王 攀,王崇樹,魏壽江,王 城,侯華芳

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科,四川南充 637000)

順鉑誘導(dǎo)的人胃癌耐藥細(xì)胞BGC-823/CDDP的建立

王 攀,王崇樹△,魏壽江,王 城,侯華芳

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科,四川南充 637000)

目的建立人胃癌順鉑(CDDP)耐藥細(xì)胞(BGC-823/CDDP細(xì)胞)并研究其生物學(xué)特征。方法采用體外逐步增加順鉑藥物濃度反復(fù)間歇誘導(dǎo)法建立BGC-823/CDDP細(xì)胞系,并對其產(chǎn)生耐藥的特點、光鏡形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)、生長特點、細(xì)胞周期進(jìn)行研究,用四甲基偶氮唑鹽(M TT)法檢測其藥物敏感性。結(jié)果BGC-823/CDDP細(xì)胞系生物學(xué)特征較親代細(xì)胞發(fā)生了變化。BGC-823/CDDP細(xì)胞系體積較親代細(xì)胞稍大,并有巨核細(xì)胞,透射電鏡觀察細(xì)胞表面微絨毛明顯減少。BGC-823/CDDP細(xì)胞較親代細(xì)胞的倍增時間延長了4.3 h。細(xì)胞周期分布:S期細(xì)胞輕度減少;而G0/G1和G2/M期細(xì)胞較親代細(xì)胞輕度增多;與親代細(xì)胞比較,BGC-823/CDDP細(xì)胞對CDDP的耐藥倍數(shù)為11.35倍,對絲裂霉素C(MMC)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(ADM)分別為4.85、5.29、10.07倍,表明其具有交叉耐藥性。結(jié)論本實驗成功建立了BGC-823/CDDP細(xì)胞系,為下一步實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

順鉑;藥物耐受性;胃癌細(xì)胞系

胃癌是消化道常見惡性腫瘤之一,目前其5年生存率不超過30%[1],臨床上采用多藥聯(lián)合化療方案,即以最低的藥物濃度,最小的毒性反應(yīng)來達(dá)到提高臨床療效的目的,但其臨床療效不甚理想,總有效率約為40%～50%[2]。目前順鉑(CDDP)及其他鉑類制劑作為胃癌化療的常用藥物,但近年來臨床治療發(fā)現(xiàn)越來越多的患者對其耐藥而導(dǎo)致化療失敗[3]。究其根本原因可能是腫瘤細(xì)胞對化療產(chǎn)生的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)。本研究通過建立人胃癌的CDDP耐藥細(xì)胞系,研究胃癌CDDP耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特征及耐藥譜。

1 材料與方法

1.1 主要藥物與試劑 羥喜樹堿注射液(HCPT,湖北黃石飛云制藥有限公司)、CDDP(山東德州制藥有限公司)、絲裂霉素C(MMC,浙江海正藥業(yè)股份有限公司)、5-氟尿嘧啶(5-FU,湖北黃石飛云制藥有限公司)、阿霉素(ADM,湖北黃石飛云制藥有限公司)、長春新堿(VCR,湖北黃石飛云制藥有限公司)、RPM I-1640(Gibco公司)、小牛血清(成都哈里生物工程有限公司)、四甲基偶氮唑鹽(M TT,Sigma公司)等。

1.2 細(xì)胞株與細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞系BGC-823由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室提供。用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,并置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3 耐藥細(xì)胞系的建立 采用逐步增加藥物劑量的方法誘導(dǎo)[4]:細(xì)胞處于對數(shù)生長期時,加入CDDP藥液使其終濃度為0.025μ g/mL,作用48 h后,傾去含藥培養(yǎng)液,加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞生長至80%～90%匯合狀態(tài),反復(fù)按上述方法傳代,直至細(xì)胞能在含藥培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。逐步增加CDDP誘導(dǎo)濃度,歷時6個多月,最終獲得了能在0.60 μ g/mL的CDDP含藥培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長的胃癌耐藥細(xì)胞,并能反復(fù)傳代生長良好。

1.4 M TT法檢測BGC-823細(xì)胞和BGC-823/CDDP細(xì)胞的藥物敏感性 取對數(shù)生長期細(xì)胞以2.0×104/mL接種于96孔板內(nèi),每孔200 μ L。實驗設(shè)空白對照組(不含細(xì)胞)、細(xì)胞對照組(不加藥物)和藥物實驗組。藥物實驗組加入按一定比例稀釋成5種濃度的以上抗癌藥物各20 μ L,每一濃度設(shè)3個重復(fù)孔,置于37℃、CO25%及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育68 h后,加入無血清的 RPMI-1640培養(yǎng)液 200 μ L及 5 mg/mL的MTT 20 μ L,繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,加入二甲亞砜(DMSO)200微升/孔,用自動酶標(biāo)儀在570 nm處測定每孔的吸光度(A值)。每組實驗重復(fù)3次,取其平均值。根據(jù)A值計算細(xì)胞存活率,計算公式為:細(xì)胞存活率(%)=藥物實驗組A值/細(xì)胞對照組A值×100%。由藥物濃度的對數(shù)值與其線性回歸求出各藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。然后根據(jù)IC50求出耐藥指數(shù)(RI)=IC50(耐藥細(xì)胞)/IC50(親代細(xì)胞)。

1.5 細(xì)胞形態(tài)觀察 光鏡觀察:將5.0×104/mL單細(xì)胞懸液接種于內(nèi)鋪玻片24孔板中,2毫升/孔,于培養(yǎng)箱中孵育72 h后,用1∶3冰醋酸/甲醇固定細(xì)胞30 min,37℃磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗3次,采用HE染色法,中性樹膠封片,光鏡下觀察和照相。透射電鏡觀察:胰酶消化對數(shù)生長期細(xì)胞,依次加入4%戊二醛和1%四氧鋨酸固定細(xì)胞,常規(guī)電鏡制片,鈾鉛雙重染色后透射電鏡觀察、照相。

1.6 細(xì)胞生長曲線和倍增時間測定 取細(xì)胞濃度為3.0×104/mL的單細(xì)胞懸液各2 mL,分別接種于15 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi),共21瓶,從第2天起,每天記數(shù)3瓶取其平均值,共7 d。按公式計算細(xì)胞倍增時間(doubling time,TD),TD=T×log2/(logNt-LogN0)(N0為初始細(xì)胞數(shù),Nt為終末細(xì)胞數(shù),T為Nt～N0的時間)。

1.7 流式細(xì)胞儀(FCM)檢測細(xì)胞周期分布 收集1×106/mL細(xì)胞,用冰PBS液洗滌2次,70%乙醇固定過夜,將等體積的細(xì)胞懸液和碘化丙啶染液混合,將樣品放入 FCM的樣品室。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,計量資料以±s表示,組間比較采用 t檢驗,計數(shù)資料采用 χ2檢驗,以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BGC-823/CDDP細(xì)胞的建立 采用藥物濃度遞增法,歷時6個多月,藥物濃度從0.025 μ g/mL開始,最終獲得了一株能在0.60 μ g/mL的CDDP含藥培養(yǎng)液穩(wěn)定生長的胃癌耐藥細(xì)胞株,命名為BGC-823/CDDP細(xì)胞株。在耐藥誘導(dǎo)中,12周前,細(xì)胞增殖緩慢,死亡細(xì)胞較多,細(xì)胞對化療藥物的敏感性較高,藥物濃度的增加較慢;13周后,細(xì)胞增殖速度較快,藥物濃度的增幅變大,最終能在0.60 μ g/mL的CDDP含藥培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。

2.2 BGC-823細(xì)胞和BGC-823/CDDP細(xì)胞的藥物敏感性BGC-823/CDDP細(xì)胞對CDDP的耐藥指數(shù)為11.35,對MMC、5-FU、ADM有不同程度的耐藥性,HCPT、VCR無明顯耐藥性,表明BGC-823/CDDP細(xì)胞具有交叉耐藥性,見表1。

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 光鏡下BGC-823細(xì)胞呈圓梭形,細(xì)胞大小一致,細(xì)胞核呈圓形,大小一致;BGC-823/CDDP細(xì)胞大小不一致,形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞體積略大于BGC-823細(xì)胞,并出現(xiàn)核巨細(xì)胞,其細(xì)胞核有融合現(xiàn)象。透射電鏡觀察BGC-823/CDDP與BGC-823細(xì)胞相比,其細(xì)胞表面微絨毛較親代細(xì)胞明顯減少,變短,線粒體明顯腫脹,見圖 1、2。

表1 BGC-823細(xì)胞與BGC-823/CDDP細(xì)胞的藥物敏感性比較

圖1 BGC-823細(xì)胞電鏡觀察(×6 000)

圖2 BGC-823/CDDP細(xì)胞電鏡觀察(×6 000)

2.4 細(xì)胞生長曲線和倍增時間測定 BGC-823細(xì)胞和BGC-823/CDDP細(xì)胞的倍增時間分別為(45.1±2.2)h和(49.4±3.1)h,兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),二者生長曲線形態(tài)相似,BGC-823/CDDP細(xì)胞的倍增時間較BGC-823細(xì)胞輕度延長。

2.5 細(xì)胞周期分布 BGC-823細(xì)胞與BGC-823/CDDP細(xì)胞比較有一定差異,BGC-823/CDDP細(xì)胞S期細(xì)胞輕度減少(P＜0.05);而G0/G1和G2/M期細(xì)胞輕度增多(P＜0.05)。

3 討 論

對惡性腫瘤患者而言,化療是重要的綜合治療措施之一,然而腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥是治療失敗的重要原因。不同類型的腫瘤天然對許多化療藥物耐藥,此外,部分腫瘤逐漸對化療藥物產(chǎn)生獲得性耐藥[5-6],而后者為近年來研究的熱點之一,它包括典型多藥耐藥和非典型多藥耐藥兩種,前者伴隨著P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的合成,而后者由幾種不同的和一些未知的機(jī)制所介導(dǎo)[7-9]。

有研究發(fā)現(xiàn),MDR表型在體外能被暴露在高濃度的藥物中所誘導(dǎo)變化[10],體外建立耐藥細(xì)胞株的方法主要有4種,即逐漸增加藥物劑量法[4]、間歇大劑量法[11]、逐漸增加劑量與間歇大劑量相結(jié)合法[12]和細(xì)胞內(nèi)藥物注射法[13]。本實驗采用抗癌藥物CDDP與人胃癌細(xì)胞長期接觸培養(yǎng),采用逐漸增加藥物劑量的方法,成功建立了人胃癌CDDP耐藥細(xì)胞,命名為BGC-823/CDDP細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)在開始1～12周的誘導(dǎo)期間內(nèi),細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)正常,開始分裂所需時間較長;而在誘導(dǎo)超過12～25周,細(xì)胞雖然經(jīng)過更高濃度的藥物作用但其恢復(fù)至正常所需的時間逐漸縮短,產(chǎn)生該現(xiàn)象的原因可能與在耐藥誘導(dǎo)過程中腫瘤細(xì)胞的耐藥性不斷增強(qiáng)、耐藥相關(guān)基因的表達(dá)量增加有關(guān)[14-15]。真核細(xì)胞的周期有兩個基本事件:S期進(jìn)行染色體的復(fù)制,M期將復(fù)制了的染色體分配到兩個子代細(xì)胞中去。在這兩個基本事件之前,均有一段間隙期,分別為G1和G2期,不同的細(xì)胞存在著一定的差異,為此,檢測了兩種細(xì)胞的細(xì)胞周期,發(fā)現(xiàn)二者的細(xì)胞周期有一定的變化,BGC-823/DDP細(xì)胞S期細(xì)胞輕度減少,而G0/G1和G2/M期細(xì)胞輕度增加,但差別不大,表明BGC-823/CDDP細(xì)胞并沒有因為CDDP的作用而明顯抑制其生長,能夠在含CDDP的環(huán)境中長期而穩(wěn)定的生長。BGC-823細(xì)胞和BGC-823/CDDP細(xì)胞的倍增時間分別為45.1 h和49.4 h,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),其他研究者也得出了類似的結(jié)論[16]。

MTT法是近年來實驗研究以及臨床上廣泛采用的體外藥敏試驗方法,本實驗采用M TT法檢測了BGC-823細(xì)胞和BGC-823/CDDP細(xì)胞的藥物敏感性,發(fā)現(xiàn)二者對藥物的敏感性存在較大的差異,BGC-823/CDDP細(xì)胞對 CDDP、MMC、5-FU、ADM 的耐藥性分別為 BGC-823細(xì)胞的11.35、4.85、5.29、10.07倍,表明其具有交叉耐藥性,即具有MDR表型,可用于下一步實驗研究。

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Establishment of cistplatin-resistant BGC-823/CDDP cells

Wang Pan,Wang Chongshu△,Wei Shoujiang,Wang Chen,Hou Huafang
(Department of General Surgical,the A f filiated Hospital,North Sichuan Medical College,Nanchong,Sichuan 637000,China)

ObjectiveTo establish a cisplatin-resistant cell line from human gastric cancer cell,and study its biological characteristics.MethodsA cisplatin-resistant human gastric cancer cell line(BGC-823/CDDP)was induced by continuously exposing and gradually increasing dose of cisplatin,and the morphological feature,ultrastructure and growth characteristics were examined.The cell cycle distribution of the two cell lines was determined by flow cytometry(FCM).The drug sensitivity was measured by M TT assay.ResultsThe biological properties of BGC-823/CDDP cell line had changed compared with the parent BGC-823 cell,and the volume of BGC-823/CDDP cells with macronucleus cells was slightly larger than that of the latter.Under transmission electronmicroscopy,the microvillus of BGC-823/CDDP cells significantly decreased.The population double time was 4.3 h longer than the parental cell line BGC-823.Compared with BGC-823 cells,BGC-823/CDDP cells had faintly lower fraction of cell cycle distribution in S phase and higher in G0/G1and G2/M phase.By M TT assay,the resistance index of BGC-823/CDDP cells to cisplatin was 11.35 and it also showed cross-resistance to mitomycin C(MMC),5-fluorouracil(5-FU)and adriamycin(ADM),the resistance indexes were 4.85,5.29 and 10.07,respectively.ConclusionBGC-823/CDDP is established.It can be used for further experiments.

cisplatin;drug resistance;gastric cancer cell line

10.3969/j.issn.1671-8348.2011.04.004

A

1671-8348(2011)04-0323-03

△通訊作者,Tel:15328899583;E-mail:chongs-wang@163.com。

2010-03-18

2010-08-09)

·醫(yī)學(xué)教育·