姚清國，段書德，張文娜

（石家莊學(xué)院化工學(xué)院，河北 石家莊 050035）

在多細胞生物中，細胞與細胞之間的相互通訊是不可缺少的，細胞之間的相互識別對于細胞生長和分化起著決定的作用，其中植物胞外的信號分子在細胞之間的信息傳遞中扮演者重要的角色[1]。在植物學(xué)研究中，小分子激素如生長素、細胞分裂素、赤霉素、乙烯、ABA和油菜素類脂等一直是公認的信號分子，人們對其比較關(guān)注而且研究比較清楚。直到10年前，一篇評述性文章“Plants，like animals，may make use of peptide signals”在 Science上發(fā)表之后，人們才開始關(guān)注植物胞外蛋白作為細胞間信號分子的研究[2]?，F(xiàn)在研究得比較清楚的胞外蛋白有 4 個，分別是系統(tǒng)素[3]、PSK[4]、CLV3[5]和SCR[6]。Olee 1是一種主要過敏原，該蛋白最早在橄欖樹的花粉中發(fā)現(xiàn)并純化，因此命名為Olee I[7]。Olee 1由145個氨基酸組成的，與已知的番茄花粉LAT52蛋白和玉米中的Zm13蛋白十分相似。Olee I的結(jié)構(gòu)域中含有6個保守的半胱氨酸，一個保守的花粉表達的序列E/Q/T/-G-X-V-Y-C-D-T/N/P-C-R。在植物中存在一個與Olee 1同源的蛋白家族，稱為Olee 1蛋白家族，有些Ole家族的蛋白還富含脯氨酸，蛋白分子量從8 kD到50 kD，具有可溶性和穩(wěn)定性，會引起IgE調(diào)節(jié)的過敏反應(yīng)[8]。水稻基因組中有45個Olee 1家族的蛋白[9]，但它們的表達模式各不相同，推測可能參與不同的生物學(xué)過程，發(fā)揮不同的功能。筆者在水稻中找到一個與Olee 1同源并在授粉后RNA水平表達量明顯上調(diào)的基因，并對其生物學(xué)功能進行了初步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水稻品種為日本晴[Oryza sativa（japonica cultivar-group）]；細菌菌株 DH5α、農(nóng)桿菌 EHA105均為本實驗室保存；載體 pTCK303、pCAMBIA 1300、pYFP、pGEX-2T 為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建 載體構(gòu)建所用的引物由生工公司或賽百盛公司合成，通過RT-PCR擴增出Os－Ole1連到pCAMBIA 1300上，構(gòu)建成后面融合GUS的超表達載體并進行了測序；通過RT-PCR擴增出OsOle1連到pYFP上。forward primer（Pogf）：5′-CC A AG CTT ATG GCC TCT CTC CGC ACC-3′，reverse primer（Pogr）：5′-CGG GAT CCC CTC GTT ATC ATC ATC AGC CAG GAT-3′，構(gòu)建成后面融合YFP的超表達載體。

1.2.2 水稻遺傳轉(zhuǎn)化和GUS染色 水稻遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻愈傷轉(zhuǎn)化的方法，收集轉(zhuǎn)基因水稻不同發(fā)育時期的組織，按照Jefferson的方法進行 GUS染色[10]。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀察 將上述打過基因槍的洋蔥表皮（仍在上述MS固體培養(yǎng)基的濾紙之上）放于22℃，連續(xù)光照條件下培養(yǎng)16 h，然后將洋蔥表皮置于MS緩沖液（pH 7.0）中。在Bio-Rad MR（A2）型激光掃描共聚焦顯微鏡上進行觀察。觀察條件：以488 nm為激發(fā)光，強度為30%。同時打開軟件對鏡中的目標(biāo)細胞掃圖。再用質(zhì)壁分離液（MS，0.15 mol/L的蔗糖，0.45 mol/L甘露醇）處理洋蔥表皮細胞，直至發(fā)生質(zhì)壁分離，同時進行觀察拍照。

1.2.4 掃描電鏡觀察水稻葉片表皮細胞 掃描電鏡采用日立S-570型，分辨率3.5 nm，放大倍數(shù)20～200 000倍，取水稻的葉片，用二蒸水沖洗干凈，放入戊二醛（2.5%）中固定，采用梯度的方法進行脫水，依次放入30%、50%、70%、80%、90%、100%乙醇中，每次30 min。之后放入新的100%的乙醇過夜，第二天放入醋酸異戊脂30 min，放入預(yù)冷的干燥儀樣品室，注入液態(tài)的CO2進行置換，保持室溫20℃，壓力 50～70 Kg/cm2，20 min，溫度升到 40℃，壓力 80～100 Kg/cm2，保持 5min，放氣（速度在 100～500 mL）/min，當(dāng)壓力低于30 Kg/cm2時切斷加熱器，取出樣品，真空噴金，然后放入掃描電鏡中觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsOle1的生物信息學(xué)分析

橄欖樹花粉中發(fā)現(xiàn)的過敏原蛋白Olee 1在植物中屬于一個大的家族，在NCBI的水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中以橄欖樹Olee 1的氨基酸序列進行搜索，得到一個同源的蛋白（CAE05158.2），序列同一性為35%（45/128），相似性為 52%（67/128），蛋白對應(yīng)的cDNA序列號為AL731591，該基因有一個內(nèi)含子，因此命名為OsOle1，OsOle1共有165個氨基酸殘基，N端1-24位氨基酸為預(yù)測的信號肽序列，肽鏈斷裂位點在24位的Ala和25位Thr之間。

將OsOle1蛋白序列在NCBI的蛋白數(shù)據(jù)庫中進行比對，得到75個相似度比較高（e＜0.01）的蛋白序列。運用MEGA3.0對這些蛋白序列進行進化樹分析（圖1），發(fā)現(xiàn)OsOle1和水稻，百合和玉米中的同源蛋白蛋白分布在一個大的BII分支中分支中，該分支只有12個成員，全部為單子葉植物。擬南芥，番茄和橄欖樹中與OsOle1同源的蛋白分布在另外的幾個分支中，A，BI及CI、CII分支全部都是雙子葉植物，共有64個蛋白。由此可見，Ole家族的蛋白在單子葉和雙子葉植物進化中有明顯的區(qū)別。

圖1 Ole家族的進化樹構(gòu)建

該進化樹中有功能注釋的5個蛋白分別是：橄欖樹中的Olee 1（P19963），擬南芥中的SAH7（NP567338），玉米中的Zm13（P33050），百合中LLP-B3（ANN76546），番茄中的 LAT52（P13347）。選取這五個蛋白與水稻中的OsOle1進行氨基酸序列比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些蛋白與花粉特異的Ole_e_I家族保守序列 [EQT]-G-x-V-Y-C-D-[TNP]-C R在相同的位置上都具有6個保守的半胱氨酸（圖2）。進一步分析OsOle1的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)該蛋白有推測的豆蔻?；稽cG-{EDRKHPFYW}-X（2）-[STAGCN]-{P}，位于 N 端第 128 位，因此該蛋白容易被豆蔻酰化修飾錨定于質(zhì)膜上。OsOle1在N端第33位具有花粉中特異表達的保守序列[EQT]-G-x-V-Y-C-D-[TNP]-C R。

圖2 部分Ole e 1家族蛋白的保守序列比對分析

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻的表型觀察

2.2.1 掃描電鏡觀察OsOle1超表達株系葉片在營養(yǎng)生長階段，對OVY3的T0代的小苗葉片進行觀察，和野生型葉片比較起來，OVY3株系葉片暗綠，推測葉片的表皮細胞可能發(fā)生改變，進一步對三葉期的OVY3的葉片作了掃描電鏡的觀察，結(jié)果如圖3所示。對野生型和OVY3葉片的近軸面觀察發(fā)現(xiàn)，野生型的葉片表皮細胞的細胞細長，細胞的邊界比較平滑，形狀規(guī)則。與野生型的相比，OVY3葉片近軸面表皮長細胞長度變短（圖3中箭頭所示），且形狀發(fā)生改變，表皮細胞周圍邊界變的不規(guī)則。表皮的短細胞變化不大。推測可能是由于OsOle1的超表達影響葉片進軸面的長細胞發(fā)育。

對野生型和OVY3葉片遠軸面觀察發(fā)現(xiàn)，野生型遠軸面表皮細胞的角質(zhì)層突起比較平滑，細胞形狀比較細長。與野生型相比，OVY3葉片表皮細胞的形狀變的不規(guī)則，角質(zhì)層突起比較粗燥（箭頭表示），每個角質(zhì)層突起邊緣有許多小的突起（圖4下排），這種角質(zhì)突起主要有蠟質(zhì)來組成?？赡苁荗s－Ole1的超表達影響了葉片遠軸面臘質(zhì)層的形成。

3 討 論

3.1 OsOle1與Olee 1在進化上的關(guān)系

在水稻基因組中有45個編碼Olee 1家族蛋白的基因，其中只有一小部分在花粉中特異的表達，而大部分在其它營養(yǎng)組織也有表達，推測水稻中這些基因可能發(fā)揮與Olee 1不同的生物學(xué)功能。

OsOle1主要在花器官中表達，在進化上與玉米的Zm13和百合的LLP-B3蛋白等單子葉植物聚在BII分支中，而與雙子葉的Olee 1家族的蛋白相距較遠。在雙子葉家族A亞家族中有一個番茄花粉中表達的LAT52蛋白，反義表達的LAT52影響花粉的水合和萌發(fā)。由于物種的不同，OsOle1、LAT52和Olee I在不同的進化分支中，三者之間有一定的距離，表明在雙子葉和單子葉在進化上出現(xiàn)分支后，該家族的蛋白為適應(yīng)不同類型花粉的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式而進化成不同的形式，在不同物種中可能發(fā)揮著不同的功能。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，這些蛋白大都有保守的6個半胱氨酸的，兩半胱氨酸之間可以形成二硫鍵，二硫鍵的形成有助于蛋白維持一定的空間構(gòu)象，對其功能的發(fā)揮起重要作用。

3.2 OsOle1與葉表皮細胞發(fā)育的關(guān)系

在OsOle1的過表達植株中觀察到野生型的顏色為淺綠色，而超表達的葉片暗綠色，近軸面和遠軸面表皮細胞形狀也變得不規(guī)則，而且遠軸面表皮細胞的乳狀突起的蠟質(zhì)突起變得不規(guī)則，可能是OsOle1影響了表皮細胞的分化。蠟質(zhì)層是在細胞內(nèi)合成再分泌的胞外裝配而成的，OsOle1很可能影響了蠟質(zhì)層在胞外的裝配過程。除此之外OsOle1的超表達還影響到花粉的萌發(fā)和植株的高度，后續(xù)的研究正在進行中。

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