丁桂生

(浙江省麗水市縉云縣林學(xué)會林業(yè)建設(shè)工程項目研究與實施中心,浙江 縉云 321400)

紅豆杉屬(Taxus)植物是一類古老的植物類群,全世界有11種,廣泛分布于歐洲、北美洲及東亞等北半球地區(qū),我國有 3種2變種,即東北紅豆杉(T.cuspidata)、喜馬拉雅密葉紅豆杉(T.funana)、喜馬拉雅紅豆杉(T.wallichiana)和 2變種紅豆杉(T.wallichiana var.chinensis)、南方紅豆杉(T.wallichianavar.mairei)[1]。紅豆杉屬植物集藥用、材用和觀賞等于一體,開發(fā)利用價值極高,尤其自20世紀(jì)70年代從短葉紅豆杉(T.brevi folia)樹皮中提取紫杉醇(taxol)以來,該屬植物倍受人們重視,但這給紅豆杉屬野生資源帶來了毀滅性的破壞,使其處于瀕危狀態(tài)。為保護(hù)紅豆杉屬自然資源免遭絕滅,許多國家已明令禁止采伐,紅豆杉屬植物及其制品的國際貿(mào)易受到嚴(yán)格控制。為實現(xiàn)紅豆杉屬植物的有效保護(hù)和利用,各國皆加強(qiáng)了遺傳多樣性等研究,以制定科學(xué)的遺傳保育策略。

南方紅豆杉是中國紅豆杉屬植物中分布最為廣泛的一個種,自然分布于亞熱帶各省區(qū)。南方紅豆杉材質(zhì)優(yōu)異,是高檔珍貴用材,其紫杉醇含量雖稍低于喜馬拉雅紅豆杉等,但因早期速生、生物收獲量大、適宜短周期作業(yè)而具有巨大的藥用開發(fā)利用價值。通過多年的研究,我國已突破了南方紅豆杉短周期藥用林培育的技術(shù)關(guān)鍵,實現(xiàn)了栽植 2～3年就能收獲利用的目標(biāo)。通過10省區(qū)27個產(chǎn)地的苗期地理種源試驗,揭示了南方紅豆杉苗木生長的種源變異規(guī)律[2]。南方紅豆杉屬國家一級保護(hù)瀕危樹種,但有關(guān)致瀕機(jī)制和遺傳多樣性等相關(guān)研究較少。周其興等[3]利用等位酶技術(shù)研究了廣西、湖南和貴州3個自然種群及同屬其他植物的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)我國紅豆杉屬植物的遺傳多樣性水平較高,國產(chǎn)的3種1變種的遺傳一致度較高。張宏意等[4]基于RAPD分子標(biāo)記對廣東、湖南和江西較小分布區(qū)12個自然種群的遺傳多樣性進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)地域相距較遠(yuǎn)種群間的遺傳分化較大,粵北種群的遺傳多樣性較低。本文在南方紅豆杉全分布區(qū)地理種源試驗的基礎(chǔ)上[2],選擇10個省區(qū)15個代表性種源,利用ISSR分子標(biāo)記研究南方紅豆杉整個分布區(qū)種源的遺傳多樣性及地理變化、種源遺傳分化等,從而為科學(xué)制定南方紅豆杉遺傳保育策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物樣品采集

試驗葉樣取自浙江省淳安縣富溪林場圃地的南方紅豆杉種源試驗2年生留床苗。取樣種源來自10個省區(qū)的15個代表性種源,包括安徽黃山,浙江龍泉,福建武夷山、明溪、武平,江西廬山、井岡山,湖南桑植、綏寧,湖北恩施,貴州黎平、都勻,四川峨眉,廣西三江,云南石屏。南方紅豆杉種源試驗的采種林分皆為當(dāng)?shù)仄鹪吹奶烊涣?除福建武平和武夷山等較小種群外,要求在采種天然林分中選擇20株以上優(yōu)良母樹采種,母樹間距50m以上,每株母樹等量采種、混合處理后作為該種源的種子,每個種源提供種子2.5kg。參試種源基本情況和苗期遺傳測定等詳見參考文獻(xiàn)[2]。2007年7月中旬,從上述15個種源中每種源隨機(jī)選取20株單株,分別采集其頂端新發(fā)枝條上的新鮮嫩葉,將其放入裝有生物冰袋的保溫箱中帶回實驗室,置于-20℃冰箱中保存。

1.2 基因組DNA提取

每株取0.5g新鮮嫩葉,采用改良CTAB法提取基因組DNA[5],提取的DNA溶于1×TE緩沖液中,用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量,并在紫外分光光度計(日本島津UV-2401PC)下檢測其濃度,最后稀釋至40ng/μ L,放入-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-100TM基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行。所用引物為加拿大哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的第9套ISSR引物,從50個ISSR引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的8個引物對所有供試植株的DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系20μ L,包括:Taq酶 1.00U 、dNTP0.20mmol/L、MgCl21.0mmo1/L、引物0.3μ mol/L、基因組 DNA80ng。PCR 反應(yīng)程序為:94℃4min;94℃45s,44～58℃45s(引物退火溫度隨引物的堿基含量變化略作調(diào)整,見表1),72℃1.5min,35個循環(huán);72℃延伸5min,16℃下保存。PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離,對照標(biāo)準(zhǔn)分子量DGL 2000 DNA Marker(北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司),再經(jīng)Gel Red熒光染料染色,最后利用復(fù)日FR-200紫外與可見光分析成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。圖1給出了引物UBC841的ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物在部分南方紅豆杉種源植株樣品中的分離情況。

圖2 引物UBC841的ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物在南方紅豆杉部分植株中的分離

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

ISSR為顯性標(biāo)記,同一引物擴(kuò)增產(chǎn)物中電泳遷移率一致的條帶被認(rèn)為具有同源性。電泳圖譜中的每一條帶視為一個標(biāo)記,并代表一個引物的結(jié)合位點。按照相同遷移位置上擴(kuò)增條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計,有帶的記為“1”,無帶的記為“0”,僅記錄清晰且長度在 150～2000bp范圍的擴(kuò)增帶,建立0/1數(shù)據(jù)矩陣,計算每個引物的多態(tài)性百分?jǐn)?shù)和多態(tài)性信息含量。應(yīng)用POPGENE軟件(Version 1.3.1)計算各種源的多態(tài)位點百分率(PPL)和Shannon信息多樣性指數(shù)(I)、Nei＇s基因多樣度指數(shù)(HE)[6]、物種水平基因多樣性(HT)、種源內(nèi)基因多樣性(HS)、基因分化系數(shù)(GST)和基因流(Nm);用GenAlEx6對種源間和種源內(nèi)分子遺傳變異進(jìn)行AMOVA分析[7];用POPGENE軟件計算種源間Nei＇s[8]遺傳距離和Jaccard遺傳相似系數(shù),據(jù)此對15個種源進(jìn)行UPGMA聚類分析,繪制種源的親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種源遺傳多樣性及地理變化

利用8個ISSR引物對15個南方紅豆杉種源共300個個體進(jìn)行PCR擴(kuò)增,共檢測到90個位點,其中89個位點呈現(xiàn)多態(tài)性,多態(tài)性位點百分率(PPL)為98.89%(表1),說明南方紅豆杉物種水平上的遺傳多樣性豐富。每條引物擴(kuò)增出的位點數(shù)在8～15個不等,平均為11.1個,條帶片斷大小介于150～2000bp間。8條引物的多態(tài)性信息含量變化在 0.8510～0.9187,平均為0.8919。

表1 用于檢測南方紅豆杉種源遺傳多樣性的ISSR弓I物及其擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性①

統(tǒng)計結(jié)果表明,15個南方紅豆杉種源遺傳多樣性都處在較高水平。多態(tài)位點百分率(PPL)變化在80.00%～93.33%,平均為 88.52%;Nei＇s基因多樣性變化在0.3393～0.3873,平均為0.3685;Shannon信息指數(shù)(I)變化在 0.4926～0.5615,平均0.5333(表2)。然而比較發(fā)現(xiàn),不同南方紅豆杉種源的遺傳多樣性還存在較大差異,安徽黃山,福建武夷山、武平,江西廬山和井岡山5個來自偏東和偏北部的種源遺傳多樣性高,HE和I分別大于0.38和0.55;而貴州黎平、廣西三江和云南石屏3個來自偏西和偏南部的種源遺傳多樣性低,HE和I分別低于或接近于0.35和0.50;偏東和偏北部的5個種源較偏西和偏南部3個種源的HE和I的平均值提高了12.49%和12.29%。種源平均水平的各遺傳多樣性參數(shù)PPL為 88.52%,HE為0.3685,I為0.5333;物種水平各遺傳參數(shù)PPL為98.89%,HE為0.4192,I為0.6063。

表2 15個南方紅豆杉試驗種源的遺傳多樣性①

從南方紅豆杉不同種源Shannon信息指數(shù)(I)隨產(chǎn)地經(jīng)緯度變化的三維離散分布圖(圖2)中可以清楚地看出,遺傳多樣性高的種源多分布在E 109°～120°、N26°～31°范圍內(nèi),包括安徽黃山、浙江龍泉等9個種源,其I平均值為0.5507,較其他6個偏西和偏南種源的I均值(0.5072)高出8.58%。構(gòu)建了南方紅豆杉種源,與產(chǎn)地經(jīng)度(X1)和緯度(X2)的回歸方程I=0.29343-0.00104X1X2+0.0004+0.00218,其決定系數(shù)R2值為0.816,達(dá)極顯著水平。偏回歸系數(shù)的F值檢驗結(jié)果表明,產(chǎn)地經(jīng)度和緯度交互項及緯度平方項在回歸方程中作甩顯著,意味著南方紅豆杉種源遺傳多樣性是受其產(chǎn)地經(jīng)度和緯度非線性共同影響。南方紅豆杉自然分布區(qū)的偏東和偏北地區(qū)其天然林資源較多,種源遺傳多樣性較高,推測該區(qū)域可能是南方紅豆杉的分布中心。偏南和偏西地區(qū)的南方紅豆杉種源遺傳多樣性較低,也與現(xiàn)有天然林種群破壞嚴(yán)重有關(guān)[4]。

圖3 15個南方紅豆極試驗種源Shannon信息指數(shù)(I)隨產(chǎn)地經(jīng)緯度的地理變化

2.2 種源間遺傳分化和基因流

POPGENE分析表明南方紅豆杉總的種源基因多樣性為0.4192,種源內(nèi)基因多樣性為0.3685,種源間基因多樣性為0.0507,基因分化系數(shù)0.1211,基因流很大,達(dá)3.6277。

表3 15個南方紅豆杉試驗種源的AMOVA分析

AMOVA分析結(jié)果(表3)顯示,南方紅豆杉種源間的遺傳變異較小,而種源內(nèi)遺傳變異顯著(P＜0.001)。種源間遺傳變異占總變異的8.75%,種源內(nèi)變異占91.25%,與利用POPGENE軟件分析獲得的結(jié)果基本一致。

2.3 種源間遺傳距離和UPGMA聚類

通過估算15個南方紅豆杉種源間的遺傳距離,并據(jù)此使用UPMGA聚類法得出樹形圖(圖3)。結(jié)果表明,15個南方紅豆杉種源間遺傳相似指數(shù)較大,介于0.861～0.959(表4),意味著南方紅豆杉種源間遺傳差異不顯著。從聚類圖中可以看到,除福建武平和武夷山2個種源外,其他13個種源可明顯地按地域聚為2組,一組包括安徽黃山、浙江龍泉、湖南綏寧、湖北恩施、江西井岡山和湖南桑植6個來自南方紅豆杉自然分布區(qū)偏東或偏北的種源,其中安徽黃山與浙江龍泉,湖南綏寧與湖北恩施,江西井岡山與湖南桑植種源的遺傳一致性較大,分子相似指數(shù)分別為0.954、0.957和0.945;另一組包括貴州黎平、云南石屏、都勻、江西廬山、福建明溪、廣西三江和四川峨眉等7個來自偏南或偏西的種源,其中貴州黎平、都勻和云南石屏種源間的遺傳距離最近,分子相似指數(shù)皆大于0.955。福建武平和武夷山2個原產(chǎn)地種群都較小的種源雖然都維持了較高的遺傳多樣性,但與上述2組種源間的遺傳距離都相對較遠(yuǎn),另單獨聚成2組。

圖4 15個南方紅豆極試驗種源Nei＇s(1972)遺傳距離的UPGMA聚類圖

表4 15個南方紅豆杉試驗種源間的Jaccard相似指數(shù)

續(xù)表4

3 結(jié)論與討論

本文對南方紅豆杉15個種源的遺傳多樣性研究結(jié)果表明,種源平均多態(tài)性位點為0.885,說明南方紅豆杉種源的遺傳多樣性非常豐富,總的基因多樣性為0.4192,這不僅顯著地高于Nybom[9]所統(tǒng)計的多種植物種群水平的遺傳多樣性(基于RAPD和ISSR等顯性標(biāo)記)平均值(HE=0.22),而且也明顯地高于具有與南方紅豆杉相似分布區(qū)的我國珍稀瀕危樹種三尖杉(Cephalotaxus fortunei)(HE=0.3377)[10]。試驗的15個種源皆維持了較高水平的遺傳多樣性,平均Nei＇s基因多樣性(HE)為0.3685,福建武平和武夷山2個東部種源雖然種群較小,但其Nei＇s基因多樣性(HE)仍分別高達(dá)0.3873和0.3845,這說明南方紅豆杉瀕危的原因不是由于其遺傳多樣性的喪失,而是與其生境要求嚴(yán)格、天然更新能力弱以及對其過度采伐利用等有關(guān)。南方紅豆杉維持較高水平的遺傳多樣性,應(yīng)與其呈群狀廣域性分布、風(fēng)媒異花授粉、壽命長而世代重疊等特性有關(guān)。

南方紅豆杉屬我國一級珍稀瀕危保護(hù)樹種,雖然種源間的生長和形態(tài)差異顯著[2],但在DNA水平上種源間遺傳距離較近,基因分化系數(shù)為 0.1211,有8.75%的遺傳變異存在于種源間,而種源內(nèi)的變異占總變異的91.25%。與三尖杉等我國亞熱帶地區(qū)的其他珍稀瀕危樹種比較,南方紅豆杉種源間遺傳分化較小,這不僅與各種源維持較高水平的遺傳多樣性有關(guān),而且與其傳粉和種子傳播能力強(qiáng)及現(xiàn)有保留種群片斷化時間短等有關(guān)[10]。南方紅豆杉現(xiàn)有保留種群一般都較大,多呈集群分布,與三尖杉種群小且呈星散分布等不同[10],這些保留種群皆是在原有大量天然林資源過度采伐利用后保留下來的古樹群,樹齡皆在百年甚至千年以上。南方紅豆杉為風(fēng)媒異花授粉樹種,傳粉能力強(qiáng),其種子具有紅色帶甜味的肉質(zhì)假種皮,可借助鳥及鼠類的吞食而得以遠(yuǎn)距離傳播,原有種群間的基因交流頻繁,加之現(xiàn)有保留種群片斷化的時間較短,未發(fā)生嚴(yán)重的遺傳分化。

南方紅豆杉不同種源雖然遺傳多樣性都較高,遺傳距離較近,但仍存在明顯的地理變異模式?；赨PMGA聚類結(jié)果,除個別較小種群的種源外,南方紅豆杉種源可大致按地域聚為2組。偏東和偏北部的種源聚為一組,其遺傳多樣性普遍較高;偏南和偏西部的種源聚為另一組,其遺傳多樣性普遍較低。從南方紅豆杉野生資源分布情況來看,中東部地區(qū)的野生資源量多,分布廣,種群大,而偏南和偏西地區(qū)的野生資源量少,分布較零星,種群較小,這應(yīng)是偏東和偏北部種源遺傳多樣性高而偏南和偏西部種源遺傳多樣性低的重要原因之一。張宏意等[4]對于廣東、湖南和江西較小分布區(qū)12個南方紅豆杉自然種群遺傳多樣性的研究結(jié)果也證實了這一點,來自偏南地區(qū)也即來自粵北的種群遺傳多樣性較低。南方紅豆杉自然分布區(qū)之中東部地區(qū)的種源遺傳多樣性較高,應(yīng)優(yōu)先加強(qiáng)這些地區(qū)南方紅豆杉自然資源,尤其是較大自然保留種群的保護(hù)和優(yōu)良種質(zhì)的開發(fā)利用。

[1] Fu L,Mill R R.Taxaceae[M].Flora of China,1999,4:89-96.

[2] 焦月玲,周志春,余能健,等.南方紅豆杉苗木性狀種源分化和育苗環(huán)境影響[J].林業(yè)科學(xué)研究,2007,20(3):363-369.

[3] 周其興,葛頌,顧志建,等.中國紅豆杉屬及其近緣植物的遺傳變異和親緣關(guān)系分析[J].植物分類學(xué)報,1998,36(4):323-332.

[4] 張宏意,陳月琴,廖文波.南方紅豆杉不同居群遺傳多樣性的RAPD研究[J].西北植物學(xué)報,2003,23(11):1994-1997.

[5] Doyle J J,D0yle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf material[J].Phytochem Bull,1987,19;11-15.

[6] Nei M.Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].Proc Natl Acad Sci USA,1973,70:3321-3323.

[7] Peakall R.Smouse P E.GenAlEx 6:genetic analysis in Excel.Population genetic software for teaching and research[J].M olecular Ecology Notes,2006,6:288-295.

[8] Nei M.Genetic distance between populations[J].Amer Naturalist,1972,106:283-292.

[9] Nybom H.Comparison of different nuclear DNA markers forestimatingintraspecific genetic diversity in plants[J].Molecular Ecology,2004,13:1143-1155.

[10] 李因剛,周志春,金國慶.三尖杉種源遺傳多樣性[J].林業(yè)科學(xué),2008,44(2):64-69.