王聯(lián)德， 王雪芹

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室， 福建 福州 350002)

茶蚜Toxopteraaurantii又名桔二叉蚜、茶二叉蚜、可可蚜，屬同翅目蚜科，是茶樹上的一種重要害蟲，在我國各茶區(qū)每年均有不同程度發(fā)生。它主要為害茶樹的嫩芽、嫩葉和嫩梢,一般集中在1芽3葉上，吸汁為害。茶樹受害嚴(yán)重時，嫩梢芽葉萎縮卷曲，生長停止。受害芽葉制成的干茶色暗、湯濁且?guī)任叮?、香、味均極低劣，嚴(yán)重影響茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。目前,對蚜蟲的防治主要是運(yùn)用化學(xué)殺蟲劑，既殺傷了天敵，又污染了環(huán)境，農(nóng)藥殘留也影響茶葉的品質(zhì)，成為我國茶葉貿(mào)易和出口的重要障礙[2]。因此發(fā)展以生物防治為主要內(nèi)容的茶葉無公害生產(chǎn)，從源頭上控制農(nóng)殘，是提高茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵。

蠟蚧輪枝菌Lecanicillium(Verticillium)lecanii是蚜蟲類、蚧類、螨類和粉虱的重要病原真菌, 除寄生同翅目害蟲的重要種類外，還可寄生螨類、薊馬和線蟲等。作為微生物殺蟲劑，已被多個國家應(yīng)用于蚜蟲、煙粉虱和溫室白粉虱的防治[1，3-6]。近幾年國內(nèi)也有一些利用蠟蚧輪枝菌防治溫室害蟲如白粉虱、煙粉虱、蚜蟲和粉蚧的研究[5-6]。本研究用4株蠟蚧輪枝菌接種茶蚜，觀察茶蚜實(shí)驗種群染病流行情況，用Gompertz模型比較了4株蠟蚧輪枝菌對茶蚜的侵染流行速率。

1 材料與方法

1.1 孢子懸浮液的制備

4株蠟蚧輪枝菌株(V07、V08、V23和V27)，保存于福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,均由安徽岳西的感病鱗翅目蛹蟲體分離純化而得。菌株在低溫(3 ℃)黑暗條件下保存于薩氏培養(yǎng)基(去除葡萄糖成分)上，并定期轉(zhuǎn)接，試驗前經(jīng)蚜蟲復(fù)壯。供試培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基(PSA)。將復(fù)壯后的4株菌株分別接種于Φ9 cm的PSA培養(yǎng)基上，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，前3 d無光照條件培養(yǎng)以利于孢子萌發(fā)和菌絲生長，后4 d以L∶D(14∶10)光照培養(yǎng)以促進(jìn)分生孢子的形成；然后轉(zhuǎn)接于250 mL液體PSA培養(yǎng)基中，置于搖床(120 r·min-1)培養(yǎng)7 d;添加0.03%吐溫-80濕潤劑于培養(yǎng)液，在振蕩器上振蕩5 min。以血球計數(shù)板檢測分生孢子濃度。將各菌株配制成2×107孢子·mL-1的懸浮液(作為母液)；用含0.03%吐溫-80濕潤劑的蒸餾水分別將母液稀釋至2×103、2×104、2×105、2×106孢子·mL-14種濃度。在測定時另取少量懸浮液涂在含0.05%氯霉素的PSA培養(yǎng)基薄層上，28 ℃下培養(yǎng)24 h后，在光學(xué)顯微鏡40倍目鏡下鏡檢孢子萌發(fā)率。

1.2 供試蚜蟲

茶蚜種群為福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)茶園的茶樹(未施農(nóng)藥)上自然發(fā)生的蚜蟲，在室內(nèi)盆栽茶樹苗上飼養(yǎng)數(shù)代。挑選健康無翅成蚜，用軟毫的細(xì)毛筆挑取轉(zhuǎn)入蚜蟲飼養(yǎng)盒中。蚜蟲飼養(yǎng)盒制作參照文獻(xiàn)[7]的方法，將剛配制的1.5 mL 2%瓊脂溶液倒入培養(yǎng)皿(Φ3.5 cm，深1 cm)中，用打孔器將新鮮茶樹葉片制備成圓葉片，當(dāng)小皿中的瓊脂溶液呈半凝固狀態(tài)時，將茶葉圓片正表面平貼于瓊脂溶液表面，并將葉圓片邊緣浸沒在瓊脂溶液中以防止葉片水分過快流失，并將培養(yǎng)皿蓋蓋好。

1.3 試驗方法

將濾紙(Φ8 cm)平鋪于布氏漏斗(Φ8 cm)內(nèi)，漏斗下置一100 mL燒杯；另取Φ18 cm濾紙剪成帶柄扇形，用軟毫細(xì)毛筆將茶樹葉片上健壯的無翅成蚜轉(zhuǎn)于剪好的扇形濾紙上，每個處理轉(zhuǎn)移50頭茶蚜。取20 mL接種液(對照以0.03%吐溫-80溶液代替分生孢子懸浮液)沿扇形濾紙扇柄處迅速倒出，將在扇面的茶蚜浸于懸浮液中3 s；迅速將扇形濾紙?zhí)崞鹌椒庞谖埳希⒉际下┒返撞课埳蟼€別茶蚜用毛筆尖小心移到吸水紙上，將茶蚜體表多余的懸浮液吸去；將處理后的能爬動的茶蚜移入蚜蟲飼養(yǎng)盒；將蚜蟲飼養(yǎng)盒放入培養(yǎng)箱(24 ℃),并使飼養(yǎng)盒相對濕度(RH)為100%。每日定時觀察蚜蟲發(fā)病情況，并將仔蚜蟲清除出飼養(yǎng)盒，連續(xù)觀察8 d。設(shè)每株菌株每個接種濃度為1個處理，每個處理有50頭無翅成蚜。每個處理設(shè)置3個重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

參照植物病害發(fā)病分級標(biāo)準(zhǔn)[8]，對蠟蚧輪枝菌侵染茶蚜情況進(jìn)行分級(鏡檢)。0級：未見蟲體表面長有菌絲。1級：可見蟲體表面長有菌絲，較稀疏。2級：明顯可見菌絲體在蟲體的部分器官(如頭、胸、腹末端、足)長出，但分生孢子尚未產(chǎn)生，或者個別開始出現(xiàn)。3級：蟲體表面長滿了菌絲體，大量分生孢子出現(xiàn)。蟲生真菌侵染昆蟲的發(fā)病指數(shù)公式表示如下：

(1)

由式(1)得出如下蠟蚧輪枝菌侵染茶蚜的發(fā)病指數(shù)公式：

Y=(1x+2y+3z)/(3x+3y+3z+3s)

(2)

式中，Y為發(fā)病指數(shù)，x為1級感染的蚜蟲數(shù)，y為2級感染的蚜蟲數(shù)，z為3級感染的蚜蟲數(shù)，s為0級感染的蚜蟲數(shù)。

各處理茶蚜的累計病情指數(shù)(Y)隨時間(t)的變化，采用改進(jìn)的Gompertz模型進(jìn)行擬合[9]:

Y=Kexp〔(-Bexp(-Rt)〕

(3)

式中，K、B和R為待估參數(shù)，其中K表示特定寄主—病原—環(huán)境系統(tǒng)中的病情指數(shù)上限；B僅為位置參數(shù)；R為表觀侵染速率，指在單位時間內(nèi)新增病害數(shù)量與原有病害數(shù)量的比率，是流行速度的表達(dá)方式之一。以上數(shù)據(jù)分析、運(yùn)算均采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件[10]。

2 結(jié)果與分析

孢子萌發(fā)鏡檢結(jié)果表明，蠟蚧輪枝菌4個菌株5個濃度的分生孢子萌發(fā)率均在98%以上，可用于生物測定。用Gompertz模型模擬4株蠟蚧輪枝菌不同接種量(孢子對數(shù)濃度)對茶蚜的侵染動態(tài)趨勢，擬合結(jié)果(表1)表明，各處理累計發(fā)病模型的決定系數(shù)(r2)﹥0.7，模型經(jīng)卡方檢驗達(dá)到極顯著水平，表明用該模型擬合茶蚜發(fā)病指數(shù)的效果很好。

表1隨時間變化的累計病情指數(shù)擬合Compertz模型的參數(shù)估計1)

Table 1 Estimates of parameters from fitting the infection-caused cumulative disease indices of Toxoptera aurantii colonies to Compertz model

通過Gompertz模型擬合各處理蠟蚧輪枝菌對茶蚜的侵染過程，獲得侵染速率R值。從圖1可以看出，4株菌株對茶蚜的侵染速率與初始接種濃度對數(shù)值均呈線性相關(guān)，侵染速率隨著初始接種濃度的升高而增大，斜率分別為0.112、0.108、0.015和0.086。

A.菌株V07，F(xiàn)1，4=36.15，p =0.009，r2=0.923；B.菌株 V08，F(xiàn)1，4=21.4，p =0.019，r2=0.877；C.菌株V23，F(xiàn)1，4=17.9，p =0.024，r2=0.857；D.菌株V27，F(xiàn)1，4=11.69，p =0.042，r2=0.796。圖1 蠟蚧輪枝菌各初始接種濃度對數(shù)值與侵染速率R的關(guān)系Figure 1 The regression of the parameters R from fitting of Gompertz model against the logarithm transformed initial inoculating dose of L.lecanii

3 討論

蠟蚧輪枝菌是寄主范圍和地理分布均十分廣泛的昆蟲病原真菌，不同寄主和地理來源的菌株不僅分生孢子大小形狀有差異，萌發(fā)速率也有差異，對昆蟲的侵染致病力也有差異[11]。本試驗比較4株蠟蚧輪枝菌對茶蚜成蟲的侵染，發(fā)現(xiàn)V07、V23為侵染作用較強(qiáng)的菌株，初始接種劑量相同時，V07侵染速率最大。這可能與不同蠟蚧輪枝菌菌株的生物學(xué)特性，如孢子萌發(fā)速率、產(chǎn)孢量等的差異有關(guān)[12]。

初始接種劑量影響著蠟蚧輪枝菌對茶蚜的侵染流行速率。在初始接種劑量高的種群中，蠟蚧輪枝菌侵染茶蚜的流行速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于初始接種劑量低的種群。這與必須有適當(dāng)?shù)逆咦訑?shù)目才能引起病害流行的觀點(diǎn)相符[8]。因此，利用蠟蚧輪枝菌侵染蚜蟲使得蚜蟲種群出現(xiàn)流行病，除了要具備潮濕條件外，還必須有數(shù)量較高的初始侵染源。本試驗以較高的初始接種劑量，在較短時間內(nèi)形成數(shù)量較大的分生孢子和菌絲體，縮短達(dá)到流行高峰的時間，以克服因蠟蚧輪枝菌流行時間長及高濕(至少10-12 h相對濕度達(dá)到85%-100%[13])誘發(fā)植物病害的問題[14]。在茶園，梅雨季節(jié)的潮濕條件或夜間露水的短時間濕潤將有利于蠟蚧輪枝菌孢子萌發(fā)，引起蠟蚧輪枝菌在茶蚜種群中流行。

本研究引入植物病害流行學(xué)中描述植物病害嚴(yán)重程度的等級及植物病害流行學(xué)Gompertz模型，以此描述蠟蚧輪枝菌在茶蚜實(shí)驗種群中的流行動態(tài)，更加簡捷地評估了蠟蚧輪枝菌對茶蚜實(shí)驗種群的控制效果。

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