湯細(xì)彪，劉峰，諶磊，喻紅艷，尚書,滿小營，陳楚雄，吳斌

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病診斷中心，湖北武漢 430070）

偽狂犬?。≒seudorabies, PR）是危害全球養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的急性傳染病之一。豬偽狂犬病的臨床癥狀主要表現(xiàn)在：（1）母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎；（2）公豬感染睪丸腫脹、萎縮，失去種用能力；（3）新生仔豬的死亡，仔豬的頑固性腹瀉，保育豬呼吸系統(tǒng)綜合癥；（4）育肥豬呼吸困難，生長(zhǎng)延緩。該病在豬群中常呈暴發(fā)性流行，影響各個(gè)階段的豬群的生產(chǎn)性能。我國自1948年劉永純首次報(bào)道該病以來，迄今已有近20多個(gè)省、市（區(qū)）相繼報(bào)道發(fā)生該病，對(duì)我國的養(yǎng)豬業(yè)，尤其是集約化養(yǎng)豬帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。疫苗免疫接種是預(yù)防控制與消滅豬偽狂犬病的根本措施，全球已有許多國家用不同方法培育了不少偽狂犬病弱毒株，這些疫苗在控制和凈化本國偽狂犬病中起到了非常重要的作用，本文將對(duì)我國最早研發(fā)、具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的豬偽狂犬病活疫苗(HB-98株)的分子特性及應(yīng)用效果進(jìn)行介紹。

一、豬偽狂犬活疫苗(HB-98株）的研發(fā)背景

偽狂犬病最早是由匈牙利的Aujeszky博士于1902年發(fā)現(xiàn)。我國首次報(bào)道該病是在1948年。20世紀(jì)80年代以后關(guān)于本病發(fā)生的病例數(shù)逐年增多，至20世紀(jì)90年代蔓延至20多個(gè)省市，在各個(gè)省份均出現(xiàn)暴發(fā)性流行（豬場(chǎng)的偽狂犬陽性率高達(dá)80%）。給全國的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。正是在這樣的背景下，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室在全國范圍內(nèi)開展了豬偽狂犬病毒的分離和疫苗研發(fā)工作，并率先在我國流產(chǎn)母豬子宮內(nèi)膜炎分泌物中分離鑒定出偽狂犬野毒，并命名為鄂A株，隨后以鄂A株為種毒，應(yīng)用分子基因工程技術(shù)、反復(fù)篩選、大量臨床試驗(yàn)，研制出具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的豬偽狂犬活疫苗HB-98株（TK-/gG-/gE-三基因缺失疫苗株）。

二、偽狂犬病毒基因工程疫苗(HB-98株)的分子特性

（一）安全的偽狂犬病毒基因工程疫苗須缺失TK基因作為弱毒活疫苗首先必須是安全的。歐盟提出的偽狂犬病疫苗安全性的要求包括：無局部和全身性反應(yīng)；不擴(kuò)散到非免疫豬；不能通過精液和胎盤傳播；致弱必須是徹底的不返強(qiáng)。

胸苷激酶(TK)基因位于UL區(qū)，功能為催化脫氧胸苷磷酸化。TK基因是皰疹病毒的一個(gè)主要毒力基因。TK基因的失活大大地降低了病毒毒力而不影響病毒在組織培養(yǎng)中的增殖，該基因?qū)τ诓《驹谥袠猩窠?jīng)系統(tǒng)中的復(fù)制起著主要作用。因此安全的偽狂犬病基因工程疫苗須缺失TK基因。而且通過基因工程手段完全缺失TK基因的疫苗毒株在臨床應(yīng)用中不會(huì)出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象。相反，通過自然致弱的毒株沒有缺失TK基因，如Bartha K-61株在使用過程中就曾出現(xiàn)過疫苗毒株和野毒重組后發(fā)生毒力返強(qiáng)的現(xiàn)象。

（二）偽狂犬病毒gG基因的缺失可激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生非特異性細(xì)胞免疫 偽狂犬病毒編碼的gG(gX)蛋白是一種趨化因子結(jié)合蛋白，gG蛋白通過結(jié)合趨化因子使趨化因子不能發(fā)揮功能，導(dǎo)致機(jī)體不易或難以識(shí)別侵入的病毒。缺失gG基因可以大幅提高疫苗激起的細(xì)胞免疫。gG基因缺失的疫苗毒株感染動(dòng)物后，可提升了非特異性細(xì)胞免疫，進(jìn)而游離的趨化因子濃度較未缺失gG基因的野毒株要高，起到快速清除野毒的能力。同時(shí)，gG基因的缺失可以進(jìn)一步提高活疫苗的安全性。Peeters(1993)證明僅單獨(dú)缺失gE或TK基因的毒株經(jīng)鼻腔免疫后可從接種豬傳播至同群飼養(yǎng)的非免疫豬；但TK-/gG-/gE-三基因缺失株在非免疫豬群中則不會(huì)傳播。所以TK-/gG-/gE-三基因缺失毒株具有更高的安全性。

（三）gE基因的缺失可應(yīng)用于偽狂犬病毒的臨床鑒別診斷與疫病凈化 gE糖蛋白對(duì)病毒在神經(jīng)系統(tǒng)中包括三叉神經(jīng)節(jié)和嗅神經(jīng)的擴(kuò)散中發(fā)揮重要作用，但不是PRV生長(zhǎng)所必需。所以，gE基因缺失可以進(jìn)一步提高疫苗的安全性。gE-PRV毒株免疫的豬血清中，不產(chǎn)生針對(duì)gE糖蛋白抗原表位的抗體，而自然感染野毒株后，則可產(chǎn)生抗gE表位的抗體，因此通過檢測(cè)針對(duì)gE蛋白的抗體水平可以區(qū)分gE-PRV疫苗免疫豬和野毒自然感染豬，是監(jiān)測(cè)PR免疫接種和根除PR最常用的工具。

表1 偽狂犬病活疫苗HB-98株與Bartha株的區(qū)別

（四）HB-98株與其它偽狂犬疫苗毒株的分子差異性分析 豬偽狂犬病活疫苗HB-98株與國外的偽狂犬病活疫苗的主要區(qū)別體現(xiàn)在疫苗毒株的遺傳背景、基因改造技術(shù)、免疫原性和安全性上。首先，國外傳統(tǒng)疫苗主要使用的Bartha K-61株和Bucharest株，這兩株病毒均分離自歐洲，與我國的流行毒株在遺傳背景上相差較大。其次，這些毒株是通過在雞胚上自然盲傳獲得的，缺失主要毒力基因的目標(biāo)性不強(qiáng)，隨意性較大，且并沒有缺失TK基因，存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。再次， gG基因沒有缺失，不能有效的產(chǎn)生非特異性細(xì)胞免疫。其主要分子差異見表1。

三、HB-98株可產(chǎn)生α和β干擾素，具有廣譜抗病毒作用

干擾素具有廣譜的抗病毒作用。機(jī)體在早期的病毒感染期間，干擾素即可控制病毒的生長(zhǎng)和增殖。同時(shí)干擾素一方面可直接激活免疫細(xì)胞，另一方面可間接抑制病毒的復(fù)制過程。除此之外，干擾素還可以活化自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并且也會(huì)在機(jī)體內(nèi)顯示出有效的T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞佐劑的作用。

偽狂犬病毒編碼的gG蛋白是一種趨化因子結(jié)合蛋白，由于gG蛋白與機(jī)體本身的趨化因子結(jié)合，使趨化因子不能發(fā)揮功能，導(dǎo)致機(jī)體不易或難以識(shí)別侵入的病毒。所以缺失了gG基因的HB-98活疫苗能迅速激發(fā)細(xì)胞免疫，產(chǎn)生大量的α和β干擾素（圖1,圖2），從而達(dá)到對(duì)病毒性疾病的治療效果。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的臨床實(shí)踐證實(shí)，HB-98激起的非特異性細(xì)胞免疫對(duì)仔豬腹瀉有很好的防控效果。

四、偽狂犬病毒基因工程疫苗(HB-98株）的臨床應(yīng)用

豬偽狂犬病活疫苗HB-98株構(gòu)建于1998年。經(jīng)過8年實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)，于2006年獲得國家新獸藥注冊(cè)證書和生產(chǎn)許可證。在8年的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)期間， HB-98株表現(xiàn)出穩(wěn)定性高、針對(duì)性強(qiáng)、安全性好、免疫原性強(qiáng)等特點(diǎn)。