閻華 楊濱

放射線對Hela細胞TP酶影響的實驗研究

閻華 楊濱

目的 探討X線照射對Hela細胞TP酶的影響，為宮頸腺癌的治療提供新的實驗依據(jù)。方法 宮頸腺癌Hela細胞體外培養(yǎng)，經(jīng)2Gy、4Gy、6Gy放射線照射后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天收集細胞，未經(jīng)照射作為對照組，采用ELISA及RT-PCR的方法對照射前后TP酶的表達進行測定。結(jié)果 Hela細胞X線照射后，與對照組相比，2Gy、4Gy、6Gy三個放射組的TP酶蛋白水平均有明顯提高，放射后第3天都升高達高峰，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)。放射后Hela細胞TP酶的mRNA表達，在照射后第3天迅速升高達到高峰，明顯高于未經(jīng)照射的對照組（P＜0.05）。其升高時間與ELISA測定的TP酶蛋白水平的變化情況基本相吻合。結(jié)論 子宮頸腺癌Hela細胞經(jīng)放射線照射后TP酶蛋白水平和TP酶mRNA表達均得到了提高，為放化療聯(lián)合治療宮頸腺癌提供新的實驗依據(jù)。

胸苷磷酸化酶；卡培他濱；Hela細胞；宮頸腺癌

目前，在臨床上隨著子宮頸癌早期診斷技術(shù)的提高，過去的少見類型宮頸腺癌現(xiàn)在已越來越多地被發(fā)現(xiàn).宮頸腺癌因其生物學(xué)特性不同，常規(guī)的放療及化療效果均不明顯，目前放化療聯(lián)合是針對宮頸癌治療的主要研究方向之一[1-2]。胸苷磷酸化酶（TP）在腫瘤組織中的含量決定著對新一代抗腫瘤藥卡培他濱的敏感性[3]，本研究旨在探討X線照射對宮頸腺癌HeLa細胞TP酶的影響，為卡培他濱與放療聯(lián)合治療宮頸腺癌提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1.1 人子宮頸腺癌Hela細胞的培養(yǎng) Hela細胞株由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院感染科提供用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，置于37℃及飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.1.2 實驗分組及X射線照射（瓦里安直線加速器2300C/D-SN293美國）選用處于對數(shù)生長期，狀態(tài)良好的培養(yǎng)瓶內(nèi)的Hela細胞進行實驗，按X線照射的不同劑量分成對照組（未照射）、2Gy、4Gy、6Gy放射組。照射前1天更換培養(yǎng)液，放射組的X線照射劑量率為300cGy/min，源皮距100cm，照射后將培養(yǎng)瓶置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 ELISA測定放射線照射前后Hela細胞TP酶蛋白含量

分別于照射前1天（第0天），照射后第1天，第3天，第5天，第7天，第9天收集細胞，加入PBS，在20℃條件下，進行1000r/min離心30min，離心2次，進一步超聲裂解培養(yǎng)細胞，以13000r/min，20℃離心5min，收集上清液，考馬司亮藍法測總蛋白濃度，ELISA試劑盒（德國羅氏公司）測定Hela細胞照射前后TP酶蛋白含量，嚴格按照說明書操作，TP酶蛋白含量用每毫克總蛋白中的含量表示（ng/mg protein）。

1.3 TP mRNA表達的檢測 Hela細胞放射線照射前后應(yīng)用RT-PCR檢測TP mRNA的表達。

1.3.1 提取細胞 RNA收集照射前1天（第0天），照射后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天的細胞，加入 Trizol 細胞裂解液按Trinzol試劑說明提取RNA，進行逆轉(zhuǎn)錄，PCR引物見表1，β-actin作為內(nèi)參照，PCR擴增TP。

1.3.2 PCR擴增產(chǎn)物分析 PCR產(chǎn)物進行2%DNA瓊脂糖凝膠電泳用凝聚膠成像分析系統(tǒng)對電泳條帶進行灰度掃描，以β-actin為內(nèi)參照行半定量分析，并計算TP/β-actin，從而得出兩種酶相對含量。每個樣本重復(fù)上述步驟3次。結(jié)果以±s表示。

表1 RT-PCR引物primer

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理對照組與放射組之間差異采用t檢驗P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 放射后Hela細胞TP酶蛋白含量的ELISA測定

見表2。由表2可見，與對照組相比，Hela細胞被放射后，三個放射組的TP酶蛋白水平均有明顯提高，放射后第3天都升高達高峰，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01)，以后逐漸下降，從放射劑量上看，2Gy、4Gy放射組TP酶蛋白水平升高程度，較6Gy放射組升高有更加明顯的趨勢，尤其放射后第3天兩者的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。2Gy放射組TP酶處于高水平的持續(xù)時間更長，超過9天，第9天的TP酶蛋白水平差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05)。

2.2 RT-PCR半定量測定放射后Hela細胞TP酶mRNA表達

如圖1、表3所示。放射后Hela細胞TP酶的mRNA表達，在照射后第3天迅速升高達到高峰，明顯高于未經(jīng)照射的對照組（P＜0.05）。

以后出現(xiàn)逐漸下降的趨勢。其升高時間與ELISA測定的TP酶蛋白水平的變化情況基本相吻合。

3 討論

胸腺嘧啶核苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）在人體多種實性惡性腫瘤組織中水平較高[4]，癌組織中TP的含量和其生物學(xué)特性有密切關(guān)系，TP酶含量高往往提示腫瘤生長較快，惡性度較高[5]。另一方面TP是卡培他濱代謝相關(guān)酶，該類藥物最終在腫瘤組織中通過TP酶作用轉(zhuǎn)化為5-FU發(fā)揮抗腫瘤療效，它對腫瘤的高度選擇性和特異性，使抗腫瘤作用增強，而毒副作用大大減少，其抗腫瘤療效與腫瘤組織中TP酶的含量密切相關(guān)，一些提高腫瘤組織TP的方法包括通過放射線照射[6-7]。有文獻報道[8]，在WiDR、HT-29、MN-45、MX-1、SIHA細胞的動物移植模型中，在分別給予2.5Gy、5Gy放射后TP蛋白出現(xiàn)了升高。

表2 Hela細胞TP酶蛋白含量的ELISA測定結(jié)果

表3 放射線照射對HeLa細胞TPmRNA相對含量（TP/β-actin的灰度比值）的影響

圖1 放射線照射后Hela細胞TPmRNA電泳圖

本研究通過放射線照射來觀察Hela細胞TP蛋白含量及其mRNA表達的變化，實驗結(jié)果表明，在放射線照射后二者均得到了提高，ELISA測定中TP蛋白含量在放射后第3天升高的較顯著，達到高峰，明顯高于未經(jīng)照射的對照組，以后逐漸下降，在放射劑量與TP之間無明顯的量效依賴關(guān)系，本實驗中4Gy照射組比2Gy和6Gy組升高更顯著，6Gy組升高較比另兩個照射組幅度低，可能與射線劑量增加對細胞產(chǎn)生一定的殺傷作用有關(guān)，2Gy照射組下降的較緩慢，TPmRNA的表達與TP的ELISA測定結(jié)果基本一致，說明TP蛋白與它的基因表達間存在相關(guān)性，放射線照射是在基因水平上使TP蛋白增加。在X線照射后TP酶升高的機制尚不清楚，研究表明[9]，在應(yīng)用增加卡培他濱療效的藥物或放射線后，細胞因子特別是TNF-alpha 的水平先于TP升高，這提示這些藥物及放射線上調(diào)TP的主要機制是通過上調(diào)多種細胞因子主要是TNF-alpha 而使TP的表達增高。本實驗的結(jié)果提示，放射線可能會提高宮頸腺癌組織TP的表達，進而提高抗腫瘤療效。5-FU前體類藥物與放射線聯(lián)合治療宮頸腺癌的方案，值得期待。

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Objective To investigate the infl uence of X-ray irradiation on the thymidine phosphorylase(TP) on HeLa cell，according to the combination therapy with capecitabine(CAP) and X-ray irradiation on cervical adenocarcinoma. Methods HeLa cells were treated with X-ray at different dosage (0Gy,2Gy,4Gy,6Gy) in vitro，the control group was 0 Gy group and were collected on day 1 day 3 day 5day 7day 9. the expression of TP protein was deteceted by the ELISA and TPmRNA were measured by the RT-PCR. Results Expression of TP protein increased by X-ray irradiation were maximally increased on day3 as compared with that in the control group was obviously different from control group（P＜0.01）TPmRNA level maximally increased by X-ray irradiation on as compared with that in the control group was signifi cantly different from control group(P＜0.05)TPmRNA increased in concordance with the change of TP protein. Conclusion The expression of TP protein and TPmRNA X-ray irradiation were maximally increased.It is expected therapy combinating capecitabine(CAP) with X-ray irradiation in cervical adenocarcinoma.

Thymidine phosphorylase; Capecitabine; HeLa cell; Cervical adenocarcinoma

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.23.024

110031 遼寧省計劃生育科學(xué)研究院附屬醫(yī)院（閻華 楊濱）