王 洪,趙 明,邵東華

(江蘇大學(xué):1.附屬人民醫(yī)院麻醉科,鎮(zhèn)江 212002;2.附屬醫(yī)院麻醉科,鎮(zhèn)江 212001)

米屈肼對大鼠肺缺血再灌注后Bax、Bcl-2及caspase 3表達的影響

王 洪1,趙 明2,邵東華1

(江蘇大學(xué):1.附屬人民醫(yī)院麻醉科,鎮(zhèn)江 212002;2.附屬醫(yī)院麻醉科,鎮(zhèn)江 212001)

目的觀察米屈肼對大鼠肺缺血再灌注損傷(LIRI)后Bax、Bcl-2及半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶3(caspase 3)表達的影響。方法將36只SD大鼠隨機分為3組:假手術(shù)組(A組)、缺血再灌注組(B組)、米屈肼預(yù)處理組(C組),每組 12只。分別于再灌注后60、120 min觀察肺組織病理形態(tài)變化,并用免疫組織化學(xué)方法檢測肺組織Bax、Bcl-2及caspase 3表達變化。結(jié)果B組和C組肺組織損傷進行性加重,但 B組較 C組更為嚴(yán)重(P＜0.05);缺血再灌注后肺組織 Bax、caspase 3蛋白表達明顯增加(P＜0.05),米屈肼可以明顯降低二者的表達(P＜0.05);缺血再灌注后肺組織Bcl-2蛋白表達明顯增加(P＜0.05),米屈肼可以提高Bcl-2蛋白表達,與A、B組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論米屈肼對于大鼠LIRI具有一定的保護作用,其作用機制可能與降低Bax蛋白及caspase 3蛋白表達和增強Bcl-2蛋白表達有關(guān)。

再灌注損傷;原癌基因蛋白質(zhì)c-bcl-2;bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì);半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶3;米屈肼

缺血再灌注損傷已經(jīng)成為肺移植術(shù)后高死亡率的主要原因之一[1]。目前認為肺缺血再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)可能與氧化損傷、鈣超載、中性粒細胞引起的過度炎癥反應(yīng)及細胞凋亡等有關(guān)[2]。因此,積極探索LIRI的分子機制并提出新的有效防治措施具有重要的醫(yī)學(xué)價值和臨床意義[3]。線粒體是細胞缺血、缺氧損害的核心靶細胞器,其損害是缺血再灌注損傷最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[4]。米屈肼可作用于線粒體,在細胞水平改善能量代謝,但米屈肼在LIRI中的保護作用國內(nèi)外尚少見報道,本文通過研究米屈肼對LIRI大鼠肺組織Bax、Bcl-2及半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶 3(caspase 3)表達的影響,以探討其是否具有LIRI保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠36只,體質(zhì)量 250～300 g,由江蘇大學(xué)實驗動物中心提供;米屈肼購于南京凱基生物有限公司;兔抗鼠Bax、Bcl-2及caspase 3多克隆抗體購于南京生興生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法 將36只大鼠隨機分為3組,每組12只,每組分T1、T2兩個時間點,每時間點6只。(1)假手術(shù)組(A組):生理鹽水(6 mL·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃6 d,開胸游離右肺門,不進行夾閉阻斷。(2)缺血再灌注組(B組):生理鹽水(6 mL·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃6 d,開胸游離右肺門,夾閉阻斷45 min,繼行再灌注 120 min。(3)米屈肼預(yù)處理組(C組):米屈肼(60 mg·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃 6 d,開胸游離右肺門,夾閉阻斷45 min,繼行再灌注120 min[5]。按照參考文獻[6-8]建立缺血再灌注模型。B、C組分別于缺血再灌注后 60 min(T1)、120 min(T2)時處死動物,留取標(biāo)本(右肺組織),A組于同時間點留取標(biāo)本。

1.3 病理檢查 取右肺組織約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小,經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察,攝片。

1.4 免疫組織化學(xué)檢測 采用SABC法檢測肺組織Bax、Bcl-2及caspase 3表達變化。顯微鏡下(×400)觀察。陽性細胞為胞質(zhì)呈棕褐色,每張切片取5個不重復(fù)區(qū)域,每個區(qū)域計數(shù)100個細胞,并計算出其中的陽性細胞數(shù),既每100個細胞中的陽性細胞數(shù),取平均值,作為該時間點的陽性細胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料以±s表示,組內(nèi)比較用配對t檢驗,多組間比較用單因素方差分析,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病理組織學(xué)改變 A組大鼠無明顯肺充血,隨時間延長,僅見少量炎性細胞;B組大鼠肺組織損傷進行性加重,毛細血管充血、肺泡間隔炎性細胞浸潤明顯,肺泡腔內(nèi)大量炎性細胞滲出、出血及炎性滲液積聚;而C組大鼠除肺泡間隔炎性細胞浸潤有所增多外,肺泡腔內(nèi)僅有少量紅細胞及炎性細胞,未見炎性滲液和出血,見封2圖1。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果 缺血再灌注后肺組織Bax、caspase 3蛋白表達明顯增加(P＜0.05),米屈肼可以明顯降低二者的表達(P＜0.05),見表 1、2;缺血再灌注后肺組織Bcl-2蛋白表達也明顯增加(P＜0.05),米屈肼可以提高Bcl-2蛋白表達,與A、B組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),見表3。

表1 肺組織Bax陽性細胞數(shù)( ±s,個,n=6)

表1 肺組織Bax陽性細胞數(shù)( ±s,個,n=6)

△:P＜0.05,與同時間點A組比較;★:P＜0.05,與同時間點B組比較;●:P＜0.05,與T2比較。

時間點 A組 B組 C組T1 3.17±1.17 8.83±1.72△● 6.17±1.17△★T2 4.33±1.75 13.17±2.71△ 7.67±1.86△★

表2 肺組織caspase 3陽性細胞數(shù)( ±s,個,n=6)

表2 肺組織caspase 3陽性細胞數(shù)( ±s,個,n=6)

△:P＜0.05,與同時間點A組比較;★:P＜0.05,與同時間點B組比較;●:P＜0.05,與T2比較。

時間點 A組 B組 C組T1 12.00±1.41 24.17±3.54△● 17.50±2.43△★●T2 14.17±2.48 31.67±3.67△ 23.17±2.32△★

表3 肺組織Bcl-2陽性細胞數(shù)( ±s,個,n=6)

表3 肺組織Bcl-2陽性細胞數(shù)( ±s,個,n=6)

△:P＜0.05,與同時間點A組比較;★:P＜0.05,與同時間點B組比較;●:P＜0.05,與T2比較。

時間點 A組 B組 C組T1 4.00±1.41 5.00±0.63● 9.17±2.14△★●T2 5.33±1.21 8.17±0.75△ 25.17±1.17△★

3 討 論

缺血再灌注損傷是指缺血的組織細胞在恢復(fù)血液灌注后不能恢復(fù)正常代謝機能,損傷程度反而加重的過程[7]。目前認為,LIRI的發(fā)病機制主要包括氧自由基損傷、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、中性粒細胞大量浸潤以及細胞凋亡等[8]。蘇南湘和祖雄兵[9]研究表明,繼發(fā)于缺血再灌注損傷的凋亡細胞數(shù)量與肺損傷的程度呈顯著正相關(guān),且抑制肺移植后的細胞凋亡有利于肺功能的保護[10-12],提示凋亡是LIRI的一個重要事件。本文從細胞水平探討了米屈肼對大鼠LIRI的保護作用以及可能的分子機制。

體內(nèi)存在多條細胞凋亡的信號途徑,其中“線粒體途徑”是最重要的途徑之一[13]。Bcl-2和Bax蛋白是該家族的兩個主要成員,Bcl-2蛋白主要定位于線粒體外膜,起抗凋亡的作用;而具有促凋亡作用的Bax蛋白則主要定位于細胞質(zhì),當(dāng)細胞受到凋亡因子的誘導(dǎo),便向線粒體轉(zhuǎn)位。Bcl-2和Bax相互競爭,間接調(diào)節(jié)蛋白酶和核酸酶活性,從而雙相調(diào)節(jié)細胞凋亡[14-15]。本實驗結(jié)果顯示,缺血再灌注后不同時間點肺組織Bax和Bcl-2蛋白表達均明顯增加,提示二者均參與了缺血再灌注后肺細胞凋亡的過程。

caspase家族在凋亡中起主要作用,其中caspase 3是參與凋亡的caspase級鏈反應(yīng)最終效應(yīng)子[16]。本實驗結(jié)果顯示,缺血再灌注后不同時間點肺組織caspase 3蛋白表達明顯增加,提示caspase 3也參與了缺血再灌注后肺細胞凋亡的過程。

米屈肼是肉毒堿的結(jié)構(gòu)類似物,能競爭抑制丁酸甜菜堿羥化酶,從而抑制肉毒堿的生物合成,直接抑制肉毒堿依賴的脂肪酸在線粒體的轉(zhuǎn)運,在細胞水平改善能量代謝[17]。本實驗結(jié)果顯示,米屈肼可以降低Bax、caspase 3蛋白表達,而升高Bcl-2蛋白表達,提示米屈肼可能通過抑制Bax蛋白及caspase 3蛋白表達同時增加抑凋亡基因Bcl-2的表達,從而抑制大鼠肺缺血再灌注期間肺組織細胞凋亡的發(fā)生。

[1]崔社懷,肺泡Ⅱ型上皮細胞在肺移植中的作用及其進展[J].重慶醫(yī)學(xué),2003,32(7):836.

[2]張松林,黃杰,涂仲凡.大鼠在體肺低溫缺血再灌注損傷模型的建立[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2003,13(19):12-14.

[3]周中新,賈曉民,黃繼江,等.肺缺血再灌注損傷時絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)活性的變化及意義[J].重慶醫(yī)學(xué),2006,35(13):1189

[4]鄺勇,黃躍生.線粒體缺氧損害機制研究進展[J].中國醫(yī)師雜志,2006,8(2):286.

[5]Yoshisue K,Yamamoto Y,Yoshida K,et al.Pharmacokinetics and biological fate of 3-(2,2,2-trimethylhydrazinium)propionate dihydrate(MET-88),a novel cardioprotective agent,in rats[J].Drug Metab Dispos,2000,28(6):687-693.

[6]李建強,井軍虎,趙卉,等.膽紅素對大鼠肺臟缺血再灌注損傷保護作用的研究[J].中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,2008,27(3):284.

[7]Eppinger M J,Ward PA,Jones M L,et al.Disparate effects of nitric oxide on lung ischemia reperfusion injury[J].Ann Thorac Surg,1995,60(5):1169-1175.

[8]Sekido N,Mukaida N,Harada A,et al.Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against interleukin-8[J].Nature,1993,365(6447):654-657.

[9]蘇南湘,祖雄兵.黃芪對腎缺血再灌注損傷保護作用機制研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2004,14(8):142-147.

[10]王曉楊.肺缺血再灌注損傷中細胞因子的作用[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐,2005,18(3):251-253.

[11]Omasa M,Fukuse T,Toyokuni S,et al.Glycine ameliorates lung reperfusion injury after cold preservation in an ex vivo rat lung model[J].Transplantation,2003,75(5):591-598.

[12]Cooke DT,Hoyt EG,Robbin RC.Overexpression of human Bcl-2 in syngeneic rat donor lungs preserves posttransplant function and reduces intragraft caspase activity and interleukin-1 beta production[J].Transplantation,2005,79(7):762-767.

[13]Mattson M P,Kroemer G.Mitochondria in cell death:novel targets for neuroprotection and cardioprotection[J].Trends Mol Med,2003,9(5):196-205.

[14]Jayanthi S,Deng X,Bordelon M,et al.Methamphetamine causes differential regulation of pro-death and anti-death Bcl-2 genes in the mouse neocortex[J]

[15]Imahashi K,Schneider MD,Steenbergen C,et al.Transgenic expression of Bcl-2 modulates energy metabolism,prevents cytosolic acidification during ischemia,and reduces ischemiareperfusion injury[J].Circ Res,2004,1(10):734-741.

[16]Quadri SM,Segall L,Deperrot M,et al.Caspase inhibition improves ischemia-reperfusion injury after lung transplantation[J].Am J Transplant,2005,5(2):292-299.

[17]Dambrova M,Liepinsh E,Kalvinsh I.Mildronate:cardioprotective action through carnitine-lowering effect[J].Trends Cardiovasc Med,2002,12(6):275-279.

Effects of mildronate preconditioning on pulmonary expression of Bcl-2,Bax and caspase 3 in ischemia-reperfusion rats

Wang Hong1,Zhao Ming2,ShaoDonghua1
(1.Department of Anesthesiology,Af f iliated People′s Hospital,Zhenjiang,J iangsu 212002,China;2.Departmentof Anesthesiology,Af filiated Hospital,J iangsu University,Zhenjiang,J iangsu 212001,China)

ObjectiveTo investigate the effects of mildronate preconditioning on pulmonary expression of Bcl-2,Bax and caspase 3 in ischemia-reperfusion rats.MethodsA rat model of pulmonary warm ischemia-reperfusion injury was established by occlusion of the right hilus pulmonis for 45 min and then reperfused for 2 h.36 rats were randomly divided into 3 groups:group A was taken as sham operation group;group B was control group(ischemic-reperfusion injury);group C(mildronate preconditioning).The pathological changes of lung tissue were observed and pulmonary expression of Bcl-2,Bax and caspase 3 were measured using immunohistochemistry method 60 and 120 min after reperfusion.ResultsGroup B and C showed progressively aggravated injury in lung tissue with remarkable pulmonary capillary congestion,inflammatory cell infiltration,and greatly increased inflammatory exudates in alveolar cavity.Group B demonstrated more serious pathologic injury than group C(P＜0.05).Pulmonary expression of Bax and caspase 3 were higher in group B and C than group A,with group C lower than group B(P＜0.05).Pulmonary expression of Bcl-2 was higher in group B and C than group A,with group C higher than group B(P＜0.05).ConclusionMildronate preconditioning could reduce ischemia-reperfusion injury of lung by down-regulating Bax and caspase 3 expression and up-regulating Bcl-2 expression.

reperfusion injury;proto-oncogene proteins c-bcl-2;bcl-2-associated X protein;caspase 3;mildronate

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.04.007

A

1671-8348(2011)04-0331-02

2010-06-02

2010-10-23)

·論 著·