閻華 楊濱
放射線對Hela細胞TP酶影響的實驗研究
閻華 楊濱
目的 探討X線照射對Hela細胞TP酶的影響,為宮頸腺癌的治療提供新的實驗依據(jù)。方法 宮頸腺癌Hela細胞體外培養(yǎng),經(jīng)2Gy、4Gy、6Gy放射線照射后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天收集細胞,未經(jīng)照射作為對照組,采用ELISA及RT-PCR的方法對照射前后TP酶的表達進行測定。結(jié)果 Hela細胞X線照射后,與對照組相比,2Gy、4Gy、6Gy三個放射組的TP酶蛋白水平均有明顯提高,放射后第3天都升高達高峰,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。放射后Hela細胞TP酶的mRNA表達,在照射后第3天迅速升高達到高峰,明顯高于未經(jīng)照射的對照組(P<0.05)。其升高時間與ELISA測定的TP酶蛋白水平的變化情況基本相吻合。結(jié)論 子宮頸腺癌Hela細胞經(jīng)放射線照射后TP酶蛋白水平和TP酶mRNA表達均得到了提高,為放化療聯(lián)合治療宮頸腺癌提供新的實驗依據(jù)。
胸苷磷酸化酶;卡培他濱;Hela細胞;宮頸腺癌
目前,在臨床上隨著子宮頸癌早期診斷技術(shù)的提高,過去的少見類型宮頸腺癌現(xiàn)在已越來越多地被發(fā)現(xiàn).宮頸腺癌因其生物學(xué)特性不同,常規(guī)的放療及化療效果均不明顯,目前放化療聯(lián)合是針對宮頸癌治療的主要研究方向之一[1-2]。胸苷磷酸化酶(TP)在腫瘤組織中的含量決定著對新一代抗腫瘤藥卡培他濱的敏感性[3],本研究旨在探討X線照射對宮頸腺癌HeLa細胞TP酶的影響,為卡培他濱與放療聯(lián)合治療宮頸腺癌提供實驗依據(jù)。
1.1.1 人子宮頸腺癌Hela細胞的培養(yǎng) Hela細胞株由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院感染科提供用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,置于37℃及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。
1.1.2 實驗分組及X射線照射(瓦里安直線加速器2300C/D-SN293美國)選用處于對數(shù)生長期,狀態(tài)良好的培養(yǎng)瓶內(nèi)的Hela細胞進行實驗,按X線照射的不同劑量分成對照組(未照射)、2Gy、4Gy、6Gy放射組。照射前1天更換培養(yǎng)液,放射組的X線照射劑量率為300cGy/min,源皮距100cm,照射后將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
1.2 ELISA測定放射線照射前后Hela細胞TP酶蛋白含量
分別于照射前1天(第0天),照射后第1天,第3天,第5天,第7天,第9天收集細胞,加入PBS,在20℃條件下,進行1000r/min離心30min,離心2次,進一步超聲裂解培養(yǎng)細胞,以13000r/min,20℃離心5min,收集上清液,考馬司亮藍法測總蛋白濃度,ELISA試劑盒(德國羅氏公司)測定Hela細胞照射前后TP酶蛋白含量,嚴格按照說明書操作,TP酶蛋白含量用每毫克總蛋白中的含量表示(ng/mg protein)。
1.3 TP mRNA表達的檢測 Hela細胞放射線照射前后應(yīng)用RT-PCR檢測TP mRNA的表達。
1.3.1 提取細胞 RNA收集照射前1天(第0天),照射后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天的細胞,加入 Trizol 細胞裂解液按Trinzol試劑說明提取RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄,PCR引物見表1,β-actin作為內(nèi)參照,PCR擴增TP。
1.3.2 PCR擴增產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物進行2%DNA瓊脂糖凝膠電泳用凝聚膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行灰度掃描,以β-actin為內(nèi)參照行半定量分析,并計算TP/β-actin,從而得出兩種酶相對含量。每個樣本重復(fù)上述步驟3次。結(jié)果以±s表示。
表1 RT-PCR引物primer
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理
實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理對照組與放射組之間差異采用t檢驗P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 放射后Hela細胞TP酶蛋白含量的ELISA測定
見表2。由表2可見,與對照組相比,Hela細胞被放射后,三個放射組的TP酶蛋白水平均有明顯提高,放射后第3天都升高達高峰,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),以后逐漸下降,從放射劑量上看,2Gy、4Gy放射組TP酶蛋白水平升高程度,較6Gy放射組升高有更加明顯的趨勢,尤其放射后第3天兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2Gy放射組TP酶處于高水平的持續(xù)時間更長,超過9天,第9天的TP酶蛋白水平差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2.2 RT-PCR半定量測定放射后Hela細胞TP酶mRNA表達
如圖1、表3所示。放射后Hela細胞TP酶的mRNA表達,在照射后第3天迅速升高達到高峰,明顯高于未經(jīng)照射的對照組(P<0.05)。
以后出現(xiàn)逐漸下降的趨勢。其升高時間與ELISA測定的TP酶蛋白水平的變化情況基本相吻合。
胸腺嘧啶核苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase,TP)在人體多種實性惡性腫瘤組織中水平較高[4],癌組織中TP的含量和其生物學(xué)特性有密切關(guān)系,TP酶含量高往往提示腫瘤生長較快,惡性度較高[5]。另一方面TP是卡培他濱代謝相關(guān)酶,該類藥物最終在腫瘤組織中通過TP酶作用轉(zhuǎn)化為5-FU發(fā)揮抗腫瘤療效,它對腫瘤的高度選擇性和特異性,使抗腫瘤作用增強,而毒副作用大大減少,其抗腫瘤療效與腫瘤組織中TP酶的含量密切相關(guān),一些提高腫瘤組織TP的方法包括通過放射線照射[6-7]。有文獻報道[8],在WiDR、HT-29、MN-45、MX-1、SIHA細胞的動物移植模型中,在分別給予2.5Gy、5Gy放射后TP蛋白出現(xiàn)了升高。
表2 Hela細胞TP酶蛋白含量的ELISA測定結(jié)果
表3 放射線照射對HeLa細胞TPmRNA相對含量(TP/β-actin的灰度比值)的影響
圖1 放射線照射后Hela細胞TPmRNA電泳圖
本研究通過放射線照射來觀察Hela細胞TP蛋白含量及其mRNA表達的變化,實驗結(jié)果表明,在放射線照射后二者均得到了提高,ELISA測定中TP蛋白含量在放射后第3天升高的較顯著,達到高峰,明顯高于未經(jīng)照射的對照組,以后逐漸下降,在放射劑量與TP之間無明顯的量效依賴關(guān)系,本實驗中4Gy照射組比2Gy和6Gy組升高更顯著,6Gy組升高較比另兩個照射組幅度低,可能與射線劑量增加對細胞產(chǎn)生一定的殺傷作用有關(guān),2Gy照射組下降的較緩慢,TPmRNA的表達與TP的ELISA測定結(jié)果基本一致,說明TP蛋白與它的基因表達間存在相關(guān)性,放射線照射是在基因水平上使TP蛋白增加。在X線照射后TP酶升高的機制尚不清楚,研究表明[9],在應(yīng)用增加卡培他濱療效的藥物或放射線后,細胞因子特別是TNF-alpha 的水平先于TP升高,這提示這些藥物及放射線上調(diào)TP的主要機制是通過上調(diào)多種細胞因子主要是TNF-alpha 而使TP的表達增高。本實驗的結(jié)果提示,放射線可能會提高宮頸腺癌組織TP的表達,進而提高抗腫瘤療效。5-FU前體類藥物與放射線聯(lián)合治療宮頸腺癌的方案,值得期待。
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Objective To investigate the infl uence of X-ray irradiation on the thymidine phosphorylase(TP) on HeLa cell,according to the combination therapy with capecitabine(CAP) and X-ray irradiation on cervical adenocarcinoma. Methods HeLa cells were treated with X-ray at different dosage (0Gy,2Gy,4Gy,6Gy) in vitro,the control group was 0 Gy group and were collected on day 1 day 3 day 5day 7day 9. the expression of TP protein was deteceted by the ELISA and TPmRNA were measured by the RT-PCR. Results Expression of TP protein increased by X-ray irradiation were maximally increased on day3 as compared with that in the control group was obviously different from control group(P<0.01)TPmRNA level maximally increased by X-ray irradiation on as compared with that in the control group was signifi cantly different from control group(P<0.05)TPmRNA increased in concordance with the change of TP protein. Conclusion The expression of TP protein and TPmRNA X-ray irradiation were maximally increased.It is expected therapy combinating capecitabine(CAP) with X-ray irradiation in cervical adenocarcinoma.
Thymidine phosphorylase; Capecitabine; HeLa cell; Cervical adenocarcinoma
10.3969/j.issn.1009-4393.2011.23.024
110031 遼寧省計劃生育科學(xué)研究院附屬醫(yī)院(閻華 楊濱)