張傳清，張雅，朱祝軍

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安，311300；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）

4種果蔬種子帶菌的種類及其抗藥性

張傳清1，張雅2，朱祝軍1

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安，311300；2.杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）

采用離體平皿法對(duì)西瓜、黃瓜、番茄和茄子4種果蔬種子進(jìn)行了帶菌檢測(cè)，并測(cè)定了檢測(cè)到的主要真菌種類對(duì)常見殺菌劑的抗藥性。結(jié)果表明，西瓜種子表面攜帶的優(yōu)勢(shì)菌群為根霉（Rhizopusspp.）和青霉（Penicilliumspp.），黃瓜為青霉和曲霉 （Aspergillusspp.），番茄和茄子為毛霉（Mucorspp.）和絲核菌（Rhizoctoniaspp.）；4種種子內(nèi)部寄藏的真菌都主要為青霉和根霉?？顾幮詸z測(cè)結(jié)果表明，4種果蔬種子對(duì)苯并咪唑類殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，而對(duì)福美雙和咯菌腈無抗藥性。

種子帶菌；種子處理；殺菌劑；抗藥性

西瓜、黃瓜、番茄和茄子都是重要的蔬菜作物，近年來因病害等導(dǎo)致的連作障礙問題日益突出。種子處理是控制果蔬種苗病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，而科學(xué)的種子處理技術(shù)是建立在對(duì)種子的帶菌種類、藥劑敏感性及種苗期主要種傳和土傳病害發(fā)生情況研究的基礎(chǔ)之上的[1，2]。目前關(guān)于番茄和茄子帶菌的報(bào)道很少，大多集中于西瓜和黃瓜帶菌的研究。如印度主栽西瓜品種種子帶的真菌種類主要為絲核菌（Rhizoctoniaspp.）和鐮刀菌（Fusariumspp.）[3]，李健強(qiáng)等[1]報(bào)道的新疆地區(qū)西瓜種子傳帶的主要真菌種類為青霉（Penicilliumspp.）和根霉（Rhizopusspp.）。同時(shí)，國內(nèi)有關(guān)種子病理學(xué)的研究主要由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)等北方機(jī)構(gòu)完成[4，5]，其研究采用的品種基本為北方的主栽品種。另外，很多植物病菌已經(jīng)對(duì)多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性[6]，而這類藥劑在種子處理中也已經(jīng)使用很長(zhǎng)時(shí)間，卻沒有見到有關(guān)植物種子對(duì)其抗藥性的研究。因此，本研究主要對(duì)我國東部西瓜、黃瓜、番茄和茄子品種種子進(jìn)行帶菌檢測(cè)，并測(cè)定檢測(cè)到的真菌對(duì)常見種子處理藥劑的敏感性，以期為科學(xué)的種子處理技術(shù)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為黃瓜種子中農(nóng)8號(hào)、津研4號(hào)和漢瑪；番茄種子合作903、浙雜809和以色列180；茄子種子杭茄3號(hào)、杭豐1號(hào)和達(dá)拉斯；西瓜種子豐樂5號(hào)、西農(nóng)8號(hào)和領(lǐng)先168，均購自市場(chǎng)。

供試殺菌劑為98%多菌靈（Carbendazim）、97%福美雙（Thiram）和95%咯菌腈（Fludioxonil），原藥均由農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所提供。除多菌靈用0.1 mol/L HCl溶解，其余均用丙酮溶解，配制成10 mg/mL的母液備用。

1.2 試驗(yàn)方法

①種子外部帶菌檢測(cè) 每個(gè)品種隨機(jī)選取200粒種子，放入50 mL錐形瓶中，加入20 mL無菌水充分振蕩，吸取懸浮液5 mL，以4 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min，棄上清液，再加入1 mL無菌水充分振蕩、浮載后吸取100 μL加到直徑為9 cm的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板上涂勻，放入25℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)3～7 d后觀察，記錄種子外部帶菌種類和分離比例[4，5，7]。每個(gè)處理5次重復(fù)，相同操作條件下設(shè)無菌水為空白對(duì)照（CK）。

②種子內(nèi)部帶菌檢測(cè) 將每個(gè)品種的黃瓜種子在5%NaClO溶液中浸泡3 min，用無菌水沖洗3遍，取100粒種子剖開種殼和種仁，于1%NaClO溶液中浸泡1 min，用無菌水沖洗3遍。將同一品種的整粒種子、種殼和種仁分別均勻擺放在直徑為9 cm的PDA平板上，每皿擺放10～20?；?0～20個(gè)組織塊，在25℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)3～7 d后,檢查記錄帶菌情況、不同部位的真菌種類和分離頻率[4，5]，每個(gè)處理5次重復(fù)。

③種子帶菌鑒定 將分離到的真菌分別進(jìn)行純化、鏡檢和轉(zhuǎn)管保存。根據(jù)真菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參考工具書進(jìn)行鑒定[8，9]。

④對(duì)殺菌劑的抗藥性檢測(cè) 隨機(jī)從各品種種子分離得到的各類真菌中每類取20個(gè)左右菌株，對(duì)于檢測(cè)到總菌株數(shù)少于20個(gè)的，則測(cè)定所有菌株。將各菌株先在PDA平板上培養(yǎng)5 d活化，然后在同一圓周上制取菌絲塊（直徑0.5 cm），轉(zhuǎn)移到含不同濃度供試藥劑的PDA平板中央，25℃培養(yǎng)3～ 5 d后觀察生長(zhǎng)情況。各平板上最終所含有機(jī)溶劑濃度均小于1.0%，以不含藥劑者為對(duì)照（CK），每處理重復(fù)3次。對(duì)于多菌靈，不能在含5 mg/L多菌靈的平板上生長(zhǎng)的為敏感菌株，能在含100 mg/L多菌靈的平板上生長(zhǎng)的為高水平抗性菌株。對(duì)于福美雙和咯菌腈，根據(jù)各處理的菌落直徑（cm），取平均值計(jì)算抑制率（%），通過濃度對(duì)數(shù)值（X）和抑制率幾率值 （Y）之間的線性回歸關(guān)系求出毒力回歸方程和EC50值。根據(jù)EC50值來確定是否已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性[10]。

抑制率 （%）=[（CK菌落直徑-處理菌落直徑）/（CK菌落直徑-0.5）]×100%。

表1 4種果蔬種子外部攜帶的真菌種類及分離比例

表2 4種果蔬種子內(nèi)部攜帶的真菌種類及其分離比例

表3 4種果蔬種子攜帶的真菌對(duì)多菌靈的抗藥性頻率 %

2 結(jié)果與分析

2.1 種子外部帶菌種類及比例

黃瓜、番茄、茄子和西瓜4種果蔬種子外部平均帶菌率分別為17.2%，33.63%，32.9%和39.9%。不同作物間帶菌種類情況有明顯差異，黃瓜為青霉和曲霉，番茄和茄子為毛霉和絲核菌，西瓜種子表面攜帶的優(yōu)勢(shì)菌群為根霉和青霉。同一作物不同品種間帶菌的種類和比例也有明顯差異（表1）。

2.2 種子內(nèi)部帶菌種類及其比例

黃瓜、番茄、茄子和西瓜4種果蔬種子內(nèi)部帶菌率顯著低于外部，平均帶菌率分別只有3.4%， 11.2%，1.6%和14.6%，且所帶的真菌的種類要少，優(yōu)勢(shì)帶菌種類均為青霉和根霉（表2）。

2.3 種子帶菌的抗藥性檢測(cè)結(jié)果

各個(gè)品種中分離得到的各類真菌對(duì)福美雙和咯菌腈都沒有產(chǎn)生抗藥性，仍然屬于敏感菌株的范疇；對(duì)苯并咪唑類殺菌劑如多菌靈已經(jīng)產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。其中4種果蔬12個(gè)品種的種子中分離得到的青霉、曲霉、根霉和毛霉對(duì)多菌靈的抗藥性頻率均為100%；鏈孢霉的抗藥性頻率在0～100%，平均為56.6%，絲核菌的抗藥性頻率在12.5～100%，平均為91.3%，其他菌的抗藥性頻率在50%～100%，平均為90%（表3）。

3 小結(jié)與討論

研究了4種果蔬12個(gè)品種種子的帶菌情況，結(jié)果表明，各品種種子內(nèi)部的帶菌率比外部低，內(nèi)部攜帶的真菌種類要少，且品種間的差異小，所有品種種子內(nèi)部寄藏的真菌都主要為青霉和根霉，這與前人[4，5]有關(guān)黃瓜和西瓜不同品種種子帶菌的研究結(jié)果類似。而種子外部的帶菌種類和比例在作物和品種間都有明顯的差異，西瓜種子表面攜帶的優(yōu)勢(shì)菌群為根霉和青霉、黃瓜為青霉和曲霉、番茄和茄子為毛霉和絲核菌。這意味著進(jìn)行種子處理時(shí)，一定要對(duì)擬處理種子的帶菌情況進(jìn)行研究，才能有針對(duì)性地處理并獲得較好的效果。

除了帶菌的種類和比例，所帶菌對(duì)藥劑的敏感性也是影響種子處理效果的主要因素之一。殺菌劑抗藥性是指本來對(duì)藥劑敏感的野生型植物病原物個(gè)體或群體，由于遺傳變異而對(duì)藥劑出現(xiàn)敏感性下降的現(xiàn)象。國內(nèi)在種子處理時(shí)選用的藥劑比較單一，非常容易導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生，但國內(nèi)外還沒有相關(guān)的報(bào)道。本研究表明，供試的所有品種上分離得到的青霉、曲霉、根霉和毛霉對(duì)多菌靈的抗藥性頻率均為100%，鏈孢霉等其他類型真菌對(duì)其抗藥性頻率也在56.6%以上。這說明對(duì)多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性已經(jīng)非常嚴(yán)重，在實(shí)踐中應(yīng)該慎用，而所有檢測(cè)到的真菌都沒有對(duì)福美雙和咯菌腈產(chǎn)生抗藥性，在生產(chǎn)上可以繼續(xù)選用。

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Isolation and Preliminary Identification of Seed-borne Fungi of Four Fruits or Vegetables and their Resistance to Fungicides

ZHANG Chuanqing1,ZHANG Ya2,ZHU Zhujun1
(1.College of Agriculture and Food Science,Zhejiang Agriculture and Forestry University,Lin'an,Zhejiang 311300; 2.Hangzhou Academy of Agricultural Sciences)

Seed-borne fungi of four seeds were tested by the method of petri dish,and their resistance to fungicides was detected.The results showed that the predominant fungi on the surface of watermelon were rhizopus and penicillium.For cucumber seeds,they were penicillium and aspergillus.For tomato and eggplants seeds,they were mucor and rhizoctonia. Moreover,serious resistance has developed to benzimidazole fungicides in isolated fungi of all tested seeds.However, these detected seed-borne fungi were still very sensitive to thiram and fludioxonil.

Seed-borne fungi;Seed treatment;Fungicide;Resistance

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.04.020

浙江省科技廳重大專項(xiàng)“環(huán)境友好型蔬菜種子處理關(guān)鍵技術(shù)的研究與示范”（2008C12003-2）

張傳清（1976-），男，博士，副教授，主要從事植物病害治理及殺菌劑藥理學(xué)與抗藥性研究，電話：0571-63742089，E-mail：cqzhang9603@yahoo.com.cn

2010-08-17