng)科院菌種保藏中心引進(jìn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 YMA培養(yǎng)基：甘露醇 10 g/L，酵母粉 1 g/L，K2HPO40.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（Rh微量元素液：H3BO35 g/L，Na2MnO45 g/L），pH 6.8～7.0。

SM培養(yǎng)基：甘露醇 10 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl20.05 g/L，KNO30.5 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L（配方同上），混合維生素液1 mL（混合維生素液：硫胺素10 mg/L，煙酰胺 10 mg/L，泛酸鈣 10 mg/L，生物素 1 mg/L），pH 6.8～7.0。

63#培養(yǎng)基（中國農(nóng)科院網(wǎng)站提供）：蔗糖 10 g/L，酵母粉 1 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2 g/L，1%H3BO31 mL/L，1%Na2MnO41 mL/L，1%檸檬酸鐵 1 mL/L，1%MnSO41 mL/L，pH 6.8～7.0。

TY培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L，酵母粉3 g/L，CaCl21.3 g/L，pH 6.8～7.0。

BSE培養(yǎng)基：甘露醇 10 g/L，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaCl20.05 g/L，Rh微量元素液4 mL/L（配方同上），豆芽汁1 000 mL，pH 6.8～7.0（豆芽汁配方：500 g鮮豆芽加入1 500 mL水煮沸30 min后，用紗布過濾即得）。

種子培養(yǎng)基：用YMA培養(yǎng)基作為種子培養(yǎng)基?；罹鷶?shù)計數(shù)培養(yǎng)基：YMA固體培養(yǎng)基（YMA液體培養(yǎng)基+2%瓊脂粉）。

1.2 試驗方法

1.2.1 根瘤菌菌株的分離活化、傳代、接種和培養(yǎng)在YMA固體培養(yǎng)基平板上分離根瘤菌株，將單菌落接入斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)作為菌種。然后將斜面的菌種接入種子培養(yǎng)基中，30℃，160 r/min培養(yǎng)18 h。最后按2%的接種量將種子培養(yǎng)基中菌液接種到液體培養(yǎng)基，恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)，160 r/min，30℃培養(yǎng)。

1.2.2 根瘤菌在5種培養(yǎng)基中生長情況的測定培養(yǎng)24 h后開始計數(shù)，每6 h計數(shù)一次。計數(shù)采用平板計數(shù)法，稀釋倍數(shù)取107、108、1093個梯度，每個梯度3個平行，取菌落數(shù)在30～150個的平板讀數(shù)，計算3個平板的平均值。

1.2.3 培養(yǎng)基碳源的篩選 以5個培養(yǎng)基中活菌數(shù)最高的培養(yǎng)基為母本，進(jìn)行碳源篩選試驗。分別用等量的蔗糖、葡萄糖、甘露醇、麥芽糖及甘油進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基其他成分不變。按2%接種量從種子培養(yǎng)基中接入上述培養(yǎng)基，取24、36、48 h 3個時間點(diǎn)進(jìn)行活菌數(shù)測定，選出最佳碳源。

1.2.4 培養(yǎng)基氮源的篩選 確定最佳碳源后，將培養(yǎng)基中的氮源用等量的酵母粉、蛋白胨、大豆粉、魚粉進(jìn)行試驗，培養(yǎng)基其他成分不變。按2%接種量從種子培養(yǎng)基中接入上述培養(yǎng)基，取24、36、48 h 3個時間點(diǎn)進(jìn)行活菌數(shù)測定，選出最佳氮源。

1.2.5 正交設(shè)計優(yōu)化選定培養(yǎng)基主要成分 對培養(yǎng)基中的碳源、氮源、磷源及MgSO44種主要成分進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計試驗。培養(yǎng)48 h后，用分光光度計測定其600 nm下的OD值，分析4種物質(zhì)對根瘤菌的影響度及最佳劑量組合。

1.2.6 驗證試驗 用1.2.5中得到的最佳培養(yǎng)基與試驗中的活菌數(shù)最高的培養(yǎng)基進(jìn)行活菌數(shù)比較，驗證正交試驗結(jié)果是否準(zhǔn)確。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫云英根瘤菌在5種不同培養(yǎng)基中生長狀況比較

根據(jù) 13004#根瘤菌在 YMA、SM、63#、TY 和BSE培養(yǎng)基中的生長情況所測的的活菌數(shù)繪制曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，13004#菌株在5種培養(yǎng)基中均能生長，在YMA、63#和BSE培養(yǎng)基中生長速度較快，活菌數(shù)較高，但在SM和TY培養(yǎng)基中表現(xiàn)較差。比較3種表現(xiàn)較好的培養(yǎng)基，BSE中豆芽受季節(jié)條件限制，不利于生產(chǎn)；63#培養(yǎng)基成本較高，因此，YMA培養(yǎng)基是紫云英根瘤菌13004#菌株較為理想的培養(yǎng)基。

2.2 根瘤菌對不同碳源的利用情況

YMA培養(yǎng)基其它成分不變，碳源分別用等質(zhì)量的甘露醇、蔗糖、葡萄糖、麥芽糖及甘油做對比試驗，平板計數(shù)法測得24、36和48 h活菌數(shù)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，13004#根瘤菌在甘露醇和蔗糖中生長較好，甘露醇略優(yōu)于蔗糖，在麥芽糖中次之，在葡萄糖和甘油中成長較差。因甘露醇在生產(chǎn)成本上要遠(yuǎn)高于蔗糖，故選定蔗糖為根瘤菌培養(yǎng)基碳源。

2.3 根瘤菌對不同氮源的利用情況

確定以蔗糖為碳源后，將YMA中的氮源用等質(zhì)量的蛋白胨、酵母粉、大豆粉及魚粉代替，其它成分不變，做對比試驗。平板計數(shù)法測得24、36和48 h活菌數(shù)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，根瘤菌在以酵母粉為氮源的培養(yǎng)基中生長效果最好，蛋白胨次之，大豆粉和魚粉的利用效果差。

2.4 正交優(yōu)化結(jié)果

在確定蔗糖、酵母粉分別為碳源和氮源后，對培養(yǎng)基中4種主要成分：蔗糖、酵母粉、K2HPO3、Mg－SO4·7H2O做正交設(shè)計試驗，以確定最佳組合劑量。正交設(shè)計方案及結(jié)果如表1所示。由表1可知，13004#根瘤菌株在2號培養(yǎng)基中生長最好，其次為1號培養(yǎng)基，在9號培養(yǎng)基中生長最差。經(jīng)極差分析，4種培養(yǎng)基成分對菌株生長結(jié)果的影響順序為：蔗糖＞酵母粉＞K2HPO4＞MgSO4·7H2O，培養(yǎng)基最佳劑量組合為A1B2C1D2，即蔗糖10 g，酵母粉3 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。

表1 根瘤菌L9（34）培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗設(shè)計及結(jié)果

2.5 驗證試驗

以正交設(shè)計得到的A1B2C1D2配方做培養(yǎng)基，與正交試驗中生長最好的2號培養(yǎng)基以及原始YMA培養(yǎng)基做對比試驗，培養(yǎng)基其它成分以YMA培養(yǎng)基為參考。菌株在培養(yǎng)24、36、48 h用平板計數(shù)法測定3種培養(yǎng)基中活菌數(shù)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，經(jīng)過正交試驗得到的培養(yǎng)基在24、36、48 h的活菌數(shù)均高于其他兩種培養(yǎng)基，可以初步判斷，正交試驗結(jié)果準(zhǔn)確，得到的新培養(yǎng)基比原始培養(yǎng)基好。

3 總結(jié)與討論

關(guān)于根瘤菌培養(yǎng)基的優(yōu)化問題，不少學(xué)者已作過研究[5-8]，但主要集中在大豆和花生等經(jīng)濟(jì)作物上，對紫云英根瘤菌的研究相對較少。本試驗證明YMA培養(yǎng)基比較適合紫云英根瘤菌13004#菌株。

碳源和氮源利用試驗表明，甘露醇和蔗糖是該菌株比較理想的碳源，因甘露醇價格相對較高，選擇蔗糖作為碳源，性價比更高；而酵母粉是該菌株優(yōu)秀的氮源選擇。正交試驗及活菌數(shù)驗證得出培養(yǎng)基最佳配方如下：蔗糖 10 g，酵母粉 3 g，K2HPO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NaCl 0.1 g/L，CaSO40.2 g/L，Rh微量元素液 4 mL/L，pH 6.8～7.0。

選擇高活菌數(shù)的培養(yǎng)基是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)紫云英根瘤菌肥的第一步，保持菌肥中長期高效的活菌數(shù)是生產(chǎn)根瘤菌肥的關(guān)鍵。在菌肥的劑型上，固態(tài)菌肥保質(zhì)期長，活菌數(shù)較少，易污染程度高；液態(tài)菌肥活菌數(shù)高，保質(zhì)期短，交通運(yùn)輸不便，如何把兩者的優(yōu)點(diǎn)有機(jī)地結(jié)合起來還需要進(jìn)一步的研究。

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