華彩紅 申素芳

人胎羊膜對大鼠皮膚切創(chuàng)愈合中相關(guān)因素的研究

華彩紅 申素芳

目的 觀察人胎羊膜對大鼠皮膚切創(chuàng)愈合過程中感染率的影響及VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)、TGF-β(轉(zhuǎn)化生長因子β)表達(dá)的研究,探討其促進(jìn)皮膚愈合及減少瘢痕形成的機(jī)制。方法 將40只雄性大鼠隨機(jī)分成2組:每組20只,分為對照組與羊膜組。腹腔麻醉后,在背中線旁約1cm處做約4cm長的縱行切口,深達(dá)肌層,止血后間斷縫合皮膚及皮下組織,對照組用紗布覆蓋切口并包扎;羊膜組將處理過的羊膜直接貼敷在切口表面,紗布覆蓋包扎。大鼠分籠飼養(yǎng),給予消毒飼料及雙蒸水,于切創(chuàng)后2、3、5、7d將大鼠脫頸椎處死,取切口處1.5cm×1.0cm皮膚組織,放入4%多聚甲醛中固定12h。固定后石蠟包埋,連續(xù)5 m厚度切片,免疫組化分析VEGF、TGF-β的表達(dá)。結(jié)果 (1)2d及3d組TGF-β創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組TGF-β在創(chuàng)口邊緣表達(dá)較對照組減少P＜0.05。5d及7d組TGF-β表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組無明顯區(qū)別。(2)羊膜組感染率(25%),較對照組感染率(50%)減少。(3)VEGF創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組與對照組比較P＞0.05無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 (1)羊膜貼附創(chuàng)口能減少TGF-β的表達(dá)但對VEGF創(chuàng)口邊緣表達(dá)無影響。(2)羊膜貼附創(chuàng)口能減少創(chuàng)口的感染率。

人胎羊膜;皮膚切創(chuàng);TGF-β;VEGF

人胎羊膜屬胎盤的一部分,外用具有防御功能,可阻止細(xì)菌入侵,而且羊膜抗原性非常小,故免疫排斥反應(yīng)極低。鑒于此,本研究觀察將胎膜貼敷創(chuàng)口后對創(chuàng)口感染率及VEGF、TGF-β的影響,為實(shí)現(xiàn)對瘢痕愈合的干預(yù)和治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人胎羊膜的制備和保存 新鮮羊膜取自健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦的胎盤,產(chǎn)前查術(shù)前體檢無異常,選擇無胎膜早破、無胎糞污染的胎盤,從中鈍性分離出羊膜,無菌生理鹽水反復(fù)沖洗去除血塊,自羊膜與絨毛膜間的潛在空隙鈍性剝離羊膜,獲得羊膜層,再用無菌生理鹽水漂洗成白色(肉眼不見血絲)后置于無菌手術(shù)盤中,剪成6cm×3cm小塊,然后將羊膜放入質(zhì)量比為1‰的洗必泰中浸泡消毒10h,再用無菌生理鹽水沖洗。

1.1.2 大鼠切創(chuàng)損傷模型的建立及取材 將40只雄性大鼠隨機(jī)分成2組:每組20只,分為對照組與羊膜組。兩組又分2、3、5、7d組,5%水合氯醛0.5～0.7ml/kg腹腔麻醉。消毒鋪巾后在背中線旁約1cm處做長約4cm縱行切口,深達(dá)肌層,止血后間斷縫合皮膚及皮下組織,對照組用紗布覆蓋切口并包扎,羊膜組將處理過的羊膜(胎兒面)貼敷在切口表面,紗布覆蓋并包扎。處理后大鼠指甲剪短,強(qiáng)力膠布粘裹住四爪,分籠飼養(yǎng),給予消毒飼料及雙蒸水,3d后換藥,不換羊膜敷料,分別于切創(chuàng)后2、3、5、7d將大鼠脫頸椎處死,取切口處1.5cm×1.0cm皮膚組織,取材后均放入4%多聚甲醛中固定, 12h后石蠟包埋。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化染色檢測TGF-β及VEGF的表達(dá)。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理

免疫組化發(fā)現(xiàn)：VEGF及TGF-β陽性顆粒主要位于表皮細(xì)胞胞漿中,VEGF部分真皮微血管染色陽性,每組5張切片,每張切片隨機(jī)取10個高倍視野(×400),計數(shù)視野中的陽性細(xì)胞的積分光密度,計算得出各組平均每個高倍視野的積分光密度,以±s表示。結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件作單因素方差分析。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,P＞0.05為差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 腹部切口感染診斷標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)國家衛(wèi)生部醫(yī)改司醫(yī)院感染監(jiān)測小組制定的醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)[1],由外科手術(shù)引起的皮膚破損稱切口,當(dāng)切口部位存在或流出膿性分泌物或示有蜂窩組織炎的紅斑區(qū),有疼痛或壓痛,水腫明顯,及紅斑區(qū)擴(kuò)大,均應(yīng)列為切口感染。本試驗(yàn)以明顯紅腫或有滲液或有膿性分泌物為切口感染的主要診斷依據(jù),結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件作x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β的表達(dá)

TGF-β于造創(chuàng)后3h在表皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)增強(qiáng),持續(xù)至傷后7d,48h達(dá)峰值,故本實(shí)驗(yàn)以2、3、5、7d為取材時間。結(jié)果如下:

2d組及3d組TGF-β創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組TGF-β在創(chuàng)口邊緣表達(dá)較對照組減少P＜0.05。5d及7d組TGF-β表達(dá)實(shí)驗(yàn)組及對照組無明顯區(qū)別,P＞0.05。見表1。

表1 兩組大鼠皮膚切創(chuàng)2、3、5、7d的TGF-β表達(dá)結(jié)果(±s,n=5)

表1 兩組大鼠皮膚切創(chuàng)2、3、5、7d的TGF-β表達(dá)結(jié)果(±s,n=5)

天數(shù) 組別 切創(chuàng)例數(shù) 積分光密度2對照組 5 0.657±0.061 2羊膜組 5 0.476±0.035 3對照組 5 0.616±0.034 3羊膜組 5 0.446±0.030 5對照組 5 0.154±0.011 5羊膜組 5 0.159±0.015 7對照組 5 0.151±0.011 7羊膜組 5 0.152±0.01

2.2 感染情況

羊膜組感染率(25%)較對照組感染率減少,P＜0.05。見表2。

表2 兩組大鼠切口感染率的比較

2.3 VEGF表達(dá)情況

VEGF創(chuàng)口邊緣表達(dá)：羊膜組與對照組比較P＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義。

本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),切創(chuàng)肌肉中VEGF 3d開始表達(dá)并逐漸增強(qiáng),但對照組與實(shí)驗(yàn)組無統(tǒng)計學(xué)差異,說明羊膜外敷創(chuàng)口僅對創(chuàng)口表層有影響,對創(chuàng)口深層無影響。

3 討論

TGF-β是公認(rèn)的促纖維化細(xì)胞因子,是纖維化的代表性因子,Whitby等[2]發(fā)現(xiàn)胎兒傷口的無瘢痕愈合與TGF-β的缺乏有關(guān),成年動物傷口愈合過程中,血小板的a顆粒是早期傷口中TGF-β的主要來源[3],而胎兒傷口無瘢痕愈合中胎兒血小板a顆粒中TGF-β含量較少,受傷后胎兒血小板在傷口中聚集也較少[4],使早期胎兒傷口中TGF-β水平較低,而低TGF-β水平又使傷口中缺乏或極少巨噬細(xì)胞浸潤,進(jìn)一步減少TGF-β在傷口局部出現(xiàn)的機(jī)會,TGF-β水平的相對缺乏可能是胎兒傷口無瘢痕愈合的重要原因。TGF-β的存在是成年動物傷口愈合所必需的,但其過度的作用會導(dǎo)致組織損傷,加重瘢痕形成,因此應(yīng)用對抗TGF-β的療法可能會減少瘢痕形成和治療成年動物的纖維性疾病。Shah等[5]在成年鼠的傷口中應(yīng)用TGF-β多克隆中和抗體減少TGF-β水平以模仿胎兒的傷口環(huán)境,通過這種處理后成年鼠傷口中疤痕明顯減少,與沒有處理的傷口比較,處理的傷口張力正常,在組織學(xué)上接近于正常結(jié)構(gòu)。但由于抗體存在抗原性的問題,激素類抑制免疫反應(yīng)增加感染機(jī)會等副作用使這些藥物臨床上應(yīng)用受限,如何使用安全有效的方法減少傷口中TGF-β含量尚未見報導(dǎo)。

VEGF是一種功能強(qiáng)大并能產(chǎn)生多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,是對血管有高度特異性的生長因子,對血管再生起著關(guān)鍵的作用[6]。VEGF局部應(yīng)用可使創(chuàng)面上皮化的時間比未使用VEGF的創(chuàng)面提前1d完成,但持續(xù)應(yīng)用則過度瘢痕形成。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),切創(chuàng)肌肉中VEGF 3d開始表達(dá)并逐漸增強(qiáng),但對照組與實(shí)驗(yàn)組無統(tǒng)計學(xué)差異,說明羊膜外敷創(chuàng)口僅對創(chuàng)口表層有影響,對創(chuàng)口深層無影響。

羊膜是人體中最厚的基底膜,羊膜可以產(chǎn)生多種生長因子,增強(qiáng)了上皮細(xì)胞的粘附,并具有抗炎、抗纖維化、抗新生血管作用、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡及抗病原微生物等功能[7]。羊膜具有以下特征:容易獲得,制備簡單,容易滿足要求：具有一定的韌性,容易展開,貼于切口表面,能阻止細(xì)菌等微生物穿過而防止感染;為網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu),可允許小分子物質(zhì)通過,相當(dāng)于存活組織;免疫排斥反應(yīng)極低,既不會出現(xiàn)異體皮而引起感染[8],又避免了由此而引起的自體皮不長,推遲創(chuàng)面愈合[9];羊膜含有生物源性刺激素,可促進(jìn)肉芽組織及上皮生長,加速創(chuàng)面愈合[10];刺激上皮細(xì)胞分化,通過抗蛋白酶的活性,清除炎癥細(xì)胞。

成年人及動物皮膚的切口愈合過程即為瘢痕形成的過程。在臨床工作中,應(yīng)用TGF-β促進(jìn)傷口愈合的方法會導(dǎo)致傷口局部的膠原合成增加,導(dǎo)致瘢痕增生。而使用瘢痕減少的治療方法(如糖皮質(zhì)激素,細(xì)胞毒因子等)則可導(dǎo)致傷口愈合的延遲。迄今為止,試圖在促進(jìn)傷口愈合的同時又減少瘢痕或無瘢痕形成仍是一個有待研究的困難問題。

成年人傷口愈合均以瘢痕形成作為結(jié)束,根據(jù)身體條件的不同,有時有過度瘢痕形成,有時會出現(xiàn)傷口愈合延遲,有時則表現(xiàn)為瘢痕增生。促進(jìn)傷口愈合和減少瘢痕形成是很多研究人員所希望達(dá)到的目的,但兩者之間存在矛盾。

TGF-β使傷口中膠原含量增加促進(jìn)傷口愈合,但這正是瘢痕形成的重要原因之一,而防止瘢痕過度產(chǎn)生的治療方法如局部應(yīng)用免疫抑制劑等減少TGF-β表達(dá)會使傷口愈合延遲,增加感染機(jī)會。減少感染機(jī)會并減少TGF-β含量是我們課題研究目的之一。本研究發(fā)現(xiàn)羊膜貼附創(chuàng)口能減少纖維化的代表因子TGF-β的表達(dá);能減少創(chuàng)口的感染率,促進(jìn)創(chuàng)口的愈合。羊膜不僅安全,而且價格低廉,為臨床研究提供了很好的理論基礎(chǔ)及方向。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2011.18.020

河南省科技廳資助項(xiàng)目 (082102310084)

453100 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 (華彩紅) 456700新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 (申素芳)