李燾，屈新運，王喆之

(陜西師范大學(xué)藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，陜西西安710062)

植物多酚是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的酚類化合物，主要存在于植物的皮、根、莖、葉及果中，在自然界中的儲量十分豐富［1］。大量的研究結(jié)果表明，植物多酚具有清除自由基、抗脂質(zhì)氧化、延緩衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、抗輻射等多種生物活性，人體攝入一定量的植物多酚可以有效地預(yù)防和控制某些疾病的發(fā)生［2－3］。菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.為十字花科Cruciferae菘藍(lán)屬Isatis的二年生草本植物，全國各地廣泛栽種;其根、葉均供藥用，分別稱為板藍(lán)根和大青葉［4］。目前，對于板藍(lán)根、大青葉的植物化學(xué)及抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗菌等生物活性方面的研究工作開展的較多［5］，而對于菘藍(lán)種子的植物化學(xué)特性及相關(guān)活性的研究鮮見報道。

本研究在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交試驗設(shè)計對菘藍(lán)種子中總多酚超聲提取的條件進(jìn)行了優(yōu)化，并以DPPH法評價其抗氧化活性，為揭示菘藍(lán)種子的藥用價值和菘藍(lán)藥材資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與材料

實驗材料:購自陜西地道中藥材種植有限公司。經(jīng)“藥用資源與天然藥物化學(xué)”教育部重點實驗室王炳利教授鑒定為十字花科Cruciferae菘藍(lán)屬Isatis植物菘藍(lán)Isatis indigotica Fort.的干燥種子。沒食子酸(純度≥98%)、福林酚、DPPH等購自Sigma公司，甲醇、石油醚、無水碳酸鈉等均為國產(chǎn)分析純。

實驗儀器:FW－400A高速萬能粉碎機(jī)(北京科偉公司);UNICAM－UV300型分光光度計(美國熱電公司);HH－1B型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司);Q－BKYY31－2000型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠);BT1245型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);SHB－III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);MILLIPORE超純水儀(密理博中國有限公司);索氏提取裝置;KQ－600DB型超聲清洗器(40.0 kHz，600W，昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 菘藍(lán)種子的脫脂預(yù)處理將充分干燥的菘藍(lán)種子粉碎，過40目篩，取適量置于索氏提取器中，以石油醚為溶劑，80℃熱回流處理8 h。脫脂后的種子粉末烘干至恒重，備用。

1.2.2 單因素試驗分別選取料液比、甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時間等四個因素，以總多酚含量為評價指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗，考察不同因素對總多酚含量的影響，并確定各因素的適宜水平。各因素在不同水平變化時，均以料液比1∶15，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，提取溫度40℃和提取時間30 min為固定條件。單因素試驗水平設(shè)置詳見表1。

表1 單因素試驗因素水平Tab.1 Factors and levels in the one-factor experiment

1.2.3 L9(34)正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，每個因素分別選取三個水平，設(shè)置四因素三水平L9(34)正交試驗，同樣以總多酚含量為評價指標(biāo)，考察各因素在總多酚提取過程中的交互作用，確定最佳提取工藝。正交試驗各因素水平設(shè)置詳見表2。

表2 正交試驗因素水平Tab.2 Factors and levels in the orthogonal test

1.2.4 提取方法分別準(zhǔn)確稱取5.00 g脫脂種子粉末，依照單因素和正交試驗設(shè)置的不同條件進(jìn)行總多酚的超聲提取，過濾，真空濃縮，得總多酚提取物，并以相應(yīng)濃度甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量;分別精密吸取1 mL置于25 mL量瓶中，同質(zhì)量分?jǐn)?shù)甲醇稀釋至刻度，作為供試溶液。

1.2.5 總多酚含量的測定參照文獻(xiàn)［6－7］描述的Folin－Ceocalteu法測定總多酚，結(jié)果以每克提取物中含有相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)表示。精密稱取沒食子酸對照品10.15 mg，加甲醇溶解并定容至5 mL，得質(zhì)量濃度為2.03 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于5 mL棕色量瓶中，補(bǔ)足體積。從上述各量瓶中分別吸取0.5 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液，依次加入2.5 mL Folin－Ceocalteu試液和2.0 mL 75 g/L Na2CO3溶液，總反應(yīng)體系為5 mL。將此混合液于50℃水浴5 min，在760 nm波長下測定吸光值。以吸光值對濃度進(jìn)行線性回歸分析，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度(X，mg/mL)與吸光值Y之間的回歸方程為:Y=1.893 305X－0.119 67，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。沒食子酸質(zhì)量濃度在0.04～0.15 mg/mL之間與吸光值具有良好的線性關(guān)系。同法測定各樣品的吸光值，依照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)質(zhì)量濃度，并依照下式計算樣品中總多酚的含量(W，mg/g):

總多酚W=(C·V·n)/m

式中，W為總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g);C為菘藍(lán)種子中總多酚質(zhì)量濃度(mg/mL);V為體積(mL)，n為稀釋倍數(shù);m為菘藍(lán)種子粉末質(zhì)量(g)。

1.2.6 DPPH法測總多酚的抗氧化活性采用DPPH法評價菘藍(lán)種子總多酚的抗氧化活性。參照文獻(xiàn)［8，9］的方法，配制濃度為1×10－4mol/L的DPPH·甲醇溶液。取最優(yōu)工藝條件提取的總多酚提取液2.0 mL，加入2.0 mL DPPH·甲醇溶液，搖勻，室溫靜置30 min，以提取溶劑調(diào)零，517 nm處測定吸光值，記為As;同法取2.0 mL提取溶劑，加入2.0 mL DPPH·甲醇溶液，混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，測吸光值，記為A0;取2.0 mL總多酚提取液，加入2.0 mL提取溶劑，混勻，待反應(yīng)穩(wěn)定后，測吸光值，記為Ar。每個濃度平行測3次，取平均值。以BHT作陽性對照，依照上述方法測定，并按照下式計算菘藍(lán)種子總多酚和BHT對DPPH·的清除率(Y，%):

Y(%)=(1－(As－Ar)/A0)×100%

式中，As表示樣品與DPPH·作用后的吸光值;Ar表示樣品自身的吸光值;A0表示DPPH·的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件對菘藍(lán)種子總多酚提取效率的影響

2.1.1 料液比對總多酚提取效率的影響不同料液比對總多酚的提取效率存在一定的影響。由圖1可以看出，料液比在1∶10到1∶25之間，隨著料液比的增加，總多酚的提取效率不斷增大;而當(dāng)料液比超過1∶25以后，總多酚含量的增加趨于平緩，并略有下降。在超聲提取過程中使用的溶劑量越大，所產(chǎn)生的傳質(zhì)動力也越大，從而能夠更大效率地使多酚類化合物充分溶解在提取溶劑中。然而，由于溶劑量的增大，在產(chǎn)生相同熱量的前提下，提取溫度相對較低，從而使得提取效率由于固液兩相存在的吸附平衡而降低［10］。不同料液比對總多酚提取效率的影響作用表現(xiàn)為隨著料液比的增加，提取效率在一定范圍內(nèi)不斷增大;而當(dāng)提取效率增大到一定水平時，增加料液比將不再提高提取效率。因此，綜合考慮經(jīng)濟(jì)因素和實驗結(jié)果，將正交試驗中的料液比確定為1∶10、1∶20和1∶30三個水平。

圖1 料液比對總多酚提取率的影響Fig.1 The effects of solid-liquid ratio on the contents of total polyphones

2.1.2 甲醇濃度對總多酚提取效率的影響提取溶劑濃度不同，總多酚的提取效率也存在差異。從圖2可以看出，隨著甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨之升高。當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%時，提取的總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.76 mg/g，而當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升至80%時，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到5.89 mg/g。但當(dāng)甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于80%以后，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始出現(xiàn)明顯下降的趨勢，至甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%時，總多酚降至4.24 mg/g。綜合考慮，正交試驗的甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)水平確定為40%、60%和80%。

圖2 甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總多酚提取率的影響Fig.2 The effects of methanol concentration on the contents of total polyphones

2.1.3 提取溫度對總多酚提取效率的影響不同溫度對總多酚提取效率的影響結(jié)果見圖3。從圖3可以看出，溫度在30～70℃之間，隨著提取溫度的升高，總多酚從2.66 mg/g升高到7.39 mg/g，呈現(xiàn)不斷升高的趨勢。而當(dāng)溫度高于80℃以后，總多酚提取效率明顯下降，最低下降至5.21 mg/g。隨著溫度的升高，總多酚在甲醇中的溶解度也隨之升高;但當(dāng)溫度升高至一定水平，甲醇開始逐漸揮發(fā)，總多酚在甲醇中的溶解受到一定的影響，總多酚量開始下降。因此，綜合考慮溫度對總多酚提取效率的影響，正交試驗的提取溫度水平確定為50、60和70℃。

圖3 提取溫度對總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.3 The effects of extraction temperature on the contents of total polyphones

2.1.4 提取時間對總多酚提取效率的影響從圖4可以看出，提取時間不同，總多酚的提取效率不盡相同。隨著提取時間的延長，總多酚的量不斷升高，當(dāng)提取時間達(dá)到50 min時，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高達(dá)到7.39 mg/g;而當(dāng)提取時間繼續(xù)延長時，總多酚含量開始下降，60 min時，總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.21 mg/g，較最高值下降了18.8%。此外，提取時間過長，酚類物質(zhì)容易被氧化，不利于總多酚的提取，因此，綜合考慮提取時間對總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響，正交試驗的提取時間確定為20、40和60 min 3個水平。

圖4 提取時間對總多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.4 The effects of extraction time on the contents of total polyphones

2.2 菘藍(lán)種子總多酚提取的正交實驗結(jié)果在單因素實驗的基礎(chǔ)上，分別確定了影響總多酚提取效率各因素的合理水平，擬定四因素三水平的L9(34)正交設(shè)計方案進(jìn)行菘藍(lán)種子總多酚的提取。以總多酚含量為考察指標(biāo)，分析各因素的交互作用，確定最佳工藝參數(shù)，正交試驗以及方差分析結(jié)果詳見表3和表4。

從表的極差分析可知，菘藍(lán)種子總多酚提取過程中各因素的最佳組合水平為:A1B2C1D2，即料液比1∶10，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，提取溫度50℃，提取時間40 min。各因素對總多酚提取效率的影響作用大小依次為:B＞C＞D＞A。

通過直觀分析發(fā)現(xiàn)，對菘藍(lán)種子總多酚提取率影響最小的因素是料液比，故以料液比為誤差進(jìn)行方差分析，所得結(jié)果見表4。從表4可以看出，對菘藍(lán)種子總多酚提取率具有較顯著影響的因素是甲醇濃度(P＜0.05)。

表3 正交實驗結(jié)果分析(n=3)Tab.3 Results and analysis for orthogonal experiment

表4 方差分析Tab.4 Variance analysis

在上述最佳提取工藝條件下，進(jìn)行3次重復(fù)實驗，菘藍(lán)種子總多酚得率如表5所示，其平均為(8.92±0.03)mg/g。因此，經(jīng)過正交試驗篩選得到的最佳提取工藝條件具有可操作性，且重復(fù)性好，適用于菘藍(lán)種子總多酚的提取。

表5 驗證試驗結(jié)果Tab.5 Results of validation experiment

2.3 菘藍(lán)種子總多酚的抗氧化活性評價用于樣品抗氧化活性評價的方法很多［11－12］，而DPPH·清除實驗以其操作簡單，耗時短等特點而成為當(dāng)前廣泛應(yīng)用的方法之一。本實驗以菘藍(lán)種子總多酚提取物清除DPPH·的能力作為抗氧化活性評價指標(biāo)，并以BHT為陽性對照，考察不同質(zhì)量濃度總多酚提取物(0.003～1.000 μg/mL)對DPPH·的清除活性，測定結(jié)果見表6。從表6可以看出，菘藍(lán)種子總多酚提取物對DPPH·具有一定的清除能力，且清除能力與質(zhì)量濃度之間存在一定的量效關(guān)系;隨著

表6 菘藍(lán)種子總多酚提取物與BHT對DPPH·清除作用的比較(n=3)Tab.6 Comparisons on capacity of DPPH·scavenging between total polyphones extracts and BHT

總多酚質(zhì)量濃度的不斷升高，其對DPPH·的清除能力也不斷增大;當(dāng)總多酚提取物的質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH·的清除率可以達(dá)到92.00%，與BHT的清除效率基本相當(dāng)。因此，菘藍(lán)種子總多酚提取物具有一定的抗氧化活性，可以作為天然的抗氧化劑予以適當(dāng)?shù)拈_發(fā)利用。

3 結(jié)論

本實驗采用超聲提取技術(shù)制備菘藍(lán)種子總多酚，同時考察料液比、甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、提取溫度以及提取時間等四個因素對總多酚提取效率的影響，并最終確定其最佳提取工藝條件為:料液比1∶10，甲醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%，提取溫度50℃，提取時間40 min。在此工藝條件下，菘藍(lán)種子總多酚得率為(8.92±0.03)mg/g?？寡趸钚栽u價實驗結(jié)果表明，菘藍(lán)種子總多酚具有一定的清除DPPH·能力，且當(dāng)總多酚質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL時，其清除活性與人工抗氧化劑BHT基本相當(dāng)，具有作為天然抗氧化劑開發(fā)利用的潛力。本研究工作為進(jìn)一步揭示菘藍(lán)種子的化學(xué)成分及生物學(xué)活性奠定了基礎(chǔ)，同時也為菘藍(lán)藥材資源的合理開發(fā)利用提供了一定的實驗依據(jù)。

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